Таблица 18

Выход гидролизатов менее 50% в случае использования первых двух ферментных комплексов можно объяснить тем, что при гидролизе хитинолитическим комплексом S.kurssanovii из-за высокой СДА (89%) и,

следовательно, лучшей растворимости при рН 5-6 возможны ощутимые потери низкомолекулярных фракций (

Для получения водорастворимого при нейтральных значениях рН низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса целесообразно использовать ферментный комплекс S.kurssanovii, но он является менее доступным по сравнению с Целловиридином, коммерческим препаратом, разрешенным к использованию в качестве кормовой добавки к рационам сельскохозяйственных животных. Нами была проведена дальнейшая оптимизация условий гидролиза для получения низкомолекулярного водорастворимого ХзМК (рН 7,0).

Использование фермента папаина менее целесообразно, так как этот фермент существенно дороже Целловиридина и получение хитозанов с заданными свойствами потребует значительного увеличения количества фермента.

Оптимизация ферментативного гидролиза под действием препарата Целловиридин Г20х

Цель данного эксперимента - определение оптимальных параметров гидролиза высокомолекулярного хитозан-меланинового комплекса с получением низкомолекулярного полимера, олигомеров или мономеров. Как известно, снижение молекулярной массы хитозана способствует не только лучшей растворимости полимера в растворах рН 4-6, но также и в нейтральных растворах (рН 7,0), что обусловливает расширение областей применения данного полисахарида, где в основном требуются растворимые формы. Также ММ влияет на другие физико-химические показатели и

биологические свойства. К примеру, высокомолекулярные полимеры используются в косметике в качестве гелеобразующего средства; полимеры со средней ММ - в сельском хозяйстве как средства защиты растений, плодов

и овощей от вредителей и порчи; N-ацетилглюкозоамин и олигомеры - в

медицине при лечении остеопороза и артрита [3].

Для выбора оптимальных параметров ферментативного гидролиза пчелиного хитозана мы проводили процесс в различных условиях и определяли температурно-временные параметры и интервал рН, ориентируясь на определение количества восстанавливающих Сахаров.

Определение оптимального значения рН

Величина рН является одним из основных параметров, от которого зависит не только действие фермента, но также и свойства полимера. Как известно, константа диссоциации хитозана варьирует от 6,3 до 6,5, выше этих значений аминогруппы полимера депротонированны и хитозан осаждается в виде крупных хлопьев. Поэтому данный эксперимент ограничен значениями рН ниже 6,5.

Гидролиз 1% раствора хитозана в 0,2 М Na-ацетатном буфере проводили под действием ферментного комплекса на основе штамма T.viride с фермент-субстратным соотношением 1/100 при температуре 55°С в течение 1 ч и в интервале значений рН от 3,0 до 6,5. Влияние рН на количество восстанавливающих Сахаров при гидролизе хитозана представлено на рисунке 11.

Из полученных результатов следует, что изменение рН процесса гидролиза с 3,0 до 5,0 приводило к резкому скачку в образовании количества восстанавливающих Сахаров (приблизительно в 20 раз). При дальнейшем увеличении рН (до 5,5) количество АГА повышалось уже незначительно, а при рН 6,0 процесс гидролиза замедлялся, что связано с ухудшением

растворимости исходного хитозан-меланинового комплекса, и, как результат, протеканием процесса в гетерогенной среде.

Таким образом, в качестве оптимального значения рН мы предлагаем значение 5,5. Использование рН ниже 5,5 приводит лишь к частичному гидролизу хитозана и, как следствие, увеличению молекулярной массы и вязкости. Повышение рН выше 5,5 не целесообразно, так как ведет к ухудшению растворимости образца. Это в свою очередь значительно влияет на выход и свойства продукта.

Определение оптимальной температуры гидролиза

Ферментативный гидролиз 1% раствора хитозана в 0,2 М Na-ацетатном буфере осуществляли при рН 5,5 с ферментно-субстратным соотношением 1/100 в течение 1ч и в интервале температур от 25 до 75°С. Влияние температуры на количество восстанавливающих Сахаров при гидролизе хитозана показано на рисунке 12.

700 -I 600 -I 500 -

О) О

1 200 -s100 -0 -

Рис. 12. Влияние температуры гидролиза на образование восстанавливающих Сахаров (АГА)

Постепенное повышение температуры процесса способствовало равномерному увеличению количества восстанавливающих Сахаров. Проведение гидролиза при 55 и 60°С привело к образованию максимального их количества (значение возросло в 6 раз). Резкое снижение количества восстанавливающих Сахаров, скорее всего, объясняется инактивацией некоторых ферментов препарате в выбранном интервале времени.

