СПИСОК СОКРАЩЕНИИ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
АО. - аминокислотный остаток
АГ - аппарат Гольджи
ЛД50 - молярная концентрация ферментативной субъединицы в
составе цитотоксического агента, при которой наблюдается
гибель 50% клеток КИ50 - молярная концентрация цитотоксического агента, при которой
наблюдается 50% ингибирование включения в клетки [3Н]
тимидина или [14С]лейцина РИБ - рибосом-инактивирующие белки
РИБ-1 - рибосом-инактивирующие-белки первого типа, содержащие
одну субъединицу
РИБ-П - рибосом-инактивирующие белки второго типа, содержащие две субъединицы
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
МЫ - вискумин - mistletoe lectin I токсин из омелы I
MLII - mistletoe lectin II, токсин из омелы II
MLIII - mistletoe lectin III, токсин из омелы III
MLA - А-субъединица вискумина
MLB - В-субъединица вискумина
RTA - А-субъединица рицина
RTB - В-субъединица рицина
SO6 -сапорин
ВВЕДЕНИЕ
Одним из наиболее важных направлений развития новых биотехнологий является создание фармакологических препаратов, обладающих высокой специфичностью действия на клетки или молекулы-мишени в организме. В настоящее время именно белки или их конъюгаты привлекают особый интерес исследователей при конструировании высокоселективных лекарств. Активно изучаются с этой точки зрения растительные токсины, которые полностью останавливают синтез белка в клетке, переводя рибосомы в неактивное состояние. Эти токсины носят общее название рибосом-инактивирующих белков (РИБ).
Рибосом-инактивирующие белки разделяются на два типа: РИБ-I, которые состоят только из одной каталитической (active, А), субъединицы и РИБ-П, которые содержат как каталитическую (А), так и связывающую (binding, В) субъединицы [Barbieri et al., 1993]. А-субъединица обеспечивает инактивацию рибосомы, связываясь со специфическим участком (сарцин-рициновой петлей) 28S рРНК рибосомы эукариот и выщепляя аденин. Поскольку модифицированная таким образом рибосома теряет сродство к фактору элонгации транскрипции, это приводит к остановке синтеза белка клеткой и в результате к гибели клетки [Lord et al., 1991]. В-субъединица, являясь лектином, связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и обеспечивает проникновение токсина в клетку. Высокая цитотоксическая активность РИБ-П является основной причиной использования их для создания иммуннотоксинов - лекарств нового поколения, главным образом противоопухолевого действия.
Помимо цитотоксических свойств белки этой группы проявляют в различной степени способность агглютинировать клетки за счет своей лектиновой активности. Кроме того, некоторые из них обладают и иммуномодулирующими свойствами.
Аминокислотные остатки, входящие в каталитический центр А-субъединиц, являются консервативными среди данного семейства; во многом сходно и
строение углевод-связывающих центров В-субъединиц. Однако, эффективность цитотоксического действия различных белков этого класса существенно различается. Сравнительный анализ структурных и функциональных свойств родственных рибосом-инактивирующих белков - один из эффективных подходов к выяснению механизмов, определяющих различия в их биологической активности. Понимание структурных особенностей, влияющих на цитотоксическую активность данных белков, необходимо также для получения эффективных препаратов иммунотоксинов на их основе.
Целью данной работы является определение пространственных структур тетрамерных рибосом-инактивирующих белков второго типа - вискумина (ML-I) из Viscum Album и агглютинина из Ricinus communis - и выявление структурных особенностей, влияющих на биологическую активность данных белков.
Глава 1. Обзор литературных данных 1.1 Каталитические А-субъединицы белков, инактивирующих рибосому
Как было отмечено ранее, РИБ-1 содержат только одну А-субъединицу и, следовательно, имеют менее сложную структуру, чем РИБ-П. Однако исторически сложилось так, что первой была получена кристаллическая структура рицина, принадлежащего к РИБ-П, и все последующие структуры РИБ сравнивались с ней. Исходя из этого, представляется более правильным рассмотреть в обзоре сначала подробно рицин и рибосом-инактивирующие белки второго типа, а затем сравнить А-субъединицы РИБ-I и РИБ-П.
1.1.1 Структура и ферментативная активность А-субъединицы рицина.
