3.5.1. Подготовка носителя. В работе использовалась хроматографическая бумага (ГОСТ № 10395-63) форматом 52x65 и плотностью 85. На бумагу размером 25x10 см в центре наносили стартовую линию и смачивали проводящей жидкостью всю поверхность бумаги, за исключением полоски размером 1,5 см с обеих сторон от стартовой линии (для предотвращения размывания анализируемой пробы).3.5.2. Выбор и подготовка проводящей жидкости.
На практике в качестве проводящей жидкости чаще всего используются буферные растворы. Состав и кислотность буфера являются важнейшими условиями электрофоретического процесса.
В качестве проводящей жидкости нами были рассмотрены три буферных раствора, характеристики котрых представлены в табл. 3.5.
Таблица 3.5
Характеристика буферных растворов.
Название буфера Состав буфера (на 1 л.) РН
Цитратный 17,5г лимонной кислоты, 8,2г NaOH 3,41
Фосфатный H,9rNaHP04x2H20, 9,0гКН2РО4 7,97
Аммиачный lO.OrNHtCl, 50мл 25%-аммиака 11,78
Электродные кюветы заполняли соответствующим буферным раствором и соединяли кюветы полосками фильтровальной бумаги. Следует обратить внимание на тот факт, что после проведения электрофореза уменьшается концентрация буферных растворов (особенно аммиачного) и, следовательно, меняется величина рН. Поэтому буферные растворы нельзя использовать дважды.
3.5.3. Подготовка образцов.
Отработку методики электрофоретического разделения проводили на стандартных растворах ФХ, ФИ. ФЭА, ФС и ФГ в хлороформме с концентрацией 10 мг/мл.
Фосфолипидный комплекс, полученный как описано в п. 2.2, сушили в чашке Петри под вакуумом при 30-35 С, затем растворяли в хлороформе до 1 %-ной концентрации. Подготовленный таким способом образец использовали для дальнейшего разделения.
3.5.4. Нанесение пробы.
Вещество, подлежащее фракционированию, наносили микрошприцем на стартовую линию на расстояние не менее 1 см от края бумаги и не менее
2,5 см друг от друга. Бумагу подсушивали и помещали на электрофоретический столик таким образом, чтобы концы бумаги были погружены на 1 см в кюветы с проводящей жидкостью. Для предотвращения чрезмерного испарения буфера, которое может привести к снижению его концентрации и изменению величины рН, всю систему помещали в закрытую камеру и проводили электрофорез. Экспериментально было установлено, что объем наносимой пробы существенно влияет на процесс разделения и качество электрофоретических зон. Поэтому предварительно нами был установлен оптимальный объем наносимой пробы для ФХ, так как его количество в любом фосфолипидном концентрате доминирует.
Для выяснения этого влияния стандартный раствор ФХ в хлороформе наносили микрошприцем на стартовую линию в объеме 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0 и 10 мкл. После проведения электрофореза и детектирования полученных зон, нами были установлены оптимальные объемы наносимой пробы. Они составили 1 и 2 мкл. Большое количество наносимого вещества (свыше 2 мкл) значительно ухудшает картину разделения и основная масса вещества остается на старте.
3.5.5. Проведение электрофореза.
После нанесения пробы и герметизации камеры, на электроды подавали электрический ток. В работе [39] рекомендутся проводить электрофорез крупных молекул при градиенте потенциала 4-6 В/см. Напряжение (U), необходимое для проведения разделения рассчитывали по формуле:
U = L х Ajli где L — длина бумаги, см; Afi - градиент потенциала, В/см.
Подставив в формулу наши данные получим, что напряжение, подаваемое на электроды, должно быть в интервале 400-600 В.
Для выбора оптимального напряжения проводили электрофорез стандартного раствора ФХ при 400, 500 и 600 В. Лучшее разделение и качество зон для всех трех буферных систем наблюдалось при 600 В.
Время экспонирования также устанавливалось экспериментально. Оно составило 30 мин для аммиачного буфера и 60 мин для фосфатного и цитратного буферных растворов.
После завершения электрофоретического процесса бумагу как можно быстрее переносили в термостат и высушивали при температуре ПО °С в течение 20-30 мин. Быстрая фиксация разделенных веществ проводится для того, чтобы предотвратить диффузию молекул, продолжающуюся и после отключения электрического тока, что приводит к ухудшению картины разделения.
