Однако заметное снижение показателя размножения, по-видимому, говорит о том, что ФК лекарственных трав обладает биостатической (замедляющей размножение) активностью.
Таким образом, интактные липосомы и липосомы с ФК, состоящим из лекарственных трав в следующем процентном соотношении: шалфея лекарственного, календулы лекарственной - 4 части, крапивы двудомной, зверобоя продырявленного, ромашки аптечной - 1 часть, не обладают токсическим эффектом.
Интактные липосомы обладают биологической активностью, поскольку в их среде происходит размножение парамеций.
Липосомы с ФК при изучении степени влияния на аппарат размножения проявили биостатическую активность.
3.4. Микробиологическое изучение препаратов из лекарственных трав в
интактной и липосомальной форме Следующим этапом разработки рецептуры оригинального лечебно-профилактического косметического средства для проблемной кожи, содержащего фитокомплекс лекарственных трав, стало изучение биологической активности монотрав и ФК с использованием в качестве биомодели патогенных микроорганизмов.
Первичные гнойно-воспалительные заболевания кожи вызываются обычно однородной по своим признакам, чувствительной к противомикробным препаратам популяцией одного вида, преимущественно эпидермальным или золотистым стафилококком. Повреждение клеток и тканей организма хозяина условно-патогенные микробы вызывают с помощью эндотоксина, ферментов-токсинов, капсульного вещества, аллергенов. Так, липазы стафилококка разрушают липиды клеточных структур и липопротеины крови. Стафилококки утилизируют метаболиты кожных структур и потому способны интенсивно колонизировать поверхность кожи. Образование липазы дает этому микробу возможность к инвазии здоровой кожи и подкожной клетчатки с формированием локальных абсцессов. Поскольку микроб постоянно обитает на коже, то в норме способность стафилококка к инвазии и резистентность хозяина хорошо сбалансированы, пока не встретится высоковирулентный штамм или макроорганизм со сниженной резистентностью (Красильников А.П. 1995).
Определение степени биологической активности и микробиологической безопасности различных форм лекарственных трав, прошедших первоначальный отбор на начальных этапах исследования с помощью биомодели Paramecium caudatum, проводилось с использованием биомодели Staphylococcus aureus.
Микробиологическое изучение полученных нами препаратов из следующих лекарственных трав: зверобой продырявленный, календула
лекарственная, крапива двудомная, ромашка аптечная, шалфей лекарственный, сборов из фитокомплексов данных трав с целью определения микробиологических показателей безопасности использования в производственной практике и изучения действия на патогенный стафилококк проводили согласно статьи Государственной Фармакопеи XI издания: "Методы микробиологического контроля лекарственных средств", "Биологические испытания с альтернативными реакциями. Оценка и сравнение пороговых доз при их прямом определении" (ГФ XI, 2002, вып.2), в СтавНИПЧИ совместно с докторами медицинских наук В.И. Ефременко и В.Н. Савельевым, за что авторы выражают глубочайшую признательность.
Сущность метода заключается в контроле стерильности и определении степени микробиологической безопасности приготовленных лекарственных форм из вышеназванных трав с последующим изучением бактерицидного и/или бактериостатического действия их на патогенный стафилококк (использовали референтный штамм Staphylococcus aureus 209 Р).
Контроль стерильности экстрактов в интактной и липосомальной форме осуществлялся согласно СанПиН 1.2.681-97
Отсутствие роста колоний КМАФАнМ, а также других микроорганизмов на плотных питательных средах указывало на стерильность испытуемых препаратов; наличие роста не более чем 103 КОЕ МАФАнМ в 1 мл экстрактов лекарственных трав в интактной и липосомальной форме при отсутствии роста дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов, бактерий семейства Enterobacteriaceae, патогенных стафилококков, палочек Pseudomonas aeruginosa указывало на микробиологическую безопасность применения испытуемых препаратов в процессе производства.
Изучены микробиологические показатели безопасности масляных экстрактов и липосомальных форм лекарственных трав: календулы лекарственной, шалфея лекарственного, крапивы двудомной, ромашки аптечной, зверобоя продырявленного, а также фитокомплекса данных трав,
представленного сборами: в ФК №1 лекарственные травы вошли в равных процентных соотношениях, в ФК №2 - соотношение шалфея и календулы к остальным компонентам составило 2:1, в ФК №3 - соотношение шалфея и календулы к остальным компонентам составило 4:1, а в ФК №4 соответственно 8:1.