Следовательно, оптимальным интервалом температур при гидролизе хитозан-меланиновго комплекса с использованием ферментативного комплекса T.viride является 55-60°С. При использовании температуры ниже 55°С гидролиз ХзМК проходит неполностью, что сказывается на увеличении вязкости, молекулярной массы и ухудшении растворимости полимера при рН 6-7. Использование повышенных температур приводит к инактивации фермента и ухудшению процесса гидролиза.

Определение оптимальной продолжительности гидролиза

Ферментативный гидролиз 1% раствора хитозана в 0,2 М Na-ацетатном буфере выполняли при температуре 55°С, рН 5,5 с фермент-субстратным соотношением 1/100 в интервале продолжительности от 0,25 до 24 ч. Влияние продолжительности на количество восстанавливающих Сахаров при гидролизе хитозан-меланинового комплекса приведено на рисунке 13.

1400 -| СО I 1200 - го птоз 1000 -

ш "2 600 - с о о г 400 - S 200 - 0 Ч 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время, ч

Рис. 13. Влияние времени гидролиза на количество образующихся

восстанавливающих Сахаров

Как видно из рисунка 13, увеличение продолжительности процесса вызывало повышение выхода продукта в выбранном интервале времени. Гидролиз в течение 4 часов приводил к возрастанию количества восстанавливающих Сахаров приблизительно в 4 раза. Дальнейшее увеличение времени от 4 до 24 часов лишь незначительно влияло на рост восстанавливающих Сахаров (1,5 раза).

Таким образом, повышение продолжительности процесса в 6 раз несущественно влияет на выход АГА, увеличивая его на 30%, но при этом требует больших и необоснованных затрат электроэнергии и занятости оборудования, что также сильно увеличивает общую продолжительность

всей технологии переработки и удорожает процесс производства. Поэтому мы остановились на интервале времени гидролиза хитозан-меланинового комплекса препаратом Целловиридином 4-6 ч.

Определение оптимального фермент-субстратного соотношения в

процессе гидролиза

Ферментативный гидролиз 1% раствора хитозана в 0,2 М Na-ацетатном буфере выполняли при температуре 55°С, рН 5,5 в течение 4 ч и с фермент субстратным соотношением в пределах 1/100 - 1/1000. Влияние ФСС на количество восстанавливающих Сахаров при гидролизе хитозан-меланинового комплекса и характеристики полученных продуктов показано на рисунке 14.

1400 - 1200 - я X го п 1000 - о

ш J 600 - с о 5 400 - s 200 -

-I 1 1 1 1

1/100 1/250 1/500 1/750 1/1000

фермент-субстратное соотношение

Рис. 14. Влияние фермент-субстратного соотношения на количество образовавшихся восстанавливающих Сахаров

Из результатов, изображенных на рис. 14, определенно следует, чем меньше фермент-субстратное соотношение, тем хуже протекал гидролиз, и тем меньше образовывалось восстанавливающих Сахаров.

Выбор оптимальных значений ФСС зависит от конкретно поставленной задачи, о чем свидетельствуют результаты, представленные в таблице 19.

Таблица 19

Характеристика хитозан-меланинового комплекса

ФСС Выход, % СДА, % Ь\]> дл/г ММ, кДа Исходный ХзМК - 89 4,4 460 1/1000 58 91 1,0 84 1/750 50 90 0,8 66 1/500 47 90 0,6 48 1/250 35 75 0,25 19 1/100 19 65 0,17 12

Если необходимо получить низкомолекулярный ХзМК растворимый при нейтральных значениях рН, то целесообразно использовать соотношение 1/100. Но следует обратить внимание на значение СДА, которое составляло всего 65%, что, вероятно, объясняется интенсивным протеканием гидролиза, и как следствие, образованием большого количества олигосахаридов и мономеров, которые теряются в процессе выделения при диализе. Это подтверждал низкий выход продукта, составляющий лишь 19%. Аналогичная картина имела место при использовании ФСС 1/250 с незначительным увеличением выхода ХМК, СДА и ММ. Увеличение фермент-субстратного соотношения в 2 раза (1/500) незначительно сказывалось на выходе продукта, но приводило к резкому увеличению СДА на 15%, а ММ на 60%. Дальнейшее увеличение ФСС до 1/1000 обусловливало получение хитозан-меланинового комплекса с выходом более 50% и СДА выше 90%, но при этом молекулярная масса возрастала в 2 раза. Это определяло его растворение лишь в кислых водных растворах (рН 4-6), что сильно ограничивает дальнейшее применение.

