4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ФГУ - федеральное государственное учреждение
ФА - формальдегид
КС - клеточная стенка
ПГ11КИ - Всероссийский государственный центр качества и стапдарппшиш
лекарственных средств для животных и кормов
ВНИИЗЖ - Всероссийский научно-исследовательский институт -мщптм
животных
N - количество микробных клеток
К - константа скорости инактивации
К50 - концентрация инактиванта обеспечивающая гибель 50 % клеток и
микробно,й популяции
lg - логарифм с основанием 10
лог2 - логарифм с основанием 2
лог3 - логарифм с основанием 3
КОЕ - колониеобразующая единица
МПБ - мясо-пептоннный бульон
МПА - мясо-пептонный агар
ИДзо - пятидесятипроцентная инфицирующая доза
ИмДзо - пятидесятипроцентная иммунизирующая доза
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛД5о - пятидесятипроцентная летальная доза
м.к. - микробные клетки
мм /сек - размерность кинематической вязкости
РА - реакция агглютинации
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
ФБР - фосфатно-буферный раствор
рН - количественный показатель кислотности
Montanide ISA-70 — масляный адъювант
LPS - липополисахарид
МАТ - моноклональные антитела
ОМР - белки внешней мембраны
к Да - килодальтон
ГЛБ - гидрофильно липофильный баланс
СПФ - свободный от специфического патогена
6
Введение
Актуальность темы. Пастереллёзы - различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, вызываемые бактериями рода Pasteurella (7).
Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных принадлежит двум видам: Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica (Mannheimia haemolytica) (29, 46, 59, 65, 125, 155).
P.multocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, а также легочных пастереллёзов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии (120, 163).
P.haemolytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.
Эти два вида пастерелл могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при артритах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах (83, 187).
Одним из основных звеньев в системе мер борьбы с пастереллёзами является иммунопрофилактика.
В настоящее время ветеринария располагает значительным арсеналом вакцинных препаратов, различающихся по составу, технологии производства, способу применения и эффективности (13, 20, 31, 38, 42, 51, 116, 147).
Большинство противопастереллёзных вакцин выпускается в виде инактивированных формалином, сорбированных или эмульсионных препаратов.
Эмульсионные вакцины, используемые в животноводстве, превосходят по иммуногенности сорбированные, однако высокая вязкость и реактогеппость таких препаратов являются основной причиной, препятствующей их широкому применению на практике (3, 24, 32, 35, 71, 90, 94).
7
Исходя из вышеизложенного, достаточно актуален вопрос разработки новой инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней, лишенной вышеуказанных недостатков.
Цель и задачи исследований. Основная цель данной работы состояли в разработке эффективной и удобной в применении вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить биологические свойства штаммов Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica;
- приготовить образцы антигенов пастерелл, инактивированных аминоэтилэтиленимином;
- изготовить экспериментальные образцы вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
количественно охарактеризовать на лабораторных животных зависимость между дозой антигена в составе вакцины и защитой от летальной дозы возбудителя;
определить оптимальную иммунизирующую дозу, напряженность и продолжительность иммунитета после применения вакцины па крупном рогатом скоте и овцах. ",'•
Научная новизна работы. В результате проведённых исследований:
- установлена высокая антигенная и иммуногенная активность антигенов P.miiltocida и P.haemolytica, инактивированных аминоэтилэтелепимипом, и составе вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
на лабораторных животных количественно охарактеризована зависимость между дозами антигенов в составе вакцины, титрами антител и защитным эффектом препарата;
8
- установлена оптимальная концентрация антигенов P.mullocida и P.hacinolytica n прививной дозе вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
- обоснована целесообразность использования белых мышей в качестве модели для оценки иммуногенности вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
разработаны методы контроля и применения вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке нормативно-технической документации на получение и применение «Вакцины против пастереллёза рогатого * скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной» (Утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 7 апреля 2004
г.).
Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ ВИИИЗЖ 30 сентября.2004 г. "Методические рекомендации по глубинному культивированию бактерий Pasteurella haemolytica" и «Методические рекомендации по инактивации бактерий Pasteurella haemolytica аминоэтилэтиленимином».
Основные положения, выносимые на защиту:
- инактивированная эмульсионная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
- оптимальная иммунизирующая доза антигена в вакцине против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
- результаты изучения физических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
9
- результаты изучения иммунобиологических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.
Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:
- Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных", Владимир, 24-26 марта 2004 г.
- Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных», Покров, 28-30 сентября 2004 г.
Публикации. По материалом диссертации опубликовано 4 научные работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список использованной литературы включает 190 источников, в том числе 106 работ зарубежных исследователей. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 19 таблицами. В приложении представлены копии документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2002 - 2004 г.г. в ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГУ ВНИИЗЖ).