А-субъединицы РИБ-П расщепляют N-гликозидную связь аденина А4324 28S РНК эукариот [Endo et al., 1987]. Модифицированная таким образом рибосома не способна синтезировать белок, так как утрачивает сродство к фактору элонгации транскрипции [Lord et al., 1991].
Были изучены структурные элементы рибосомной РНК, которые узнаются и подвергаются катализу РИБ-И [Gluck et al., 1994]. Все выщепляемые остатки аденина расположены в петле двойной спирали рибосомной РНК, включающей специфический тетрануклеотид GAGA. Это свидетельствует о том, что РИБ распознают эту специфическую структуру в рибосомах клеток. Для депуринизации очищенной 28S рРНК, ее 5'фрагмента или синтетического олигонуклеотида с консервативным участком 28S рРНК, имитирующим нуклеотидную последовательность сайта депуринизации в целой рибосоме, требуются более высокие концентрации токсина [Endo et al.,1988]. Так, для рицина было показано, что ккат интактной 28S рРНК в составе рибосомы в 105 раз выше, чем для изолированной 28S рРНК. А-субъединицы растительных токсинов способны инактивировать до 1500 рибосом в минуту [Eiklid et al., 1980]. Несмотря на то, что последовательность в 28S рибосомной РНК, которая непосредственно окружает выщепляемый с помощью А-субъединицы аденин, в целом консервативна во всех типах рибосом, чувствительность рибосом
8
разного происхождения к депуринизации токсинами заметно различается. Рибосомы клеток млекопитающих и дрожжей особенно чувствительны к РИБ-П, растительные рибосомы гораздо менее чувствительны к РИБ, а рибосомы прокариот полностью резистентны [Lord et al., 1991].
В таблице 1 приведены сравнительные характеристики цитотоксической активности различных РИБ-П.
Таблица 1. Токсические свойства рибосом-инактивирующих белков II типа (взято из Barbieri, 1993).
Токсин Бескл.система КИ502, пМ Целые клетки ЛД50, пМ
Рицин А-цепь рицина 84 од 0,0011 >0,4
Абрин А-цепь абрина 88 0,5 0,0039 >0,4
Вискумин А-цепь вискумина 43,3 3,5 0,008
Модецин А-цепь модецина 45 2,3 0,0003
Волкенсин А-цепь волкенсина 84 0,37 0,0123
Эбулин1 0,14 >100
Нигрин ОД >100
1. Редуцированный токсин
2. Молярная концентрация цитотоксического агента, при которой наблюдается 50% ингибирование включения в клетки [ Н] тимидина или [14С]лейцина
Наиболее детально изученной в настоящее время является структура рицина. Данные рентгеноструктурного анализа этого белка лежат в основе представлений о строении РИБ-П и используются для определения структуры других РИБ-П методом молекулярного замещения.
А-субъединица рицина представляет собой глобулярный белок (Рис.1). Ее структура сформирована тремя доменами, при этом 1-й домен включает аминокислотные остатки 1-117, 2-й домен - 118 -199 и 3-й домен - 200-267. Домен 1 содержит восемь /3-тяжей и две ос-спирали (А и В). Второй домен включает
пять а-спиралей C-G. Спираль Е наиболее протяженная и проходит через центр А-субъединицы. Она содержит ключевые аминокислотные остатки, участвующие в ферментативном катализе - Glul77 и Argl80. И, наконец, третий домен образован двумя антипараллельными Р-слоями и двумя а-спиралями. Этот домен содержит высоко гидрофобный С-концевой участок 246-256, который, как предполагается, принимает участие в транслокации А-субъединицы через мембрану в процессе внутриклеточного транспорта белка [Robertas et al., 1991].
Второй домен
Третий
домен
Рис 1. Пространственная структура А-субъедингщы рицина (А) и ее подоменное представление (Б).
10
В активном центре А-субъединицы рицина локализованы аминокислотные остатки Туг80, Туг123, Glul77, Argl80 и Тгр211, имеющие ключевое значение для ферментативной активности белка [Monzingo and Robertas, 1992]. Данные а.о., как свидетельствует сравнение аминокислотных последовательностей, являются инвариантными среди группы известных на сегодняшний день РИБ, включая токсины бактериального происхождения. (Табл.2). Функционально важное значение этих а.о. подтверждают также данные, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза.
Таблица 2. Сравнение аминокислотных последовательностей белков, инактивирующих рибосому.