Получены данные о стерильности масляных экстрактов зверобоя, календулы, ромашки, шалфея, ФК №№1-4, т.к. при высеве из данных препаратов на жидкие и плотные питательные среды рост мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, а также рост бактерий семейства Enterobacteriaceae, палочек Pseudomonas aeruginosa отсутствовал. Между тем, в масляном экстракте из крапивы присутствовал рост КМАФАнМ. Однако их количество в 1 мл данного препарата не превышал 1 ООО микробных клеток, что, согласно СанПиН 1.2.681-97, позволило сделать вывод о микробиологической безопасности.
По микробиологическим показателям безопасности липосомальные формы ФК лекарственных трав показали следующие результаты.
Таблица 4.
(-) - отсутствие роста микрофлоры.
Микробиологические показатели безопасности липосомальных форм
Из данных, представленных в таблице 4 следует, что липосомальные формы содержат в 1 мл КМАФАнМ, общее количество которых не превышает 103 КОЕ, что позволяет расценить испытуемые серии липосомальных форм экстрактов лекарственных трав как микробиологически безопасные.
3.5. Изучение бактерицидной и бактериостатической активности экстрактов лекарственных трав и фитокомплексов в интактной и
липосомальной форме
Бактерицидную и/или бактериостатическую активность экстрактов в интактной и липосомальной форме в отношении патогенного стафилококка изучали методом серийных разведений в жидкой питательной среде.
Учет результатов проводили визуально по отсутствию или наличию помутнения содержимого пробирок, а также путем высева из каждого разведения изучаемых препаратов и из контрольных пробирок на плотные питательные среды: желточно-солевой агар, 5% кровяной агар. Последнее разведение экстрактов или липосомальных форм лекарственных трав, высев из которого не дал роста колоний стафилококка, принимали за минимальную ингибирующую концентрацию - бактерицидное действие испытуемого препарата. О бактериостатическом действии изучаемых препаратов судили по количеству КОЕ стафилококка в конкретном разведении препарата по сравнению с КОЕ стафилококка, высеянного из контроля культуры. Снижение в опыте КОЕ стафилококка на порядок и более по сравнению с контролем свидетельствовало о бактериостатическом действии изучаемых препаратов.
В эксперименте проводилось определение бактерицидной и бактериостатичесой активности масляных экстрактов лекарственных трав и липосомальных форм лекарственных трав: календулы лекарственной, шалфея лекарственного, крапивы двудомной, ромашки аптечной, зверобоя
продырявленного, а также ФК данных трав, представленного в различных процентных соотношениях доминирующих трав:
- в ФК №1 лекарственные травы вошли в равных процентных
соотношениях,
- в ФК №2 - соотношение календулы и шалфея к остальным компонентам
составило 2:1,
- в ФК №3 - соотношение шалфея и календулы к остальным компонентам составило 4:1,
- в ФК № 4 - соответственно 8:1 (табл. 5).
Согласно данным, представленным в таблице 5, масляные экстракты зверобоя, календулы, шалфея, ромашки, сборов №№1-4 обладали бактерицидной активностью по отношению к патогенному стафилококку. При этом минимальная ингибирующая концентрация для экстрактов зверобоя, календулы, ромашки и сборов №№1,2,4 проявилась в разведении 1:2, для экстракта шалфея и для сбора №3 - в отношении 1:4.
Экстракт крапивы проявил бактерицидную активность в отношении стафилококка только в цельном виде.
Бактериостатическую активность экстракты зверобоя, календулы и сбора № 1 проявили в разведениях 1:4 до 1:16, экстракт ромашки и сборов №№2,4 - в разведениях 1:4 - 1:8, экстракты шалфея и сбора №3 - разведениях 1:8 - 1:16, проявив наибольшую активность в отношении стафилококка, экстракт крапивы обладал бактериостатическим действием в разведении 1:2 - 1:4, являясь наименее активным в отношении стафилококка.
(-) - отсутствие роста микрофлоры. Следующим шагом в изучении активности экстрактов лекарственных трав стало определение минимальной ингибирующей концентрации и бактериостатического действия экстрактов ФК в липосомальной форме (табл.6).
Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют, что минимальная ингибирующая концентрация липосомальных форм экстрактов ФК лекарственных трав для серий №№1,2,4 составила разведение 1:4, для серии №3 - 1:8. Бактериостатическое действие на патогенный стафилококк
проявилось для серий №№1,2,4 в разведениях 1:8 - 1:32, для серии №3 - 1:16 -1:32.