3.5.6. Обнаружение и количественная оценка веществ. Связывание макромолекул с окрашенными веществами - это наиболее часто применяемый метод их выявления после электрофореза в хорошо сохраняющих форму поддерживающих средах, таких, как бумага, ацетат целлюлозы и гели, состоящие из крахмала, агара, агарозы или полиакриламида.
Детектирование электрофоретических зон после разделения проводили следующим образом. Высушенные полоски бумаги помещали в сухие кюветы, заливали раствором проявителя и оставляли на 30-60 мин. Затем полоски бумаги вывешивали на раму и сушили при комнатной температуре. В качестве реагентов-обнаружителей использовали следующие:
1) 0,0012 % раствор Родамина 6Ж. Является неспецифическим обнаружителем. Используется для определения кислых (голубые и пурпурные зоны) и нейтральных (желтые и оранжевые зоны) липидов. Это наиболее распространенный обнаружитель. После обработки электрофореграмм этим реагентом, обнаружение зон проводят в УФ-свете.2) 5 % спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты. Этот реактив широко используется для обнаружения всех фосфолипидов.3) 0,25 % раствор нингидрина в ацетоне. Специфический обнаружитель для фосфолипидов, имеющих свободные аминогруппы.
Отработку методики проводили на модельных смесях фосфолипидов. Полученные результаты представлены в табл. 3.6.
Таблица 3.6 Электрофоретическое разделение ФЛК
Область Длина пробега, см Окраска Фосфолипи ДЫ*
Родамин 6Ж Нингидрин ФМК
] Дитратный буфер (рН=3,79)
Анодная 27,1 Пурпурная - - ФК
13,2 Голубая - Синяя ФГ4,7 Голубая - Синяя ФИ
Катодная 2,9 Пурпурная Розовая - ФЭА
1,8 Оранжевая Розовая Синяя ФХ
Анодная 1,7 Пурпурная Розовая Синяя ФС
Аммиачный буфер (рН= 12,05)
Анодная 2,5 - Фиолет - ФЭА
3,3 - Фиолет - ФС5,4 - Фиолет - ФИ
Катодная 0,2 - - Синяя ФХ
Фосфатный буфер (рН=7,91)
Катодная 1,3 - - Синяя ФХ
0,9 - Фиолет - ФЭА
*ФК-фосфатидные кислоты; ФГ-фосфатидилглицерин; ФИ-фосфатидилинозитол; ФЭА-фосфатидилэтаноламин; ФХ-фосфатидилхолин; ФС-фосфатидилсерин.
Лучшее разделение и качество электрофоретических зон было достигнуто при использовании цитратного буфера. В соответствии с данными таблицы 3.6 в цитратной и фосфатной буферных системах ФХ и ФЭА существуют в виде положительно заряженных частиц, т.к. под действием электрического тока они движутся в катодную область. Следовательно, в кислой и нейтральной средах ФХ и ФЭА существуют в виде катионов. ФС, ФК, ФГ и ФИ в цитратном буфере обнаруживаются в анодной области, т.е. они имеют отрицательный суммарный заряд и являются анионными ФЛ. В аммиачном буфере (щелочная среда) ФИ, ФС и ФЭА существуют в виде анионов, а ФХ остается на линии старта. Это можно объяснить тем, что вблизи величины рН= 12,05 находится изоэлектрическая точка ФХ. Обнаружить ФК, ФС и ФИ при использовании фосфатного буфера не удалось. Проверка отдельных электрофоретических зон на наличие золы показала отсутствие минеральных компонентов (менее 0,001%), что свидетельствует о разрушении комплекса металл-ФЛ при использовании этого метода.
Количественное определение разделенных компонентов проводится обычно двумя способами: с использованием денситометра и путем извлечения (элюирования) вещества из бумаги с последующим определением его количества каким-либо физико-химическим методом [39].
В последнем случае разрезают электрофореграммы на участки, соответствующие отдельным фракциям. Каждый участок измельчают и помещают в отдельные пробирки, в которые приливают элюирующий раствор. Для определения фона вырезают полоску бумаги шириной 2 см из участка, свободного от определяемого вещества, и проводят элюирование. Окрашенный раствор фотометрируют на ФЭКе или спектрофотометре против элюирующего раствора.
Денситометрическое определение проводится следующим образом. Бумажную полоску пропитывают вазелиновым маслом, избыток которого удаляют путем закдадки электрофореграммы между листами фильтровальной бумаги. Затем помещают электрофореграмму в денситометр
и записывают кривую. Площадь денситограммы, ограниченную кривой, вырезают и взвешивают. Затем разрезают денситограмму на отдельные участки, соответствующие фракциям липидов и также взвешивают. Методом абсолютной нормировки рассчитывают содержание определяемых веществ.