Сокращения : 2AAI_RIC - рицин из Ricinus communis (PDB ID 2AAI), 1RZO_AGG -агглютинин из Ricinus communis (PDB ID 1RZO), 1SZ6_VIS - вискумин из Viscum Album (PDB ID 1SZ6), 1TFM_HIM - Himalayan mistletoe из Viscum album (PDB ID 1TFM), 1ABR_ABR - абрин из Abrus precatorius (PDB ID 1ABR), 1HWM_EBU - эбулин из Sctmbucus ebulus (PDB ID 1HWM), 1MRJ_A_T трихосантин (TCS) из Trichosanthes kirilowii (PDB ID 1MRJ), 1MOM_MRD - момордин из Momordica charantia (PDB ID 1MOM), 1CF5_B-MC /3-моморчарин из Momordica charantia (PDB ID 1CF5), 1MRH_A_MC a-моморчарин из Momordica charantia (PDB ID 1MRH), 1NIO_B-LU - /3-люфин из Luff a cylindrica (PDB ID 1NIO), 1BRY_BRY - бриодин из Bryonia dioica (PDB ID 1BRY), 1 J1R_POK — антивирусный белок лаконоса (PAP) из Phytolacca americana (PDB ID 1J1R), 1QI7_SAP - сапорин из Saponaria officinalis (PDB ID 1QI7).
11
2AAI. _RIC
1RZ0" "agg
lszs" _vis
itfm" "him
lABR ABR
1HWM "ebu
1MRJ _A T
imom" "mrd
1CF5~ "b-mc
imrh" "a mc
INIo" B-LU
ibsy" "bry
uir] _POK
1QI7" SAP
IFPKQYPIINFTTAGATV-CS IFPKQYPIINFTTADATV-ES
----------YERLSLRTVQQTTGAE
----------YERLDLDVTSQTTGEE
--------EDRPIKFSTEGATE-QS
------IDYPSVSFNLAGAKE-TT RD
--------------DVSFRLSGATE-SS
--------------DVSFRLSGADP-RS
--------------DVNFDLSTATA-KT
---DVSFRLSGADP-RS
--ANVSFSLSGADE-KS —MDVSFRLSGATT-TS -INTITFDAGNATI-NK -VTSITLDLVNPTA-GQ
GV
ITLL
4D
60
GRLTTGADVRHEIPVLP-NRVGLPINQRFIL : 59
SHLTTGADVRHEIPVLP-NRVGLPISORFIL : 5 9
DFVSSGS-FSNNIELLRQSTIPVSEGSRFVL : 55
DYVSSGS-FSNEIPLLRQSGGGV-EAARFVL : 54
ERLRGGL—IHDIEVLPDPTTLQ-ERNRYIT : S3
DRVATGTYEVNGLPVLR-RESEVQVKNRFVL : 5 6
KALPNER-KLYDIPLLRESLPGS---QRYAL : 49
NALPERE-KVYNIPLLLPSVSGA---GRYLL : 4 9
ATLPESH-KVYDIPLLYETISDS---RRFIL : 49
SJALPFRE-KVYNIELLLPSVSGA---GRYLL : 49
SKflTAL KALPSKE-KVSNIPLLLPSASGA---3RYIL : 50
EAiPYER-KVYNIPLLRESISGS---GRYTL : SD
NEAKDPSLKCYGIPMLPNTNSTI----KYLL : SI
SIMVKDPNLKYGGTDIAVTGPPSK---EKFLR : 52
2AAI_RIC
1RZO_AGG
1SZ6_VIS
1TFM_HIM
1ABR_ABR
1HWM_EBU
1MRJ_A_T
1MOM_MRD
1CF5_B-MC
1MRH_A_MC
1NIO_B-LU
1BRY_BRY
1J1R_POK
1QI7 SAP
* BO VELSNHAELSVT LALDVT VELSNHAEL SVTLALDVT VE LTNAGGD SIT AAI DVT VELTNEGGD3ITAAIDVT VELSNSDTESIEVGIDVT VRLTNYNGDTVISAVDVT IHLTNYADE TISVAI DVT MHLFNYDGKTITVALDVT LNLTSYAYETISVAIDVT KHLFNRDGKTITVAVDVT MQbSNYDAKATTMATDVT 1HLTNYADETISVAVDVT VKLQGASLKTITLMLRRN INFQSSRG-TVSLGLKRD
