4.2.2. Влияние селективного Д1-антагониста SCH23390 на динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба.
4.2.3. Влияние селективного Д2-антагониста раклоприда на 119 динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба
4.2.4. Влияние Д4-антагониста клозапина на динамику развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба.
4.3. Влияние веществ, модулирующих дофаминергическую передачу 129 мозга, на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.1. Эффект d-амфетамина на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.2. Эффект сиднокарба на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.3. Влияние селективного антагониста Д1-подтипа рецепторов 131 SCH23390 на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.4. Влияние селективного антагониста Д2-подтипа рецепторов 135 раклоприда на локомоторную активность мышей С57В1.
4.3.5. Влияние антагониста Д4-подтипа рецепторов клозапина на 137 локомоторную активность мышей С57В1
4.4. Сравнительный анализ влияния d-амфетамина и сиднокарба на 143 локомоторную активность и паттерны экспрессии белка c-Fos в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c
4.4.1. Изучение эффектов d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность мышей линий С57В1 и BALB/c
4.4.2. Эффект однократного введения d-амфетамина и сиднокарба 145 на уровень экспресии белка c-Fos в структурах мозга мышей двух линий
5. Заключение 154
6. Выводы 163
7. Список сокращений 165
8. Список цитируемой литературы 166
1. Введение.
Психомоторные стимуляторы до настоящего времени находят применение в клинической практике при лечении ряда психоневротических расстройств, таких как адинамические, анергические и апатические состояния, нарколепсия, а также синдрома гиперактивности с нарушением внимания у детей. Вещества, близкие по структуре к фенилалкиламинам применяются для коррекции избыточного веса [Машковский, 1993; Арушанян, 2003; Holmes, 1995; Poulin, 2001].
Вместе с тем, использование психостимуляторов в значительной степени ограничено наличием серьезных побочных эффектов (периферическое симпатомиметическое действие, возможность развития моторной гиперактивности, агрессивных реакций, психотических шизофреноподобных состояний с бредом и галлюцинациями, нарушения аппетита и сна, нейротоксический потенциал).
Существенной особенностью фармакологического спектра психомоторных стимуляторов является характерный эйфоризирующий эффект, с которым связан высокий риск развития физической и психической зависимости. Указанное обстоятельство является причиной широкого немедицинского использования психостимуляторов, что влечет за собой развитие наркомании.
Наиболее распространенными психостимуляторами являются представители группы фенилэтиламина (d-амфетамин, метамфетамин, катинон, метилфенидат и их многочисленные структурные производные). Близким по действию к фенилэтиламинам является растительный алкалоид кокаин.
Медицинское, а особенно немедицинское применение психостимуляторов в последние годы постоянно растет, представляя собой серьезную социальную
проблему. Так, по данным зарубежной статистики, немедицинское потребление амфетаминов среди подростков в США и Канаде в период 80-90х годов прошлого века выросло в 1,5-2 раза [Poulin, 2001]; в то же время число людей, официально зарегистрированных в качестве потребителей кокаина в США оценивается приблизительно в 25 млн человек [Lange and Hillis, 2001].
Таким образом, одной из актуальных задач современной психофармакологии является изучение тонких механизмов, лежащих в основе психостимулирующего и нейротоксического действия соединений данной группы. Не менее важной задачей психофармакологии представляется создание нетоксичных заменителей амфетаминов с одной стороны, и веществ эффективных для профилактики и лечения патологических состояний, связанных с хроническим приемом психостимуляторов.
Механизм действия наиболее популярных психомоторных стимуляторов (кокаин, амфетамины) тесным образом увязывается с их способностью влиять на состояние катехоламинергической нейропередачи мозга [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Berke et al., 1998; Jones et al., 1998]. В частности, принято считать, что развитие психостимулирующего эффекта амфетамина и его аналогов, в значительной степени, обусловлено воздействием на процесс «обратного захвата» пресинаптическими нервными окончаниями. Другими вероятными «мишенями» действия психостимуляторов являются стимуляция перераспределения внутриклеточного нейротрансмиттера из везикулярного «депо» в цитоплазму, а также прямое ингибирование активности моноаминооксидазы (ключевого фермента метаболизма дофамина) [Cho and Segal, 1994; Jones et al., 1998].
