ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В последние годы при усовершенствовании многих технологических процессов широко используются гидролитические ферменты микроорганизмов, характеризующиеся более высокой активностью и низкой себестоимостью по сравнению с гидролазами растительного и животного происхождения. Выявление особенностей структуры и функционирования липолитичеких ферментов становится особенно актуальным в связи с их биологической ролью, а также предоставляет новые возможности: ,^ для создания катализаторов с целью их дальнейшего эффективного примене-
ния в различных отраслях промышленности и в качестве медицинских препаратов.
В настоящее время в лабораториях научно-исследовательских институтов разрабатывается новая прогрессивная технология - катализ с использованием иммобилизованных ферментов, которые имеют ряд преимуществ перед растворимыми катализаторами в связи с более высокой стабильностью по отношению к денатурирующим факторам окружающей среды. Кроме того, подбирая соответствующий носитель и способ связывания, можно значительно уменьшить неблагоприятное воздействие матрицы носителя на структуру белка и повысить тем самым его ценность как биокатализатора. , Возрастающие масштабы использования липаз в биотехнологии вызы-
вают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в качестве которого в настоящей работе предложен микромицет Rhizopus japonicus 1403. Для решения проблем регулирования биологических свойств липазы необходимо детальное исследование физико-химических, кинетико-термодинамических свойств фермента, особенностей его структурной организации, раскрытие молекулярного механизма реакции превращения субстрата.
Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуни-
5
верситета, входящей в координационный план научно-исследовательских ра-Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярного механизма реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403.
В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:
¦ разработка эффективной методики выделения и очистки липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403;
¦ идентификация функциональных групп каталитического и ¦ субстрат--* связывающего центров в молекуле липазы;
¦ исследование особенностей надмолекулярной организации изучаемого фермента методами гель-хроматографии, электрофореза и атомно-силовой микроскопии;
¦ создание гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной модифицированным глутаральдегидным способом на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анионите АВ-17-2П;
¦ изучение физико-химических и кинетико-термодинамических аспектов гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой;
¦ выявление оптимальных технологических режимов функционирования полученного иммобилизованного препарата фермента в реакторах периодического и непрерывного действия;
¦ описание молекулярного механизма разрыва сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов.
Научная новизна.
¦ разработан эффективный метод получения гомогенного препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой степенью очистки;
6
¦ впервые четвертичная структура обнаружена у липолитического фермента семейства Mucoraceae, выявлены физико-химические свойства и природа взаимодействия субъединиц;
¦ создан новый гетерогенный биологический катализатор на основе липазы, иммобилизованной на отработанном в сахаро-рафинадном производстве анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегид-ным методом;
¦по результатам исследования кинетико-термодинамических и технологических характеристик свободной и иммобилизованной липазы .^ сконструирован реактор непрерывного действия, позволяющий осу-
ществлять гидролиз триглицеридов с высоким выходом;
¦ изучено строение активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 методами Диксона, химической модификации специфическими реагентами и фотоокислением в присутствии метиленового голубого;
¦ на основании экспериментальных данных и при использовании программы MolScript описан молекулярный механизм реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403
Практическая значимость Получен гомогенный препарат липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой гидролитической активностью. Изучение особенностей надмолекулярной организации липазы позволяет расширить представления о механизмах регуляции функциональных свойств ферментов in vivo. Создан гетерогенный биокатализатор с ковалентно иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П липазой, выявлены оптимальные условия его функционирования. Разработанные технологические режимы работы реактора непрерывного действия с полученным гетерогенным катализатором позволяют рекомендовать его для применения в промышленных масштабах. Результаты исследования строения активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 и молекулярного механизма каталитического гидро-
7
лиза сложноэфирных связей расширяют и углубляют представления о закономерностях функционировании эстераз семейства Mucoraceae.
Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на IV Международном симпозиуме «Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001); XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001); Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок, экологически безопасные технологии» (Тверь, 2001); Международной научно-^ практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопас-
ность товаров и услуг» (Орел, 2001); Международной научно-практической конференции «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); Межрегион, конференции молодых ученых «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2001); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматогра-фические приборы» (Москва, 2004), конференции «Биотехнология — охране окружающей среды» (Москва, 2004), III Съезде биофизиков России (Воро-неж, 2004), 8th Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 20 публикаций: 9 статей и 11 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Нативная молекула липазы из Rhizopus japonicus 1403 функционирует в виде димера, образованного в результате гидрофобных взаимодействий между двумя субъединицами фермента, находящимися в «открытой» кон-м формации.
8
2. Разработан модифицированный метод ковалентной иммобилизации липазы на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анио-ните АВ-17-2П, полученный препарат является эффективным биокатализатором и может быть рекомендован для применения в промышленной технологии.
3. Функционально значимые аминокислотные остатки субстратсвязы-вающего, каталитического центров и их микроокружения для липаз рода Rhizopus являются идентичными и входят в состав консервативных участков первичных структур гидролаз данной группы.
4. Схема молекулярного механизма расщепления сложноэфирных свя-зей в молекуле триглицеридов.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 156 страниц машинописного текста; состоит из Введения, 8 глав, Заключения, Выводов, Списка литературы (177 источников) и Приложения. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 19 таблиц; в Приложении 9 таблиц.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Современные представления о липолитических ферментах
1.1. Характеристика продуцентов и физико-химические свойства липаз
Липолитические ферменты являются одним из наиболее распространенных в природе ферментных комплексов. Они относятся к подклассу 3.1 класса гидролаз и осуществляют реакцию гидролиза природных липидов - сложных эфиров многоатомных спиртов и высших карбоновых кислот. Большинство липолитических ферментов могут гидролизовать также натуральные или искусственно полученные низкомолекулярные эфиры, часто с совершенно отличной от природных триглицеридов структурой (J. Morrissey et al., 2000). Наиболее заметное место в области химической энзимологии и молекулярной биологии занимает липаза (триацилглицерол-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.3) — гидролаза эфиров глицерина и жирных кислот.
В настоящее время установлено, что способностью к синтезу липаз обладают организмы различных систематических групп. Данные ферменты присутствуют в различных животных тканях, особенно в поджелудочной железе, желудочном соке, печени, сыворотке крови. Липаза обнаружена в вегетативных органах и семенах растений, плесневых и дрожжевых грибах, бак-териях (X. Брокерхоф, Р. Дженсен, 1978).
Основными продуцентами липолитических ферментов являются бактерии и микроскопические грибы. Показано, что липазы микроорганизмов отличаются более высокой активностью и богатым разнообразием свойств по сравнению с ферментами растительного и животного происхождения.
Большинство липаз, синтезируемых микроорганизмами, имеют оптимальные температуры функционирования 35-40 °С. В зависимости от оптимальной для липолиза концентрации ионов водорода липазы подразделяют на кислые, проявляющие максимальную активность при рН 3,0-5,5 (к ним
10
относится, в частности, желудочная липаза), нейтральные (с оптимальной скоростью гидролиза при рН 6,0-7,5) и щелочные (рН-оптимум выше 7,5). Многие из этих ферментов обладают устойчивостью к крайним значениям концентраций ионов водорода, некоторые - высокой термостабильностью. Ряд исследователей показывают, что термостабильность фермента находится в тесной связи с особенностями строения белковой молекулы: количеством водородных связей, стабилизирующих ее структуру, содержанием основных и неполярных аминокислотных остатков, гидрофобностью молекулы, наличием или отсутствием цистеина (Л.Г. Логинова, Л.А. Егорова, 1977). Извест-, ными продуцентами термоустойчивых липаз являются термофильные виды
бактерий из родов Bacillus, Humicola, Pseudomonas и др. Например, термоал-калофильная липаза Bacillus stearothermophilus расщепляет триглицериды при высоких значениях температуры и рН. Фермент обнаруживает значительную степень гомологии аминокислотных последовательностей с липазами стафилококков и содержит дополнительный центр связывания цинка. Оптимальная температура липолиза объясняется большой длиной спирали-«крышки» в закрытой конформации фермента, «открывание» которой - триг-герный процесс, обусловленный термической диссоциацией гидрофобных взаимодействий. (S. Jeong et al., 2002; L. Stepaniak et al., 1987).
