СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. — аминокислотный остаток
АФБ — активность по фильтровальной бумаге
БТ - бермудская трава
ВС - восстанавливающие сахара
вм - высокомолекулярная (форма фермента)
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГПХ — гель-проникающая хроматография
ИСИ - индекс сорбции индиго
ИЭФ - изоэлектрофокусирование
КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза
КГ - ксилоглюканаза
МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза (Авицел)
ММР — молекулярно-массовое распределение
МУФ - метилумбеллиферил- или метилумбеллиферон
нм - низкомолекулярная (форма фермента)
НФ - нитрофенил
ПААГ — полиакриламидный гель
ПАВ — поверхностно-активное вещество
ПДИ — плоский двухсторонний индуктор
п-НФ-Gz - л-нитрофенил-Р-Б-целлобиозид
и-НФ-L - и-нитрофенил-Р-О-лактозид
ПГК - полигалактуроновая кислота (натриевая соль)
ПП - просо прутьевидное
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РПДИ - реактор на базе плоского двухстороннего индуктора
СП - степень полимеризации
усл. ед. - условные единицы
ФМЧ - ферромагнитные частицы
ЦБГ - целлобиогидролаза
ЦСМ - целлюлозосвязывающий модуль
ЭГ -эндо-1,4-р-глюканаза
Ds-Na - додецилсульфат натрия
ВВЕДЕНИЕ
Современный этап развития физико-химической энзимологии имеет две характерные особенности. С одной стороны, происходит накопление и развитие фундаментальных знаний, осуществляется углубленное изучение механизма действия ферментов и ферментных систем, выявление характерных особенностей их функционирования. С другой стороны, активизируются усилия, направленные на поиск возможности использования биокатализаторов в различных областях технологии. Принципы биокатализа, биотрансформации веществ все более широко применяются для реализации новых биотехнологических процессов, решения насущных задач, связанных с переходом на новые источники сырья и энергии, для разработки прогрессивных методов утилизации отходов, а также для замены традиционных химических процессов на биокаталитические, которые протекают в более мягких условиях и гораздо более безопасны с точки зрения экологии.
Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы -самого распространенного биополимера на Земле, по праву занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. Поэтому не случайно, начиная с середины прошлого века, во многих странах мира стали проводиться исследования целлюлаз.
Резкое увеличение интенсивности подобных исследований произошло в 1970-е годы в США и странах Западной Европы из-за разразившегося энергетического кризиса, связанного с резким повышением цен на нефть и другие энергоносители [1]. Целлюлоза растительной биомассы представляет собой практически неисчерпаемый источник возобновляемого сырья, которое может быть конвертировано ферментативным путем в глюкозу. В свою очередь, глюкоза является незаменимым сырьем для микробиологических процессов получения жидких и газообразных видов топлива (этанола, бутанола, этилена и др.), органических и аминокислот, кормового белка и многих других полезных продуктов микробиологического синтеза. Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в 800-1000 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 1021 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается 4-5 млрд. т
отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2]. Таким образом, в будущем растительная биомасса может играть ту роль, которая в настоящее время принадлежит нефти.
Прогрессирующий дефицит невозобновляемых источников энергии и материалов наблюдается и в настоящее время. В последние годы интерес к биоэтанолу и другим видам топлива из лигноцеллюлозного сырья вновь резко повысился из-за дальнейшего роста цен на нефть, а также в связи с Киотским соглашением 1997 г., направленным на снижение выброса в атмосферу газов, вызывающих парниковый эффект. В отличие от ископаемых видов топлива, биоэтанол и другие виды топлива из возобновляемого растительного сырья не приводят к накоплению углекислого газа в атмосфере, т.к. он вновь превращается в кислород в процессе фотосинтеза, осуществляемого растениями (т.е. происходит круговорот СО2/О2 при параллельном возобновлении целлюлозы и других компонентов растительной биомассы).
Таким образом, помимо фундаментальных исследований в области целлюлолитических ферментов, направленных на выяснение биохимических и физико-химических закономерностей биодеградации целлюлозы в природе, механизмов действия грибных и бактериальных ферментов, в последние 30 лет наиболее активно развивались прикладные исследования в области ферментативного гидролиза целлюлозы, а также разработки, направленные на поиск и получение новых штаммов - суперпродуцентов целлюлаз. При этом основные усилия были направлены на поиск и изучение ферментов, способных наиболее эффективно и полно разрушать целлюлозу до растворимых Сахаров и в итоге - до мономера (глюкозы).