Таким образом, на наш взгляд, имеет смысл остановиться на промежуточном фермент-субстратном соотношении 1/250 - 1/500.

В этих случаях гидролиз протекал более равномерно (на 90-96%), мы попадаем в диапазон СДА 75-90% и ММ 19-48 кДа. Получаемые образцы также хорошо растворимы при рН 6,0-7,0.

Оптимизируя процесс ферментативного гидролиза мы определили основные условия его проведения: рН - 5,5-6,0; температура - 55-60°С; продолжительность - 4-6 ч; фермент-субстратное соотношение - 1/250-1/500.

Использование данных параметров позволяет получить низкомолекулярный хитозан в виде порошка светло-кремового цвета, растворимый в нейтральных значениях рН. Выход полимера при данных условиях составлял 70-75%, СДА - 90%, и ММ 20-50 кДа.

Ферментативный гидролиз хитин-меланинового комплекса

Нами также был осуществлен гидролиз ХМК после стадии депротеинирования и крабового хитина для сравнения с целью получения мономеров N-ацетилглюкозоамина, который находит широкое применение в медицине, например, для лечения остеоартрита [141]. Гидролиз кристаллического и регенированного хитина проводили препаратом Целловиридин Г20х. Эффективность гидролиза оценивали по накоплению восстанавливающих Сахаров.

Определение количества восстанавливающих Сахаров, показало, что больше всего их получалось из регенерированного хитина (рис. 15). Это объясняется тем, что при переосаждении происходило разрыхление структуры, приводящее к большей доступности аморфных участков, более предпочтительных для действия гидролаз. Причем максимальное количество восстанавливающих Сахаров образовывалось через 7 и 6 дней для крабового и пчелиного, соответственно, далее значение оставалось неизменным.

В случае кристаллических хитинов максимальное значение восстанавливающих Сахаров достигалось для крабового через 2 сут., пчелиного - 6 сут., в течение которых происходил гидролиз имеющихся аморфных участков. Далее процесс не протекал и большая часть субстрата (85% по сухому остатку) оставалась негидрализованной, что подтвержалось повторным гидролизом того же самого субстрата новой порцией ферментного препарата. Полученные результаты позволяют предположить, что образцы пчелиного хитина имеют меньшую кристалличность по сравнению с образцами крабового, возможно, благодаря присутствию меланина. После окончания гидролиза для выделения АГА использовали ультрафильтрацию, с помощью которой отделяли все высокомолекулярные

(> 10 кДа) примеси, а полученный фильтрат концентрировали в вакууме. В случае гидролиза крабового хитина чистота полученного АГА достигала 95%, в то время как гидролиз хитина пчел позволял получать конечный продукт не более чем 75% чистоты, что подтверждалось с помощью анализа ВЭЖХ(рис. 16).

Рис 16. Высокоэффективная жидкостная хроматография ацетил-глюкозоамина. Смесь маркеров олигомеров N-ацетилглюкозоаминов со степенью полимеризации от 1 до 6 (I). Образцы АГА, полученные в результате гидролиза регенерированного крабового (И) и пчелиного (III) хитина.

В результате проведенных исследований, нами показана возможность использования ферментного препарата Целловиридин Г20х для гидролиза а-хитина. Конечным продуктом процесса в вышеупомянутых условиях являлся N-ацетилглюкозоамин.

3.2. Технология переработки подмора пчел

На основе выводов, сделанных в предшествующих главах, мы определили оптимальные условия каждой стадии технологического процесса переработки пчелиного подмора. Учитывая все особенности сырья, мы предлагаем технологическую схему переработки пчелиного подмора с получением таких веществ, как водорастворимый меланин, хитин-меланиновый комплекс, высокомолекулярный и низкомолекулярный хитозан-меланиновые комплексы. Данные условия переработки в основном нацелены на получение водорастворимого пигмента и ХзМК, которые по отдельности или совместно могут найти новые области использования. Следует отметить, что, варьируя параметрами технологического процесса, можно изменять физико-химические свойства продуктов в зависимости от целей использования. Например, менее жесткие условия депротеинирования позволят наряду с ХМК получать из гидролизата белок-меланиновый комплекс с сохранением нативных свойств и возможностью использования в качестве кормового продукта. Ниже приведена технологическая схема переработки пчелиного подмора и описание работы данной схемы (рис. 17).

 Содержание     Получить работу