* 100 * 120
WGYRAG---------NSAYFFHPDNQEDAEAITHLFTDVQN— : 113
WGCRAG---------NSAYFFHPDNQEDAEAITHLFTDVQN--- ; 113
l/VAYQAG---------QQSYFLKD-----APAGAETQDFAGTT----- : IDS
J/VAYQAG---------SQSYFLS-------------GPGTHLFTGTT----- : 100
WAYRAG---------TQSYFLRD-----APSEASDYLFTGT-D— : 103
.VAF3AN---------GNSYFFKD-----ATELOKSNLFLGT-T— : 106
CMGYRAG----------DTSYFFNEA—SATEAAKYVFKDAMR— : 101
IMGYLAD----------I13YFFNEP—AAELASQYVFRDARR— : 101
WAYRTR----------DVSYFFKE------SPPEAYNILFKGT-R— : 99
IMGYLAD----------TTSYFFNEP—AAELASQYVFRDARR— : 101
IMGYLVN----------STSYFFNES--DAKLASQY"VFKGS-T---- : 101
CMGYLAG----------DV3YFFNEA—SATEAAKEVFKDAKK— : 1D2
VMGYSDPY-DNKCRYHIFNDIKGTEYSDVENTLCPSSNER : 111
WAYLAMDNTNVNRAYYFKS--EITSAELTALFPEATTAN : 110
2AAI. 1RZO 1SZ6* 1TFM_ lABR 1НИМ
IMOM 1CF5"
ibry ijir"
1QI7
RIC AGG VIS HIM ABR EBU A_T MRD B-MC A_MC B-LU ^BRY РОК SAP
-RYTEAFGGf -SFTEAFGGf
-RSSLPFNGE >DLERYAG-
-RSSLPFNG
-QHSLPFYG1
-QHTLSFTGf
-KVTLPYSG^
-KITLPY3GJ>
-KITLPYTGH
-KITbPY3G]
-IVTLPYSG*
-KVTLPYSGh
VAKPINYNGI
140 3RLEQLAGN-DRLEQLGG—
160 * 1BD
4GPLEEAISALYYYSTGGTQLPTLARSF TGPLEDAISALYYYSTCGTQIPTLARSF DQIPL EDQLIASVTALRFP-----GGSTRTOAREI
:rlqtaagk-
-QKALEYTEt I3IEKNAQITQGDK3
KQIPL CDQLIQSVTALRFP---G-NTRTQARSI
QQIPL LQALTHGISFFRSG---GNDNEEKARTL
ESIEL
ENIPL LPALDSAITTLFYY---------NANSAAEAL
dleqyag-----------h
5dlerbahq---------s
jnietaagt---------r
:rlqtaagk
:rlqiaagk---------в
:nlqtaahk 3rlqiaagk-----
3RLQNAAGK----------VHEKIPLBFRAFDSAITSLFHY
EKIBI INIDL
PNPLDGAITSLWYD----------GG—VAESL
LPALD3AI3TLLHY-LPALS SAITTLFYY-LPALD3AISTLLHY-
ENIPL LPALD3AITTLYYY-
-DSTAAAGAL -NAQSAPEAL -D3TAAAGAL -DSTAAAGAP -TA3 3AASAL
=TLEKKAGVT-------В 4EVQL IQILSSDIGKISGQ—GSFTEKIEAKFL
KELGL IDLLLTFMEAVNKK-----ARWKNEARFL
16B 167 156 ISO 155 154 151 151 149 151 151 152 166 167
2AAI_RIC
1RZO_AGG
13Z6_VIS
1TFM_HIM
1ABR_ABR
1HKM_EBU
1HRJ_A_T
1MOM_MRD
1CF5_B-MC
1MRH_A_MC
1HIO_B-LU
1BRY_BRY
1J1R_POK
1QI7 SAP
MVC 41S
MIS M ?NP LURARQYINSGASFLPDVYMLEI ^ SNRVRVSIQTGTAFQPDAAMISI
EQEVRRSLQQLTSFTPNALMLSM EQQIGKRVDKT—FLPSLAII3I
TTA TT.
200 * 220
EGEMRTRIRYNRRSAPDPSVITL ?QY EGEMRTRIRYNRRSAPDPSVITL
FNP
x'KF
FRY
LHRARQYIN 3GA3FLPDVYMLEI.