С конца 1980-х годов целлюлазы стали активно применяться для обработки текстильных изделий и материалов [3,4]. Первым таким процессом стала ферментная обработка джинсовых изделий, приводящая к частичному удалению красителя с поверхности ткани, в результате которой изделия приобретают внешний вид «вареных джинсов». В течение нескольких лет ферменты практически заменили пемзу и химические агенты, применявшиеся для этой цели ранее. Позднее целлюлазы стали широко использоваться для биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и смесовых тканей. В результате такой обработки с поверхности материала удаляются ворсинки и неровности, в результате чего материал становится более гладким, приятным на ощупь, и после серии стирок на
нем не происходит образования «катышков» (пилей), что повышает потребительские свойства изделий. Наконец, в последние годы стало развиваться направление применения целлюлаз (совместно с пектиназами) для биоотварки («биоскоринга») суровых хлопчатобумажных тканей с целью увеличения смачиваемости целлюлозных волокон, что облегчает окрашивание материала на последующих стадиях технологического процесса. Такая обработка является необходимой стадией в текстильной промышленности, однако в течение многих столетий отварка производится в горячем растворе щелочи, приводя к быстрой коррозии оборудования и вредным выбросам в окружающую среду.
В последнее десятилетие целлюлазы также стали активно использоваться в качестве добавок к детергентам и моющим средствам [3,4] для того, чтобы воздействуя при стирке на текстильные материалы, содержащие в своем составе целлюлозные волокна, облегчить удаление грязей за счет гидролиза части поверхностных волокон и предотвратить образование пилей.
В отличие от ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, где ферменты должны обладать максимальной «агрессивностью» по отношению к полимерному субстрату (высокой сахаролитической активностью), в процессах биообработки текстиля (в том числе, при стирке современными моющими средствами) требуются целлюлазы, способные мягко воздействовать на поверхность волокон, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы, т. е. так называемые «тополитические» ферменты.
Среди других областей применения целлюлолитических ферментов следует отметить их использование в качестве добавок к кормам животных и птиц для разрушения некрахмальных полисахаридов [3,4]. В данном случае, как правило, используются мультиферментные препараты, содержащие широкий спектр карбогидраз, т.е. не только целлюлазы, но и ксиланазы, ?-глюканазы, пектиназы. Например, добавка таких препаратов в составе премиксов к комбикормам в птицеводстве позволяет не только повысить их усвояемость, но и использовать кормовые диеты на основе таких трудноусвояемых видов злаков, как рожь и ячмень.
Специфика применения целлюлолитических ферментов в новых технологиях часто требует, чтобы ферменты обладали высокой активностью не только в кислой среде (при pH 4-5), что типично для грибных целлюлаз, но также и в нейтральной и слабощелочной среде. Поэтому в последнее время различными научными и
производственными коллективами ведется интенсивный поиск нейтральных и щелочных целлюлаз.
Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Г. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Препараты целлюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими компаниями -производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), Genencor International (США), logen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (ФРГ), Meiji Seika Kaisha Ltd. и Shin Nihon Chemical Co. (Япония) и др. В последние годы в связи с бурным развитием «текстильного» направления целлюлаз некоторыми компаниями стали производиться ферментные препараты на основе других грибных продуцентов, оптимизированные для использования в конкретных биотехнологических процессах. Например, на основе грибного продуцента Humicola insolens фирмой Novozymes (Дания) производятся ферментные препараты серии Denimax для «биостонинга» джинсовых изделий. Для этой же цели выпускаются специальные ферментные препараты фирмой Meiji (Япония). В отличие от целлюлаз Trichoderma указанные ферменты функционируют в нейтральной области pH.
По оценкам зарубежных специалистов общий объем продаж промышленных ферментов на мировом рынке должен составить в 2005 г. от 1,7 до 2 млрд. долларов США, при этом доля целлюлаз может составить 15-20% [3,4].
В СССР в 1970-1980-е годы микробиологическая промышленность также производила в промышленных масштабах или в виде опытно-промышленных партий ферментные препараты целлюлаз - такие как Целловиридин ГЗх (Г. viride), Целлобранин ГЮх (Т. longibrachiatum), Целлолигнорин ПЮх (Т. lignorum), Целлокандин ГЮх {Geotrichum candidum) и некоторые другие [5-7]. Несмотря на то, что по продуктивности секреции внеклеточного (целлюлолитического) белка и удельной целлюлазной активности указанные продуценты и ферментные препараты на их основе, как правило, уступали зарубежным аналогам, с точки зрения качества целлюлазного комплекса (т.е. набора целлюлаз с различной специфичностью) отечественные препараты мало чем от них отличались, а иногда обладали более интересными свойствами. К середине 1990-х годов из-за распада СССР и общего
экономического кризиса производство ферментных препаратов на большинстве биохимических заводов стран СНГ прекратилось.