Следует отметить, что относительная ошибка определения ФХ описанным выше методом (ВЭФ со спектрофотометрическим окончанием) может достигать 40 %, что совершенно недопустимо при стандартизации этого вещества в фармпрепаратах.
Экспериментально нами было установлено, что в фосфатном и цитратном буферных растворах электрофореграмма ФХ имеет специфический вид «свечей» (рис. 3.10), причем высота таких свечей линейно зависит от концентрации ФХ в области от 30 до 80 мг/ см3. Этот факт был использован для построения градуировочного графика при определении ФХ методом ВЭФ в цитратном буфере (рис. 3.11). Регрессионный анализ градуировочных графиков представлен в Приложении 2.
Рис.3.10. Электрофореграмма стандартных растворов ФХ (цитратный буфер) с концентрациями:! - 39,38 мг/ см ; 2 - 58,08 мг/ см ; 3 - 78,76 мг/ см3; 4- 98,72 мг/см3.
Н,мм65
55 -45-35 -2515 — 35
Рис.3.11. Градуировочный график для определения ФХ в нитратном буфере (Н-высота электрофоретической зоны).
Такой прием определения ФХ позволяет значительно сократить время анализа и уменьшить ошибку определения вследствие сокращения целого ряда операций предподготовки пробы для дальнейшего количественного обнаружения.
Данные по содержанию ФХ в ФЛК масла семян амаранта, полученные методом ВЭФ представлены в табл. 3.7. Статистическая обработка результатов приведена в Приложении 1.
Таблица 3.7 Содержание ФХ в ФЛК амарантового масла
Объект исследования Массовая доля ФХ в ФЛК, % Метрологические характеристики
Образец 1 53,2 Sx=l,3; Ax=3,5; sa=6,7 %
Образец 2 51,0 Sx=l,5; Ax=2,7; ea=5,2 %
На основе вышеизложенного можно сделать вывод о том, что при проведении разделения ФЛ для аналитических целей предпочтительнее использовать метод ВЭФ на бумаге как наиболее экспрессный и информативный. Кроме того, предлагаемая методика позволяет параллельно разделению проводить идентификацию ФЛ и количественное определение
т-----------------------------------1----------------------------------1----------------------------------1
55 75 95 115
с, мг/мл
основного компонента ФЛК - фосфатидилхолина. Для препаративного выделения ФЛ целесообразно применять метод колоночной хроматографии на неионогенном сорбенте Стиросорб.
Разработанный и запатентованный нами способ [124] может быть использован для получения ФЛ из любого растительного масла.
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И СОСТАВА МАСЛА СЕМЯН АМАРАНТА
Свойства жирных растительных масел определяются рядом физико-химических показателей [28], качественным составом жирных кислот и их количественным соотношением [39].
4.1. Определение физико-химических характеристик качества масла семян амаранта.
Физико-химические показатели качества масла определяли для двух образцов, полученных в 2001 (образец 1) и 2002 (образец 2) годах.
Определение запаха, цвета и прозрачности проводили, как описано в п. 2.6.1. Запах жирных масел обусловлен наличием в них следов эфирных масел (терпены, алифатические углеводороды и др.). В некоторых жирных маслах содержатся обладающие запахом сложные эфиры высокомолекулярных кислот [92].
В результате установлено, что масло семян амаранта имеет оранжево-красный цвет, характерный запах и специфический привкус без горечи-Испытуемые образцы масла не имели мути и взвешенных хлопьев, следовательно, их можно считать прозрачными.
Определение физических констант и химических показателей качества масла проводили по методикам, описанным в п. 2.6. В таблице 4.1. представлены физико-химические характеристики для двух образцов серии невысыхающих масел (касторовое и миндальное), двух образцов серии полувысыхающих масел (подсолнечное и кукурузное), двух образцов масла семян амаранта и облепихового масла, которое по содержанию биологически активных веществ наиболее близко к амарантовому.
Показатель «массовая доля общей золы» характеризует содержание в масле неорганических примесей и вьфажается в % от массы анализируемого образца. Как правило, чем ниже содержание органического вещества в образце, тем выше зольность. Содержание золы определяют при
Показатели качества масла семян амаранта и некоторых других растительны
Показатели качества масла Амарантовое Подсолнечное [7] Кукурузное [ИЗ] Касторовое [40] М н