FRY EQQIQERAYRD--EVPSLATISL ERHVAKYVATN—FKPNLAIISL
EQQIQERAYRD--EVPSLATISL EGQIIKRIPKN--EVPSPAALSI EQQIGKRVDKT—FLPSLATIS: TKY EKQVKTNFNRD—FSPNDKVLDb QULVTKNFPNK—FDSDNKVIQF
SRL IAIQES—NOGAFA : 227
5RL TAIQES—NQGAFA : 226
SQQ IQVQHS — TDGVFN : 215
;QQ TQVQQS—TEGVFN : 209
3NL RGVQES—VQDTFP : 214
5SM LEVQLSGDNVSPFS : 215
SAL KQIQIASTNHGQFE : 210
KQIQLAQGNHGIFR : 210
SAL KQIELAQNQGGKFR : 206
KQIQLAQGNNGIFR : 210
KQIQLAQTNNGAFR : 210
SAL KQIQIASTNNGQFE : 211
5KI IAIHNS--KNGALE : 223
IAIYGD-AKHGVFN : 225
2AAI_RIC
1RZO_AGG
13Z6_VIS
1TFM_HIM
1ABR_ABR
1HHM_EBU
1MRJ_A_T
1MOM_MRD
1CF5_B-MC
1MRH_A_MC
1HIO_B-LU
1BRY_BRY
1J1R_POK
1QI7_SAP
* 260 * 2B0 • 300
SPIQLQRRNGSKFSVYDVSI------LIBIIALMVYRCAPPPSSQF----------------------------
EPIQLQRRNGSKFNVYDVSI------LIPIIALMVYRCAPPPSSQF----------------------------
NPIALALPPGNWTLTNIRD------VIASLAIMLFVCGE-----------------------------------------
NPIRLAIP-GNFVTLTNVRD------VIAELAIMLFVC---------------------------------------------
NQVTLTNIRNEPVIVDSLSHP—TVAVLALMLFVCNPPN------------------------------------
GTVQLQNYDHTPRLVDNFEELY-KITGIAILLFRCVATKT----------------------------------
SEWLINAgNQRVIITNVDA------GWTSNIALLLMRNNMA----------------------------------
TPIVLVDNKGNRVQITNVTS------KWTSNIQLLI.MTRNI------------------------------------
NPVDLIKPTGQRFQVTNVD3------DWKGNIKLLLNSRASTADEN--------------------------
TPIVLVDNKGNRVQITNVTS------KWTSNIQLLLNTRNIAEGDNGDVSTTHGFSBY-
TPWIIDNKGQRVEIKDVNS------KWTNNIKLLLNKQNIA-----------------------------------
SPWLIDGNMQRVSITNASA------RWTSNIALLLNRNNIA----------------------------------
KPLELKNADGTKniVLRVDEIKPDVGLLNYVKGTCQAT--------------------------------------
KDYDFGFG----------KVRQVKD----------LQMGLLMYLGKPK--------------------------------------
267 266
249 240 251 254 247 246 249 263 247 24B 261 253
12
Представление о механизме ферментативного катализа, осуществляемого А-субъединицей, основано на данных рентгеноструктурного анализа рицина и комплекса рекомбинантной А- субъединицы рицина с аналогами субстрата: аденил (3'-5')-гуанозином и формицин монофосфатом (Рис.2), а также данных о ферментативной активности мутантных форм А-субъединицы [Monzingo and Robertus, 1992]. Эти данные позволили построить модель каталитической реакции по аналогии с детально охарактеризованным механизмом расщепления АМФ-нуклеозидазой связи между аденином и рибозой в АМФ .
Туг123
Туг80 * аденин у
Ч
гуанозин
В
Рис 2. Амнокислотные остатки, входящие в активный центр А-субъединицы рицина, А — в нашивном состоянии (PDB ID 2AAI), В - в комплексе с аденил (3 '-5')-гуанозином (PDB ID 1APG).
А.о. GM77 и Argl80, согласно принятой модели, непосредственно участвуют в механизме ферментативного катализа. Argl80 образует водородную связь с N3 атомом аденозина (протонирует его), что приводит к образованию переходного состояния и облегчает разрыв гликозидной связи N9-C1*. Glul77 поляризует молекулу воды, локализованную в активном центре, которая в свою очередь осуществляет, по-видимому, роль нуклеофила в механизме катализируемой реакции. Связь C1-N9 замещается связью С1 атома с атомом О поляризованной молекулы воды. При этом протон воды переходит к атому N9 аденозина [Monzingo
13
and Robertas, 1992]. Однако, по данным, полученным с помощью сайт-специфического мутагенеза, замена Glul77 на аланин снижает ферментативную активность только в 5 раз. В данном случае роль Glul77 может, по-видимому, выполнять а.о. Glu208, также локализованный внизу кармана [Robertus et al., 1992].