J. Cheomar et al. (1987) получили препарат термостабильной липазы из Humicola lanuginosa на среде с сорбитом и кукурузным экстрактом. Фермент сохранял 100% гидролитической активности после инкубации в течение 20 ч прибО'С.
Термостабильность липазы изучена методом дифференциальной сканирующей калориметрии (К. Hsu. et al., 2001). Авторы осуществили предварительную замену гидрофобных остатков триптофана в молекуле фермента на гидрофильные. Процесс денатурации мутантных форм происходил при 68,6 и 62,6 "С (по сравнению с 74,0 "С «дикого типа»), что указывает на значительный вклад остатков триптофана в термостабильность фермента
11
Выделение липолитических ферментов из термофильных микроскопических грибов приобретает особенную значимость в связи с актуальностью использования липаз в промышленной технологии и медицине. Следовательно, поиск термоустойчивых штаммов микромицетов является одной из важных задач химической энзимологии. Способностью к синтезу термоустойчивых липаз обладают микромицеты родов Aspergillus, Rhizopus, Mucor и др. (J. Bhardish et al., 1985; J. Palomo et al., 2004).
Термостабильная липаза обнаружена впервые в отрубях риса Oryza sa-tiva. Очищенный гликопротеин с молекулярной массой 9,4 кДа характеризо-ф вался оптимальным значением температуры гидролиза 80 "С и не утрачивал
каталитическую активность при 90 "С, показывая практически полную сохранность всех элементов вторичной структуры (К. Bhardwaj et al., 2001).
М. Kohno et al. (2001) методом «случайного» мутагенеза продемонстрирована возможность увеличения оптимальной температуры липолиза ферментом Rhizopus niveus на 15е С, причем мутантная термостабильная липаза характеризовалась следующими заменами в первичной структуре: Pro-18 на His, Ala-36 на Thr, Glu-218 на Val. Данный эффект авторы объясняют значительными перестройками в трехмерной структуре «дикого типа».
При изучении особенностей воздействия на функционирование липаз ингибирующих веществ установлено, что присутствие ионов Fe3+, Pb2+, Hg2+, Ag+ снижает скорость липолиза (N. Toshijuki et al., 1987; H. Chander et al.). W. Jeanette et al. (2003) показан ингибирующий эффект по отношению к липазе ионов Zn2+, Fe2+ и Hg2+ на 98%, 89% и 26% соответственно.
Raghavendra et al. (2002) исследовали влияние фенилборной кислоты на кинетические закономерности ингибирования реакции гидролиза липазой из рисовых отрубей и наблюдали сдвиги кривых термоденатурации в сторону более низких температур. Конкурентный тип ингибирования указывает на присутствие остатка серина в активном центре фермента.
Установлено, что некоторые белки (сывороточный альбумин, Р-лактоглобулин, миоглобин) оказывают на панкреатическую и микробные ли-
12
пазы слабое ингибирующее воздействие, обусловленное взаимодействием белка с субстратом (Г.Б. Ксандопуло и др., 1974).
Большое внимание исследователей уделяется влиянию поверхностно-активных веществ на активность липаз и выяснению механизма их действия. Наиболее исследованными в этом отношении являются соли желчных кислот. Ряд авторов (С. Wang et al., 1988; S. Singh et al., 1987) показали увеличение активности липазы при добавлении в реакционную смесь растворов желчных кислот и их производных. Действие холатов объясняется ускорением диффузии длинноцепочечных жирных кислот с границы раздела фаз, пре-г^ дотвращающей ингибирование продуктами липолиза.
Однако липаза из Rhizopus micros poms ингибировалась холатом натрия, а липаза из Penicillium species - дезоксихолатом (К.Д. Давранов, 1976). Авторы считают, что снижение скорости липолиза на стадиях гидролиза мо-ноглицеридов может быть связано с образованием мицелл холатов с моно-глицеридом и жирной кислотой, препятствующих доступу фермента к субстрату.