Таблица 6.
Определение бактерицидной и бактериостатической активности липосомальной
формы экстрактов лекарственных трав.
(-) - отсутствие роста микрофлоры.
Таким образом, в ходе проведения экспериментов получены данные о том, что разработанные нами экстракты лекарственных трав в интактной и липосомальной форме по своим микробиологическим показателям соответствуют требованиям СанПиН 1.2.681-97 и являются безопасными для использования их в процессе производства лечебно-профилактических липосомальных косметических средств. Данные препараты обладают бактерицидной и бактериостатической активностью в отношении патогенного Staphylococcus aureus.
Изучение синергизма действия трав в фитокомплексе позволило подобрать оптимальное количественное соотношение лекарственных трав, обладающих мощным бактерицидным и бактериостатическим действием и
подтвердить полученные в ходе экспериментов на биомодели Paramecium caudatum данные о биостатической активности ФК №3.
Таким образом, экспериментально доказано, что ФК, в котором содержание комплекса "центральных трав" шалфей-календула по отношению к комплексу ромашка-зверобой-крапива составляет 4:1, обладает наиболее выраженным бактерицидным действием как в интактной, так и в липосомальной форме. В процессе конструирования липосомальной эмульсии, содержащей ФК для введения в состав косметического средства имеет смысл использовать именно данное процентное соотношение входящих в фитокомплекс лекарственных трав.
3.6. Оптимизация процессов экстрагирования биологически активных веществ растительного происхождения
Процесс экстрагирования относится к массообменным и определяется общими законами массопередачи, свойствами растительной ткани и физико-химическим сродством растворителя и извлекаемого вещества (Молчанов Г.И., 1981). Процесс экстрагирования начинается с проникновения экстрагента в материал, смачивания веществ, находящихся внутри клетки, растворения и десорбции, вымывания клеточного содержимого из разрушенных клеток, диффузией через поры клеточной оболочки и заканчивается массопереносом веществ от поверхности материала в раствор (Балабуткин М.А., 1993).
В ходе экспериментального изучения биологической активности экстрактов лекарственных трав в интактной и липосомальной формах нами были получены данные о целесообразности проведения последовательно хлороформной, затем водно-спиртовой и водной экстракции ФК лекарственных трав в целях наиболее полного извлечения БАВ.
При производстве липосомальных фитопрепаратов "узким" местом производства остаются большие отходы лекарственного фитосырья после однократной масляной экстракции. Так нами был получен водно-спиртовой экстракт сбора изучаемого ФК с процентным содержанием шалфея и календулы 4:1 (сбор №2), прошедшего предварительную хлороформную экстракцию и определена степень его биологической активности (рис.6).
Из рисунка 6 следует, что минимальная бактерицидная концентрация экстракта сбора №2 составила 1:8, бактериостатическая 1:16 - 1:32. Экстракт сбора №1 проявил бактерицидную активность в разведении 1:16, бактериостатическую - 1:32 - 1:64. При этом бактерицидная активность 40% спирта этилового, с помощью которого проводилась экстракция, отмечена в разведении 1:4, а бактериостатическая в разведениях 1:8 - 1:16.
Следовательно, бактерицидная и бактериостатическая активность водно-спиртовых экстрактов сборов №№1,2 проявлялась за счет действия на стафилококк экстрагируемых из данных лекарственных трав биологически активных веществ, причем биологическая активность сбора №2 достаточно высока, несмотря на предварительную хлороформную экстракцию.
Таким образом, экспериментально доказано, что водно-спиртовые экстракты, полученные из прошедших предварительную хлороформную экстракцию ФК, обладают бактерицидными свойствами и могут включаться в состав тонизирующих липидных косметических средств. Вторичное водно-спиртовое (40%) экстрагирование представляется экономически целесообразным.
3.7. Усовершенствование биотехнологии липосомального лечебно-профилактического крема для ухода за проблемной кожей, склонной к
воспалительным процессам
В последнее время в рецептуру косметических композиций активно вводят разнообразные биологически активные вещества, оказывающие регуляторное воздействие на биохимические процессы и функциональные нарушения кожного покрова. В качестве БАВ используют витамины, ферменты, фосфоросодержащие вещества, экстракты растений, животного сырья, продукты пчеловодства и др. Экстракты лекарственных растений, с нашей точки зрения, представляют значительный интерес благодаря их дешевизне, доступности и широкому спектру содержащихся в них полезных компонентов.