Двойной мутант Glul77Ala Glu208Asp практически не проявляет ферментативной активности, при этом мутант Glu208Asp с неизменным Glul77 проявляет активность, равную активности белка дикого типа. В тоже время замена Glul77Gln снижала активность фермента в 200 раз [Ready et al., 1991], тогда как замена Glul77Ala снижала активность только в 20 раз [Schlossman et al., 1989].
Замена аргинина на глютамин (Argl80Gln) увеличивало ИК50 (доза ингибирующая 50% активности) для рибосом Artemia salinas в 250 раз [Kirn et al, 1991]. Лизин в этой позиции (Argl80Lys) показывает уменьшение активности только в 3 раза по сравнению с белком дикого типа, что подтверждает важность заряженной группы, способной ионизироваться [Frankel et al., 1990]. В дополнение к этим мутациям, замена на гистидин снижала активность в 1000 раз [Frankel et al., 1990].
Инвариантные ароматические а.о. Туг80, Туг123 и Тгр211 также участвуют в связывании субстрата [Watanabe et al., 1992]. В комплексе рекомбинантной А-субъединицы рицина с аденил(3'-5>)-гуанозином и формицинмонофосфатом пуриновое кольцо аналога субстрата фиксируется между ароматическими кольцами Туг80 и Туг123 с помощью «стекинг»-взаимодействия. При этом плоскость пуринового кольца практически параллельна ароматическому кольцу Туг80. Положение Туг80 в комплексе отличается от его положения в свободной молекуле А-субъединицы поворотом, для которого необходим разрыв водородной связи с Glyl21.
Следует отметить, что по данным мутагенеза замена инвариантных Туг80 и Туг123 на ароматический а.о. фенилаланин снижала ферментативную активность лишь в 15 и в 7 раз соответственно [Ready et al., 1991]. Однако замена данных
14
а.о. на серии снижала активность соответственно в 160 и 70 раз [Robertas et al., 1992].
Кроме описанных инвариантных а.о. в аминокислотных последовательностях А-субъединиц РИБ-П присутствует ряд высококонсервативных аминокислотных остатков: Asn78, Argl34, Glnl73, Glu208, Asn209 и др,. которые могут играть менее специфическую роль в формировании и стабилизации структуры активного центра или в связывании с 28S рибосомной РНК [Weston S et al., 1994].
А-субъединица рицина гликозилирована по двум остаткам Asn 10 и Asn95. При этом наблюдаются две изоформы, различающиеся степенью гликозилированности А-субъединицы. Гликозилирование не оказывает существенного влияния на стабилизацию данного белка, о чем свидетельствует активность рекомбинантной негликозилированной А-субъединицы рицина [Katzin etal., 1991].
1.1.2 Моделирование ингибирования каталитической активности А-субъединииьи
Сайт-направленный мутагенез, кинетические исследования и присоединение субстратных аналогов, закристаллизованных с А-субъединицей рицина, обеспечивают ключевую информацию о механизме действия этого фермента. Связывание аденина происходит в специфичном кармане между боковыми цепями Туг80 и Туг 123 (Рис.2). Когда аденин связывается в специфичном сайте рицина, это должно сместить боковую цепь Туг 80 из кармана, повернуть ее приблизительно на 45 градусов на место, где она стыкуется с кольцом субстрата. В механизме катализа Argl 80 действует как кислота, частично протонируя основание, Glul77 стабилизирует переходное состояние, активируя молекулу воды.
Компьютерное моделирование показало [Miller et al., 2002], что птероевая кислота (pteroic acid) является вероятным ингибитором рицина, а кинетические
15
измерения подтвердили, что она умеренно ингибирует активность его А-субъединицы. Были построены модели вероятного присоединения других потенциальных ингибиторов, включая таутомеры птерина и гуанина. Данные моделирования показывают, что гуаниноподобная структура может сильно взаимодействовать с активным центром А-субъединицы рицина, и это свойство подобных структур явилось основанием для создания и синтезирования серии описанных ингибиторов. Рисунок 3 показывает схематичное представление взаимодействия между птериновой частью птероевой кислоты и специфичного кармана А-субъединицы рицина. А. В. С.