X. Wang et al. (1997) обнаружили уникальный фермент, локализованный в интестинальном отделе кишечника, для проявления активности которого необходимо присутствие солей желчных кислот. При кристаллографическом исследовании данной липазы идентифицированы два центра связывания холатов: первый центр расположен вблизи каталитической триады, в петлеобразной структуре, второй - в некотором отдалении. При связывании с таурохолатом петлеобразная структура теряет мобильность,^ приобретая энергетически выгодную для катализа конформацию.
Активаторами липолитических ферментов являются ионы Са2+, Na+, Mg2+ (A. Chopra et al., 1981; H. Chander et al., 1980; K. Amada et al., 2001). При этом ионы Са2+ могут как входить в состав структуры Са-зависимых ферментов, так и служить косвенными активаторами, предотвращая ингибирование липолиза конечными продуктами - жирными кислотами.
13
В.Л. Дьяков и др. (1980) исследовали активацию панкреатической липазы под действием раствора додецилсульфоната натрия. Методом гель-фильтрации установлено, что липаза под действием детергента образует ок-тамер. Установлено, что октамер липазы при оптимальной концентрации детергента содержит 6 активных центров.
Активацию липазы вызывает добавление в реакционную среду таких веществ, как некоторые неорганические соли и диоксан. Авторы объясняют процесс активирования фермента структурными:перестройками воды (А.В. Еленский и др., 1986).
В последние годы рядом авторов отмечается тенденция микробных липаз к самоагрегации, при этом моно- и бимолекулярные структуры обнаруживают значительные различия в термо-, рН-стабильности и кинетических характеристиках липолиза (G. Fernandez-Lorente et al., 2003; I: Palomo et al.,. 2003). Би- и мономолекулярные структуры обнаруживают следующие функциональные особенности:
1) специфическая активность липазы уменьшается при увеличении концентрации фермента;
2) термостабильность бимолекулярной формы на 5-10 "С выше моно* молекулярной;
3) энантиоселективность фермента в обоих случаях определяется концентрацией последнего.
Предполагается, что бимолекулярная структура липаз может формироваться двумя молекулами фермента в открытой конформации (поверхностно активированных) и представляет собой один из вариантов олигомерной структуры.
1.2. Особенности структуры и механизма действия эстераз
При исследовании особенностей структуры липолитических ферментов установлена сложная природа их молекул. Изучение химического состава
14
многих микробных липаз показывает наличие в их молекулах небелковой части.
Так, липаза из Rhizopus arrhizus является гликопротеидом (молекулярная масса 43 кДа), содержит 13-14 молекул маннозы и 2 молекулы гексоза-мина на одну молекулу белка (М. Semeriva et al., 1989).
К.Д. Даврановым и др. (1979) получен высокоактивный препарат липазы с молекулярной массой 43 кДа, содержащей углеводную часть. При хранении (+4° С) в водном растворе липаза А переходит в катионную форму (липаза В) с молекулярной массой около 30 к Да, не содержащую углевод.
С. Garner, L. Smith (1979) обнаружили в составе липазы поджелудочной железы свиньи 3,8 моль маннозы и 2,9 моль N-ацетилглюкозамина на 1 моль белка. Липаза из панкреатического сока человека по данным A. de Саго et al. (1977) отличается большим разнообразием углеводной части и содержит 4,7 моль глюкозамина, 2,8 моль маннозы, 3,0 моль галактозы, 1,1 моль глюкозы. 2 цепи маннозы входят в состав углеводного компонента молекулы ли-попротеинлипазы (Н. Masuno et al., 1990).
Общая черта всех гликопротеинов - наличие углевод-белковой связи. Олигосахариды присоединяются лишь к немногим боковым цепям аминокислотных остатков ферментов. Чаще всего в образовании связи участвует N-ацетилглюкозамин и амидная группа аспарагина. К остатку N-ацетилглюкозамина присоединяются остальные моносахариды.
Другой тип взаимодействия олигосахаридов с полипептидной цепью — ¦ О-гликозидная связь. Для нее характерно присутствие дисахарида галактозы, к которому часто прикрепляется N-ацетилнейраминовая группа. Дрожжи и плесневые грибы, как правило, синтезируют гликопротеины с О-гликозидной связью, в которых углеводные цепи связаны через маннозу с остатками сери-на и треонина.