Начиная с конца 1980-х годов, в Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН в рамках Государственной научно-технической программы «Новейшие направления биоинженерии» велись разработки, направленные на поиск новых перспективных продуцентов грибных целлюлаз, усовершенствование существующих штаммов микроорганизмов, повышение удельной активности секретируемых ферментных комплексов, а также использование препаратов целлюлаз для биоконверсии лигноцеллюлозного растительного сырья в различные полезные продукты. В 1991 г. на основе штамма Т. reesei 18.2KK на Приволжском биохимическом заводе при участии кафедры химической энзимологии МГУ было налажено производство ферментного препарата Целловиридин А (взамен менее продуктивного штамма Т. viride, на основе которого до этого производился Целловиридин ГЗх). Несмотря на то, что к середине 1990-х годов на Приволжском заводе производство данного ферментного препарата прекратилось, оно в дальнейшем было возобновлено на ряде биохимических заводов России и бывших республик СССР (препараты Целловиридин Г20х и Г2х). В течение последних 15 лет в ИБФМ РАН путем селекции и мутаногенеза были получены новые штаммы гриба Т. reesei TW-1 и TW-307 (отличающиеся повышенной секрецией целлюлаз), на основе которых были произведены ферментные препараты с улучшенной осахаривающей способностью при гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Были также получены новые промышленные штаммы гриба Penicillium verrueulosum В40-221-6 и В40-221-151, дерепрессированные по глюкозе и способные секретировать на дешевых питательных средах до 40-50 г/л внеклеточного белка. Основным достоинством ферментных препаратов Р. verrueulosum по сравнению с целлюлазами Т. reesei является более сбалансированный состав целлюлазного комплекса, и, в частности, более высокий уровень ?-глюкозидазной активности, что, как будет показано в диссертационной работе, позволяет получать более высокий выход целевого продукта (глюкозы) при ферментативном гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Наконец, в результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз - гриб Chrysosporium lucknowense, на основе
10
которого были получены новые штаммы (в частности, UV 18-25), отличающиеся крайне высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) С. lucknowense UV 18-25 не уступает, либо превосходит лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз (например, различные штаммы Т. reesei). Серьезным преимуществом С. lucknowense также является то, что некоторые из целлюлаз данного продуцента обладают высокой активностью в нейтрально-щелочной среде, что делает данные ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов (в частности, для обработки текстиля, а также для применения в моющих средствах).
Следует отметить, что к настоящему времени ферменты целлюлазного комплекса Т. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. За последние 50 лет опубликовано более тысячи статей, патентов и монографий, а также проведены десятки международных конференций, посвященных микробиологическим, биохимическим и биотехнологическим аспектам гриба Т. reesei (Г. viride), а также продуцируемых данным грибом целлюлаз. Тем не менее, полный геном Т. reesei до сих пор не расшифрован, и далеко не все карбогидразы данного гриба были выделены и охарактеризованы. В литературе имеется также немалое количество публикаций по целлюлазам, продуцируемым различными видами грибов рода Penicillium, однако сведения, касающиеся пеницилльных ферментов-карбогидраз (и целлюлаз в частности), весьма противоречивы. Что касается ферментов, продуцируемых грибом С. lucknowense и другими видами грибов рода Chrysosporium, то сведения по ним практически отсутствуют в научной литературе, а также в белковых и других базах данных.
Учитывая актуальность исследования целлюлазных комплексов, продуцируемых различными микроорганизмами, как главных разрушителей растительной биомассы в природе, а также принимая во внимание все более широкое применение целлюлолитических ферментов в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах, в данной работе были поставлены следующие задачи и цели:
• детально охарактеризовать внеклеточный целлюлазный комплекс, продуцируемый грибом С. lucknowense, включая выделение всех секретируемых эндоглюканаз и целлобиогидролаз, изучение их субстратной специфичности, основных биохимических и физико-химических свойств, а также получение
11
информации по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов из данных белков), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликозид-гидролаз;
• изучить закономерности трансгликозилирования и ингибирования продуктами реакции при катализе целлюлолитическими ферментами (как важных факторов, влияющих на эффективность гидролиза природных субстратов целлюлаз);
• провести сравнение осахаривающей способности широкого круга отечественных и зарубежных целлюлазных препаратов на основе различных грибных продуцентов при гидролизе реальных видов целлюлозосодержащего сырья и выявить наиболее эффективные целлюлазные комплексы и штаммы-продуценты;
• найти возможности интенсификации процесса ферментативного осахаривания целлюлозы в лабораторных гидролиз-аппаратах различной конструкции; с помощью экспериментальных подходов, а также используя методы математического моделирования, выявить основные факторы, влияющие на кинетику ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов;
• выявить наиболее перспективные «тополитические» целлюлазы, обладающие высокой эффективностью при действии на текстильные материалы - в таких процессах, как ферментативная депигментация джинсовой ткани и биоотварка («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей; разработать теоретические основы действия «тополитических» целлюлаз; получить и испытать новые ферментные препараты, наиболее подходящие для применения в процессах биообработки текстильных материалов.