Рис.3 Схематичное представление взаимодействия адениновой части динуклеотида ApG(A), птериновой части птероевой кислоты (В). (С)-предсказанное связывание гуанина в активном сайте рицина. [Miller et al, 2002])
Различные ароматические соединения, показанные в таблице 3, были протестированы как ингибиторы рицина. Рицин узнает адениновое основание в этих соединениях и присоединяет бициклические птериновые кольца. Был протестирован один из лучших однокольцевых ингибиторов - 2,5-диамино-4,6-дигидроксипиримидин, который формирует множество водородных связей, характерных для птерина. Его КИ50 равен 2.2 тМ, подобно тому, что обнаружен
16
для неоптерина. Дня исследования взаимодействий с белком ингибитор был закристаллизован с А-субъединицей рицина и его структура определена с разрешением 2.8 A (PDB ГО 1IL5).
Таблица 3 Вероятные ингибиторы рицина (взято из Miller et ей., 2002)
2D Structure Name ICso (RTA> Resolution (A)
_ Л 11. Pteroic acad (РТА) OomM 2.30
2.5-0«amino-4,e-dihydroxypyrtonldlne (DDP) Z.2mM 2.80
о* *о 3-eifnino-pyndothiaciiazine- No inhibition N.'A
2-arTHno-6-hydroxypurwie (guaninei 0 &mM N/A
2,6-cbhydroxypunrie (xanthirte) 3-6 mM N/A
2-amino-e-hyxiix>xy-e-mercaptopurlne {d-mercaptoguai>tn«) 0.5S mM Mi'A
Thiazolopyrimidine 2 0mM Ы1А
2-amino-3 4-
-4-oxx>. 9H-pyrrolo(2.3-d]-pyrirT»chnG (9DG) UmM 2.60
2-2-amino-6-inethyi-3,4-aiHydro-4-oxo- /M- pyrralo[2.3-df-pyrtmidine ?S-metfiy)-7-deaz&guanine) 2.1 mM №A
5-amir>o-2-meihyl-€H-oxooxazoto(5.4d]pyrimidin-?-ОПВ (9OG) 0.40 mM 3.0
N-4"t2-(2-annno-4(3H)-yf)r»Wd in-6-yl >wriyi)benzoic acid о.еотм №A
s—' яоос' 5-<4-cartK>xyphenylaminometriy1)2-octanoylairenopynrolo{2.3-d]pymnidirv4<3H)-on* 0.70 mM N/A
Присоединение ингибитора 2,5-диамино-4,6-дигидроксипиримидин (DDP) к активному центру А-субъединицы рицина показано на рисунке 4. В отличие от
17
адениновых аналогов или птерина, DDP не смещает боковую цепь Туг80 из его апоферментной конформации и не может открыть специфичный карман, то есть, ту часть активного центра, которая специфически присоединяет аденин. Вместо этого, ингибитор «стекингуется» с боковой цепью Туг80 в его закрытой конформации.
У123
G121
Е177
G121
V81
V81
Е177
R180 N R180
Рис. 4 Наложение комплексов рицина с птероидной кислотой и 2,5-диамино-4,6-дигидроксипиримидин. Ингибитор показан с утолщенными связями. Атомы азота показаны в виде черных сфер, атомы кислорода в виде белых сфер. ([Miller et al, 2002])
Так как однокольцевой ингибитор не входит в специфический карман А-субъединицы рицина, он не может сформировать многие специфические связи с ферментом, что офаничило его полезность как платформы для последующих экспериментов. Поэтому работа с однокольцевыми ингибиторами была прекращена.
Специфичный карман А-субъединицы рицина очерчен сетью водородных связей (Рис. 3), которые гарантируют присоединение аденина к природной РНК. Однако, было показано, что птериновая часть РТА и неоптерина могут быть ориентированы для создания более сильного взаимодействия А-субъединицей рицина, чем взаимодействие с аденином [Yan X et al., 1997]. Кроме того, был сделан систематический обзор ингибиторов с различными донорами и акцепторами водородных связей для получения максимального взаимодействия. Компьютерное моделирование показало, что 3-аминопиридотиадиазин сохраняет множество специфичных взаимодействий, наблюдаемых для птерина. Однако, 