Олигосахаридные части немембранных белков имеют большое значение для функционирования клетки, являясь, в частности, факторами, опреде-
15
ляющими секрецию белков из клетки, их появление во внешней среде и окончательное удаление из системы в результате процесса деградации.
Большинство микробных липаз являются металлоферментами; в качестве кофакторов выступают, как правило, атомы кальция, в некоторых случаях - магния и цинка. Чаще всего лигандами ионов двухвалентных металлов являются остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот (М. Tamura et.al., 2004). Модифицация Са-связывающего центра путем снижения значения рН или посредством мутации лиганда Asp (Glu) приводит к понижению стабильности белка, а также нарушает локальную структуру, расположенную вблизи активного центра (М. Noble et al., 1993). Вклад ионов Са2+ в процесс фолдинга липаз подкласса 3.1 изучен в работе К. Amada et al. (2001). Термический анфолдинг липазы Pseudomonas cepacia при увеличении концентрации ионов Са2+ протекает при более высоких температурах, согласно данным дифференциальной сканирующей калориметрии (A. Tanaka et al., 2003).
М. Nardini et al. (2003) показано, что октаэдрически координированный ион Са2+ принимает участие в стабилизации петли, содержащей каталитический гистидин (His251).
Молекула липазы Bacillus stearothermophilus, по данным S. Jeong et al.. (2002) содержит Zn-координационный домен, функционирование которого обеспечивает ферменту такие свойства, как термостабильность и кислотоста-бильность.
Впервые аминокислотная последовательность липазы была установлена J. de Саго et al. (1981) сочетанием методов Эдмана и гидролиза фермента трипсином, химотрипсином и протеазой. Посредством фрагментации бром-цианом получены 5 пептидов. Полная первичная структура панкреатической липазы свиньи представлена 449 аминокислотными остатками с N-концевым Ala и С-концевым Val и не обнаруживает значительной гомологии с аминокислотной последовательностью панкреатической липазы и колипазы, описанных ранее (М. Charles et al., 1974).
16
К настоящему времени осуществлено секвенирование ряда липолити-ческих ферментов из разнообразных источников: панкреатической и желудочной липаз человека и млекопитающих, липазы, чувствительной к гормонам, липазы печени, бактериальных, плесневых и дрожжевых эстераз. Установлено, что в молекулах липаз из ацидофильных организмов содержится значительно больше остатков Asp и Glu, меньшее — Lys и Arg; термофильная липаза Bacillus stearothermophilus характеризуется высоким содержанием триптофана (S. Sinchaikul et al., 2001).
Липазы, выделенные из различных микроорганизмов, отличаются не только по составу небелковой части, но и N-концевыми аминокислотами. Липаза из Rhizopus microsporus в качестве N-концевых остатков содержит лейцин, глицин, липаза из Rhizopus arrhizus - аспарагиновую кислоту (К.Д. Давранов и др., 1978; М. Semeriva et al., 1989). Высокая аффинность липоли-тических ферментов к субстратам в значительной степени определяется характером боковых групп аминокислотных остатков в молекуле белка, с этим фактом связано высокое содержание гидрофобных аминокислот в первичной структуре липаз.
Во вторичной структуре липолитических ферментов присутствуют а-спирали, 3,10-спирали, (3-листы, у-повороты, аморфные участки; л-спирали не найдены.
Липазы относятся к группе сс/р4 гидролаз, для которых характерны следующие особенности. Центральный участок в архитектуре глобулы сформирован структурой из нескольких (от 5 до 8) параллельных р-листов, у которой располагаются в той или иной топологии а-спиральные участки (G. Dodson et al,1992). Аминокислотные последовательности имеют довольно низкую степень гомологии за исключением области вблизи каталитического серина.
В настоящее время с помощью метода рентгеноструктурного анализа установлено, что молекулы липолитических ферментов из разных источни- ков характеризуются супервторичной структурой, представленной различ-

 Часть из работы     Получить работу