Многочисленные исследования, проведенные в последнее время, подтвердили высказанное ранее предположение, согласно которому
нейрохимической основой механизма действия амфетаминов является их способность избирательно связываться со специфическим мембранным белком -дофаминовым транспортером (ДАТ), обеспечивающим процесс обратного захвата (re-uptake) нейротансмиттера из синаптической щели в нервные окончания дофаминергических нейронов соответствующих структур мозга.
Результатом этого является значительное возрастание внеклеточной концентрации дофамина и усиление функциональной активности дофаминергической нейропередачи [Seiden et al., 1993; Cho and Segal, 1994; Jones etal., 1998].
Недавние исследования, выполненные на мышах с делецией гена ДАТ (так называемые ДАТ-нокаутированные мыши) показали, что эти животные характеризуются повышенной локомоторной активностью, значительно более высоким уровнем внеклеточного дофамина и состоянием длительной гиперактивации дофаминовых рецепторов. Обнаружено также, что ДАТ-нокаутированные мыши неадекватно реагируют на амфетамин: введение психостимулятора этим животным не сопровождается накоплением внеклеточного дофамина, а изменения на поведенческом уровне характеризуются парадоксальным успокаивающим ответом, который предположительно связан с ингибиторным влиянием психостимулятора на серотониновый мембранный транспортер [Jones et al., 1998; Gainetdinov et al., 1999].
В клинической практике получены доказательства генетического полиморфизма ДАТ, ассоциированные с той или иной патологией мозга.
Все вышеизложенное позволяет заключить, что именно механизм регуляции функциональной активности дофаминового транспортера является ведущей «мишенью» фармакологических воздействий, модулирующих
эффективность нейропередачи, в частности - действия амфетаминоподобных стимуляторов.
По мере высвобождения во внеклеточное пространство, дофамин способен взаимодействовать со специфическими дофаминовыми рецепторами, инициируя активацию таких процессов, как запуск каскадов вторичных мессенджеров, изменение проницаемости Na+-, K+-, Са2+ - каналов, индукцию генов раннего ответа и т. д., что опосредует клеточный ответ [Missale et al., 1998].
Традиционно дофаминовые рецепторы подразделяют на 2 основных семейства: Д2-подобные (включает Д2-, ДЗ- и Д4-рецепторы) и Д1-подобные (содержит Д1- и Д5-рецепторы, соответственно). Отличительной особенностью Д2/ДЗ дофаминовых рецепторов считается их локализация на самих дофаминергических нейронах, что, очевидно, подразумевает ауторецепторную функцию.
В последнее время, применение различных фармакологических и генетических манипуляций позволило выявить наличие сложной регуляторной взаимосвязи между дофаминовым транспортером и Д2-подтипом дофаминовых рецепторов. В частности было показано, что введение Д2-антагониста раклоприда значительно удлиняет время клиренса дофамина в структурах мозга крыс, обнаруживая тем самым непосредственное модулирующего влияние со стороны Д2-подтипа дофаминовых рецепторов на функциональную активность дофаминового транспортера. [Cass et al., 1994]. С другой стороны, стимуляция Д2-рецепторов опосредует повышение скорости работы ДАТ и обратного захвата дофамина (по-видимому, через К+-опосредованную гиперполяризацию нейрональной мембраны) [Lacey et al., 1987; Malenka et al., 2000].
Использование методики внутримозгового микродиализа на свободно-подвижных животных, позволяющей оценить in vivo изменения нейрохимических параметров (внеклеточного содержания нейротрансмиттеров и их основных метаболитов) в условиях комбинированного введения Д2-антагонистов и соединений, вызывающих функциональную блокаду «обратного захвата» дофамина дало противоречивые результаты [Sharp et al., 1986; Pehek, 1999; Rahman et al., 2001a]. Принципиальную роль, как предполагается, в этом случае может играть механизм «отрицательной обратной связи», опосредованный участием Д2-ауторецепторов [Iravani and Kruk, 1995; Schmitz et al., 2001].