10
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Пастереллёзы сельскохозяйственных животных
Пастереллёзы относятся к числу наиболее широко распространенных инфекционных заболеваний животных, регистрируемых во многих странах мира (К), 18, 23, 25, 30, 36, 63, 81, 87).
Экономический ущерб от болезни слагается из потерь от падежа, вынужденного убоя больных животных и затрат на проведение профилактических и оздоровительных мероприятий.
Инфекционная природа болезни установлена в конце 19 иски, и возбудитель впервые выращен на искусственных питательных средах в 1880 г великим французским ученым Луи Пастером, в честь которого в 1910 г данный микроорганизм назвали пастереллой.
Согласно определителя бактерий Берджи (57) в семейство Pasteiirellaceac входит три рода - Pasteurella, Haemophilus и Actinobacillus. Род Pasteiirella включает 15 видов, два из которых: P.multocida и P.haemolytica являются возбудителями пастереллёзов животных. В свою очередь вид P.multocida подразделяется на 3 подвида: P.multocida subspecies multocida, P.multocida subspecies septica, P.multocida subspecies galicida, различающихся между собой по биохимическим свойствам (57, 58). В настоящее время рядом исследователей предлагается исключить вид P.haemolytica из рода Pasteurella и обозначить его Mannheimia haemolytica.
Согласно 'классификации Carter - Heddleston (98, 129) все штаммы P.multocida, циркулирующие в природе, подразделяют на 5 серогрупп по капсульному антигену, обозначаемых латинскими буквами А, В, D, E, F и 16 сероваров по соматическому антигену (97, 98, 99).
Суммируя данные о распространении серовариантов пастерелл и их этиологической роли при различных формах пастереллёза, многие исследователи сходятся во мнении, что серовары В:2, В:5 и Е:2 являются возбудителями геморрагической септицемии у сельскохозяйственных и диких
11
животных (25, 87, 91, 99, 107, ПО, 160). При легочной форме пастереллёза, к которой наиболее чувствителен молодняк, особенно часто изолируют штаммы P.multocida, типируемые как сероварианты А:1, А:3, А: 12 (18, 63, 73, 80, 82). Штаммы серологических вариантов Д:1, Д:3, Д:4 являются основным этиологическим агентом в развитии инфекционного атрофического ринита свиней (80, 93, 95, 103, 117, 162, 173) и хронических процессов органов дыхания у многих видов животных. Сероварианты A:l, A:3, A:4 P.multocida вызывают холеру домашней и дикой птицы (9, 72, 115).
Различные серовары P.haemolytica, биотип А, вызывают фибринозную плевропневмонию в тяжелой форме у крупного рогатого скота и овец, иногда септицемию у ягнят и мастит у овец. Некоторые серовары P.haemolytica, биотип Т, также вызывают септицемию у ягнят (57, 81, 82, 102).
В настоящее время достаточно хорошо изучены морфологические, культуральные, биохимические и патогенные свойства пастерелл. Полагают, что пастереллы убиквитарны и паразитируют на многих видах домашних и диких животных, при этом взаимоотношения паразита и хозяина часто сглажены и проявляются бессимптомным бактерионосительством.
Наиболее широко распространено бактерионосительство среди крупного рогатого ?кота (9,5%), домашних птиц (4,95%). В среднем носители выявлены среди здоровых животных и птиц в 3,9%, среди больных с респираторным синдромом - в 4,6% случаев (83).
Локализуются пастереллы у носителей преимущественно в носовых ходах, трахее, легких. Длительность носительства колеблется от нескольких месяцев до года, возможно и более продолжительное время. Пастереллоносительство является причиной возникновения спонтанных вспышек инфекции, возникающих при ослаблении организма носителей под воздействием различного рода неблагоприятных факторов (резкие температурные колебания, перегоны и перевозки животных, изменения условий их содержания и т.д.).
12
Распространению болезни способствует высокая концентрации поголоиьи животных на ограниченных площадях, стресс факторы, особенно транспортный стресс (185).
Склонность пастереллёза к стационарному течению обуславливается широким распространением среди неблагополучных групп животных, в т.ч. п диких носителей патогенных пастерелл и повторными вспышками заболевания при смешивании пастереллоносителей со здоровыми группами животных (174). 11астереллы выделяли от 88 видов млекопитающих и 44 видов птиц.
Колебание летальности при пастереллёзе зависит от вирулентных свойств возбудителя, своевременного проведения оздоровительных мероприятий, устойчивости организма поражаемых животных, их возраста, условий содержания и полноценности кормовых рационов по белку, витаминам и минеральным веществам.
В естественных условиях переболевшие пастерелл ёзом животные приобретают иммунитет (161). Искусственно иммунитет можно создать как при помощи живых, так и инактивированных вакцин (89, 92, 149, 158, 159).