Тем не менее, истинная роль как пре-, так и постсинаптического рсцепторного компонента в механизме действия психостимуляторов изучена явно недостаточно.
Планируемое в данной работе детальное изучение возможной роли отдельных подтипов дофаминовых рецепторов в нейрохимических и фармакологических эффектах соединений психостимулирующего типа, открывает принципиально новый подход к изучению данной проблемы.
Наряду с хорошо известным психостимулятором d-амфетамином, в представленной работе использовался оригинальный отечественный препарат сиднокарб (З-(р-фенилизопропил)-М-фенилкарбамоилсиднонимин). Сиднокарб обладает сходным с амфетамином спектром фармакологической активности, при умеренном побочном действии. Известно также, что в отличие от амфетамина сиднокарб не угнетает активность МАО. Важным шагом вперед в изучении механизма действия пихостимуляторов явилось применение метода внутримозгового микродиализа [Андяржанова и соавт., 1999; Zetterstrom et al., 1983; Gainetdinov et al., 1997; Afanas'ev et al., 2001]. Эти исследования показали,
10
что сиднокарб по ряду показателей существенно отличается от амфетамина [Gainetdinov et al., 1997; Anderzhanova et al., 2000; Afanas'ev et al., 2001]. Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы явилось изучение функциональной роли рецепторного звена дофаминергической нейропередачи мозга, в том числе участие отдельных подтипов дофаминовых рецепторов, в механизме действия психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба. Для достижения этой цели в исследовании были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на динамику изменения внеклеточной концентрации дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК) в дорзальном стриатуме свободноподвижных крыс in vivo.
2. Оценить влияние антагонистов Д1-, Д2- и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение внеклеточного уровня дофамина и его метаболитов (ДОФУК и ГВК), обусловленное введением психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба.
3. Оценить эффекты антагонистов различных подтипов дофаминовых рецепторов на динамику стереотипного поведения крыс, вызванного психостимуляторами.
4. Оценить вклад отдельных подтипов дофаминовых рецепторов (Д1, Д2 и Д4) в механизмы формирования локомоторной гиперактивности, обусловленной воздействием d-амфетамина и сиднокарба.
5. Изучить эффекты психостимуляторов d-амфетамина и сиднокарба на локомоторную активность и паттерн экспрессии белка c-Fos (продукта «раннего гена» c-fos) в мозге мышей инбредных линий С57В1 и BALB/c
Научная новизна.
и
В данной работе впервые продемонстрировано различное влияние Д1, Д2 и Д4-подтипов дофаминовых рецепторов на изменение дофаминергической нейропередачи в стриатуме крыс линии Вистар (in vivo), обусловленное введением оригинального психостимулятора сиднокарба. Впервые проведен сравнительный анализ участия отдельных подтипов (Д1, Д2 и Д4) дофаминовых рецепторов в механизме развития стереотипного поведения, вызванного введением d-амфетамина и сиднокарба. С помощью методики регистрации двигательной активности животных в установке "Opto-Varimex", впервые продемонстрировано неодинаковое вовлечение Д1, Д2 и Д4 дофаминовых рецепторов в механизм локомоторной гиперактивности, вызванной введением d-амфетамина и сиднокарба. В представленной работе впервые продемонстрирована экспрессия белка Fos (продукта гена «раннего ответа» c-Fos) в мозге мышей инбредных линий, вызванная острым введением психостимулятора сиднокарба. Теоретическая и практическая значимость.
Был проведен сравнительный анализ изменения нейрохимических и поведенческих параметров в условиях воздействия психостимуляторами d-амфетамином и сиднокарбом. Продемонстрированы значительные отличия в участии дофаминовых рецепторов Д1-, Д2- и Д4-подтипов в механизме психостимулирующего действия. Учитывая сниженный риск возникновения лекарственной зависимости, а также менее выраженные побочные эффекты отечественного психостимулятора по сравнению с d-амфетамином, выяснение тонких механизмов действия этих соединений вносит существенный вклад в определение стратегии направленного поиска агентов обладающих необходимым психостимулирующим спектром действия, при сниженном риске возникновения побочных эффектов.
12
Апробация работы.
Результаты исследований были доложены и обсуждены на 5th ECNP Regional Meeting, С.-Петербург, Россия, 2000, на VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии», Россия, Казань, 2001, на XXIII Congress of Neuropharmacology, Montreal, 2002, Международном симпозиуме «Neuron differentiation and plasticity - regulation by intercellular signals», Москва, Россия, 2003, Ежегодной Всероссийской конференции «Человек и лекарство», Москва, Россия, 2003, на лабораторных и межлабораторных семинарах НИИ Фармакологии РАМН. Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 публикациях (8 тезизов и 3 статьи).
13
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Дофаминергические системы мозга
Являясь метаболическим предшественником двух важнейших нейротрансмиттеров нервной системы (норадреналина и адреналина), дофамин долгое время рассматривался только с этих позиций. Однако, в конце 50-ых годов прошлого века, с помощью биохимических методов было выявлено его перманентное присутствие в ряде мозговых образований, причем уровень содержания дофамина значительно варьировал от структуры к структуре (так, основным «хранилищем» запасов дофамина оказался corpus striatum). Это позволило предположить у него наличие собственной нейротрансмиттерной функции [Carlsson, 1959]. Вместе с тем, полученные данные не могли ответить на вопрос относительно точной клеточной локализации дофамина -нейротрансмиттер мог быть локализован и в клетках глии.
Применение метода флуоресцентной гистохимии (техника Фалька-Хилларпа) позволило выявить концентрирование катехоламина в гранулах варикозных окончаний именно нервных клеток [Carlsson, 1987]. Последующее интенсивное развитие более точных методов визуализации дофамина и других моноаминов (норадреналина, серотонина) в центральной нервной системе животных позволило провести детальное картирование скоплений тел нервных клеток, содержащих этот нейропередатчик, а также их основные проекции [Hokfelt et al, 1984; Lindvall and Bjorklund, 1987].
В настоящее время, на основе данных нейроанатомии принято выделять 4 основные дофаминергические системы мозга (Рис. 1): нигростриатную, тубероинфундибулярную, мезолимбическую и мезокортикальную [Раевский, 1996; Missale et al., 1998]; однако, ряд авторов считает целесообразным
14
Internal capsule
Nucleus
accumbens
Olfactory / Globus tubercule pallidus
Substantia
lgra
Medial pars reticulata
forebrain
bundle
Nucleus accumbens Olfactory ' tubercule
Hippocampus
A10
Nucleus Olfactory accumbens tubercule
A12
Ventral tegmental area
Рис. 1. Основные дофаминергические системы мозга.
(А - нигростриатная; Б - мезолимбическая; В- мезокортикальная; Г тубероинфундибулярная) [по R.S. Feldman et al., 1997; с изменениями].
15
объединять две последние в единую мезолимбокортикальную систему [Emilien et al., 1999; Nestler et al., 2001]. Необходимо также отметить, что в литературе довольно часто используется цитоархитектоническое разделение дофаминергических систем мозга на мезотеленцефалическую и диэнцефалическую, которые, в свою очередь, образованы более частными подсистемами [Feldman et al., 1997]
2.1.1. Нейрохимия дофаминергической нейропередачи
Процесс биосинтеза дофамина изучен достаточно подробно. Исходным субстратом для него является L-тирозин, который гидроксилируется внутринейронально в Ь-3,4-диоксифенилаланин (L-ДОФА) при участии ключевого фермента синтеза - тирозингидроксилазы. Далее L-ДОФА образует дофамин под действием декарбоксилазы L-ароматических аминокислот (ДААК). Весь процесс ферментативного синтеза дофамина динамически регулируется на разных стадиях с вовлечением разветвленных цепей, функционирующих по принципу «обратной связи» [Cooper et al., 1991; Feldman et al., 1997; Nestler et al., 2001].