Основой общей профилактики пастереллёза является охрана благополучных хозяйств от заноса в них инфекции с больными животными, пастереллоносителями, с продуктами убоя больных животных и т.д.
1.2. Бактериальные вакцины
Великий французский ученый Луи Пастер по праву является основоположником иммунологии, так как он впервые обосновал принцип вакцинации и способы создания вакцин. Основываясь на принципах Пастера и базируясь на достижениях теоретической и практической микробиологии, создано огромное количество бактериальных вакцин, которые широко используются в ветеринарии и без которых немыслим прогресс в борьбе с инфекционными болезнями животных (16).
13
Вакцины активно и специфично воздействуют на иммунную систему, стимулируя развитие противоинфекционного или антитоксического иммунитета (166).
Вакцинные препараты за последние сто с небольшим лет претерпели огромные изменения, пройдя путь от аттенуированных и убитых вакцин времен Пастера до современных генноинженерных и синтетических вакцин.
Живые вакцины - это те, которые содержат микроорганизмы с пониженной вирулентностью, способные размножаться в организме животного, не вызывая явных признаков болезни и не передаваясь при контакте (70, 180). При этом индуцируется иммунитет, напряженность которого ниже, чем при естественном переболевании (150, 151).
Инактивированные (убитые) вакцины целесообразно разделить на корпускулярные (цельноклеточные и субклеточные) и молекулярные. Корпускулярные вакцины являются более "древними" и традиционными для ветеринарии вакцинами. Для их получения используют инактивированные физическим или химическим способом цельные микробные клетки, а также извлеченные из них надмолекулярные структуры, содержащие протективные антигены. Иногда вакцины из надмолекулярных комплексов микробной клетки называют "химическими" вакцинами, что конечно является условным.
Корпускулярные вакцины, несмотря на наличие в их составе балластных веществ микробной клетки, которые могут вызывать побочные реакции, широко используются в ветеринарной практике при иммунизации против пастереллёза, лептоспироза, сальмонеллеза, эшерихиоза и других инфекций.
Молекулярные вакцины содержат антиген в молекулярном виде. Такие вакцины получают тремя способами (21): 1. Путём выращивания природных штаммов микробной клетки, в том случае когда в процессе культивирования синтезируется специфический антиген в молекулярном виде (таким способом биосинтеза получают столбнячный и ботулиновый токсины, которые затем превращаются путём обезвреживания формалином и теплом в анатоксины -
14
молекулярные растворимые антингены; 2. Химическим синтезом антигенов, то есть специфических пептидов бактерий, аналогичных по своей структуре и свойством природным антигенам микробов; 3. Биосинтезом молекул нелепого антигена при культивировании искусственно созданных генно-инженерным способом рекомбинантных штаммов микробов.
На основе молекулярных антигенов возможно конструирование вакцин с повышенной иммуногенностью, лишенных балластных веществ микробной клетки. В качестве реципиента генов при создании рекомбинантных штаммов в последние годы стали использовать вакцинные штаммы сальмонелл (21).
Бактериальные вакцины хорошего качества должны удовлетворять следующим требованиям: предотвращать появление заболевания у вакцинированных животных; блокировать или снижать репликацию возбудителя инфекции в организме; стимулировать удаление из организма возбудителя инфекции и выздоровление; препятствовать или снижать персистенцию возбудителя; предотвращать развитие или уменьшать тяжесть осложнений после инфекции, предупреждая или снижая экономический ущерб; предотвращать распространение возбудителя в окружающей среде; предупреждать передачу инфекции невакцинированным (вакцинированным) контактным животным; у маток защищать потомство через колостральные антитела в течение первых недель жизни; продолжительность иммунитета после вакцинации должна быть по меньшей мере полгода (181).
Живые и инактивированные вакцины создают активный иммунитет против содержащихся в них антигенов. В то же время они имеют ряд недостатков. У живых вакцин они следующие: процесс аттенуации инфекционного агента длительный и трудоёмкий, к его окончанию можно не добиться длительного серийного размножения или полного понижения вирулентности; существует опасность реверсии к "дикому типу"; необходимо контролировать, что аттенуация полная и вакцина не содержит вирулентный агент; живые вакцины могут вызывать латентную инфекцию с
15
бактерионосительством до 6-8 мес, а отсутствие у вакцинных штаммов надежных генетических маркеров затрудняет диагностику соответствующей болезни; необходимо хранить вакцины при температуре, близкой к нулю.
Инактивированным вакцинам присущи следующие недостатки: использование в производстве этих препаратов вирулентных штаммов требует постоянного и строгого контроля за полнотой инактивации, чтобы воспрепятствовать попаданию в вакцину живых микрооргшппмон; инактивированные вакцины стимулируют обычно гуморальный иммунитет; короткая продолжительность иммунитета; необходимость использования адъювантов, которые не всегда безвредны для животного; некоторые инактивирующие агенты могут быть токсичны для организма, а вакцины иногда индуцируют анафилактические реакции (70).