Дофамин, содержащийся в нервном окончании дофаминергического нейрона, подвергается процессу компартментализации. Согласно одной из общепринятых классификаций [Justice et al., 1988; Arbuthnott et al., 1990] выделяют три основных «пула» дофамина: 1) новосинтезируемый дофамин высвобождается путем экзоцитоза при деполяризации нервного окончания. Этот пул истощается альфа-метил-р-тирозином (блокатором синтеза дофамина) и нечувствителен к действию резерпина, который вызывает опустошение нейрональных запасов катехоламинов. 2) везикулярный пул дофамина, являясь
16
основным местом хранения нейротрансмиттера внутри терминали, по-видимому, не принимает участия в потенциал-зависимом высвобождении нейротрансмиттера и истощается под действием резерпина, оставаясь устойчивым к эффектам альфа-метил-р-тирозина. За счет этого пула восполняется дофамин, высвобождающийся путем экзоцитоза, если скорость его высвобождения преобладает над скоростью синтеза. 3) третий, цитоплазматический, пул дофамина, непосредственно участвует в процессах высвобождения и обратного захвата нейротрансмиттера.
lyrosine Tyrosine hydroxylase
Presynaptic terminal Postsynaptic target
Рис. 2. Модель дофаминергического синапса (из Malenka et al., 2000) Осн. обозначения: Di_s - подтипы рецепторов дофамина; Tyrosine hydroxylase -
тирозингидроксилаза; МАО моноаминооксидаза; СОМТ -катехол-О-аминотрансфераза; VMAT -- везикулярный транспортер моноаминов; Dopamine transporter - мембранный транспортер дофамина (ДАТ)
Существует и альтернативная модель депонирования дофамина (Рис. 2), в которой рассматриваются два основных пула нейротрансмиттера:
17
лабильное депо (цитоплазматический пул) и стабильное депо (везикулярный пул) [Leviel et al., 1989].
Высвобождаясь из варикозных окончаний нейронов в синаптическую щель, нейротрансмиттер взаимодействует с дофаминовыми рецепторами, локализованными как пре-, так и постсинаптически (см. ниже) и/или инактивируется во внеклеточном пространстве, либо после захвата прилегающими глиальными клетками. Значительная часть дофамина интенсивно закачивается из внеклеточного пространства обратно в нейрон при участии специфического переносчика (дофаминового транспортера) и подвергается внутринейрональному метаболизму [Cooper et al. 1991; Feldman et al., 1997].
Основными ферментами, катализирующими реакции превращения моноаминов, являются моноаминоксидаза (МАО) и КОМТ (Рис.2). Главные метаболиты дофамина - 3,4-диоксифенилуксусная кислота (ДОФУК), образующаяся из дофамина под действием МАО и гомованилиновая кислота (ГВК), в меньшей степени - 3-метокситирамин [Zetterstrom et al., 1988]. В отличие от ДОФУК, два последних метаболита образуются внеклеточно при участии КОМТ [Cooper et al. 1991; Feldman et al., 1997].
В поддержании и регуляции необходимого гомеостаза дофаминергического нейрона важную роль играют специфические переносчики данного катехоламина - дофаминовый транспортер (ДАТ) и везикулярный моноаминовый транспортер (ВМАТ) [Miller et al., 1999; Fumagalli et al., 1999; Gainetdinov and Caron, 2002].
Первый принадлежит к семейству NaVcr-зависимых субстратспецифичных нейрональных транспортеров и представляет собой мембранно-локализованный белок, обеспечивающий функцию обратного захвата дофамина из внеклеточного пространства. ДАТ играет ключевую роль в поддержании нейрохимического |