Живые вакцины создают более напряжённый и продолжительный иммунитет, чем убитые. Однако последние после нескольких ревакцинаций также могут индуцировать напряженный и продолжительный иммунитет.
Повышение иммуногенности молекулярных вакцин можно достичь: укрупнением, полимеризацией молекул антигена, конъюгированием его с минеральными веществами или синтетическими полимерами, то есть созданием адъювантных, сорбированных препаратов или, как их иногда называют, полусинтетических вакцин (21, 96). Полусинтетическая вакцина состоит из специфического антигена в молекулярной форме, носителя (сорбент, синтетический полимер) и адъюванта (54, 133). Часто носитель выполняет в вакцине и роль адъюванта.
Роль адъювантов заключается в активации различных клеток иммунокомпетентной системы и усилении процессов взаимодействия между ними (55). Например, сорбированные вакцины создают на месте введения вакцины гранулемы, в которых активно протекает взаимодействие антигена и иммунокомпетентных клеток, активируются макрофаги, образуются различные цитокины. Повышенная иммуногенность эмульсионных вакцин объясняется
16
созданием "депо" антигена на месте инъекции, обеспечивающего медленное и длительное высвобождение антигена с места его введения, и дискретностью антигена, что способствует его захвату фагоцитами (20) и усилению контакта с иммунокомпетектными клетками (130, 138).
Даже самые простые - сорбирующие адъюванты - повышают иммуногенность белковых антигенов в десятки и сотни раз (21, 48). Об этом свидетельствует высокая эффективность сорбированных на гидроокиси алюминия анатоксинов - столбнячного, ботулинического.
1.3. Изготовление противопастереллёзных вакцин
Одним из важнейших звеньев в системе мер борьбы с пастереллёзом является специфическая профилактика. Первые противопастереллёзные вакцины появились в мире в начале 30-х годов прошлого столетия (22, 50, 84). В дальнейшем разработкой средств специфической профилактики пастереллсза занимались многие исследователи в разных странах (11, 12, 14, 34, 39, 41, 47, 62, 69). В настоящее время общее количество вакцинных препаратов против пастереллёза животных, используемых в мире, доходит до тридцати. Тем не менее поиск новых, более эффективных вакцин продолжается (105).
При разработке новой вакцины судьбу препарата решают три основные фактора: возможность снижения заболеваемости и польза от применения вакцины; риск развития поствакцинальных осложнений и возможный ущерб от1 вакцинации; стоимость вакцины и экономическая выгода. Конечно, нет абсолютно безопасных вакцин, однако количество осложнений, возникающих при вакцинации, в сотни и тысячи раз меньше числа случаев аналогичной патологии, которая наблюдается при инфекционных заболеваниях. Затраты на вакцинацию любой вакциной, эффективность которой доказана, примерно в 10 раз меньше затрат на лечение инфекционного заболевания.
Эффективность иммунопрофилактики напрямую зависит от качества производственных штаммов микроорганизмов, из которых изготавливают вакцину, и от их иммунобиологических свойств (136, 164). Производственные
17
штаммы микроорганизмов должны быть классифицированы, клоиироипиы, кроме того, они должны представлять собой однородную популяцию микроорганизмов, происходящих из одной клетки с характерными для нее генетически закрепленными признаками: морфологическими, биохимическими, антигенными и другими (41, 49).
Производственный штамм пастерелл, предназначенный для изготовления живой вакцины, представляет собой, как правило, естественно или искусственно аттенуированную культуру микроорганизмов с закрепленными свойствами, обладающую высокой имму'ногенностью.
Основными общими показателями качества производственных штаммов являются: чистота (отсутствие контаминации посторонними микроорганизмами), безвредность, умеренная реактогенность, антигенная и иммуногенная активность, стабильность биологических свойств при культивировании в предлагаемой системе. Непременным требованием ко всем живым вакцинным штаммам является стойкое отсутствие реверсибельности. Их "остаточная" вирулентность должна сохраняться на определенном, постоянном для каждого из них уровне.
Иммуногенную активность штамма определяют путем введения животным различных доз испытуемого микроорганизма с последующим контрольным заражением вирулентным штаммом. Доза, обеспечивающая защиту 50% животных от болезни, считается минимальной иммунизирующей, но так как живые вакцины должны обеспечивать защиту не менее 80% животных, прививная доза может превосходить минимальную иммунизирующую в несколько раз. Для изучения реактогенности штамма за основу берут прививную дозу, то есть в которой он будет использоваться на практике. Безвредным должно быть введение как минимум 5 прививных доз.
Штаммы пастерелл должны обладать стабильными
иммунобиологическими свойствами на протяжении не менее 5 последовательных пассажей. Одним из показателей стабильности является |