12
литературный обзор
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЫ
Основной частью органической материи на Земле являются клеточные стенки растений. Общие запасы растительной биомассы составляют около одного триллиона тонн, что делает данный материал идеальным возобновляемым сырьем для получения различных видов топлива и других полезных продуктов [1,2].
Наиболее важные химические компоненты клеточных стенок растений - это полисахариды [8]. Их можно разделить на две большие категории. Полисахариды первой категории — очень длинные неразветвленные молекулы, существующие в основном в кристаллической форме, которые в клеточной стенке агрегированы в пучки, называемые микрофибриллами. Наиболее распространенным микрофибриллярным полисахаридом растительной биомассы является целлюлоза. Микрофибриллы заключены в матрикс, состоящий из полисахаридов второй категории, которые не имеют кристаллической структуры. Полисахариды матрикса в свою очередь по химической структуре и растворимости делятся на пектины и гемицеллюлозы. Пектины хорошо экстрагируются кипящей водой, в то время как гемицеллюлозы растворимы лишь в 4 М растворе КОН (микрофибриллярные полисахариды не растворимы ни в кипящей воде, ни в щелочи). Полисахаридную структуру клеточной стенки можно сравнить со структурой железобетона; при этом целлюлозные кристаллические микрофибриллы эквивалентны стальным стержням арматуры, а полисахариды матрикса - окружающему их бетону. Следует заметить, что полисахаридный состав матрикса у различных типов растений может быть неодинаковым, поэтому не существует стандартных методов, с помощью которых можно было бы разделить полисахариды этих классов на подклассы; каждый биологический материал требует своей специфической обработки. В то же время указанные полисахариды могут быть классифицированы по химической структуре (см. ниже раздел 1.2).
Также в состав клеточных стенок большинства высших растений входит лигнин, белки, выполняющие, по-видимому, структурную роль, и, в некоторых случаях, неорганические включения, главным образом карбонаты и силикаты кальция [8,9].
13
1.1. Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы
Целлюлоза содержится в древесине, однолетних растениях, травах, льне, хлопке, конопле, в оболочках семян плодов, в морских и пресноводных водорослях. В природе встречается также бактериальная и животная целлюлоза (некоторые ракообразные и улитки) [2,8].
По молекулярному строению целлюлоза представляет собой линейный полимер, ангидроглюкозные звенья которого связаны р-1,4-О-глюкозидными связями. Степень полимеризации (СП) нативной целлюлозы может составлять более 10 тыс., а молекулярная масса - более 1,5 млн. [10,11]. Длина одного ангидро-глюкозного звена составляет 5,5 A, следовательно, длина молекулы целлюлозы -около 5 мкм. СП изменяется в зависимости от фазы роста растения. На ранних стадиях роста целлюлоза имеет низкую СП, пориста и обладает более высокой сорбционнои способностью по сравнению с целлюлозой созревшего растения.
Целлюлоза в нативном состоянии представляет собой полимолекулярное соединение, в состав которого входят молекулы, идентичные по своему строению, но отличающиеся по длине. Например, для хлопковой целлюлозы установлено наличие двух фракций: основной с интервалом по степени полимеризации от 7500 до 9000 с максимумом при 8500, и меньшей по содержанию фракции - с СП от 5500 до 7500 с максимумом при 6500. Для бактериальной целлюлозы показано наличие двух максимумов на кривой молекулярно-массового распределения - при значении СП 2000 и 6000 [2].
Элементарные звенья макромолекулы целлюлозы находятся в форме кресла, гидроксильные группы расположены в горизонтальном направлении, а атомы водорода - в вертикальном (рис. 1.1). Каждое второе звено цепи повернуто на 180° по отношению к оси молекулы. Таким образом, с точки зрения молекулярного строения более правильно считать элементарной структурной единицей целлюлозы не ангидроглюкозное, а целлобиозное звено, которое выделено на рис.1.1 скобками.
СНоОН
о
он
сн,он
сн2он
он
о
СНоОН
Рис.1.1. Молекулярное строение целлюлозы. 14
Целлюлоза - классический пример полимера, макромолекулы которого имеют линейное строение и который характеризуется повышенной скелетной жесткостью. Конфигурация макромолекулы целлюлозы дает возможность реализации внутри- и межмолекулярных взаимодействий. Современная точка зрения на структуру целлюлозы имеет в своей основе теорию аморфно-кристаллического ее состояния и основывается на данных электронографических, рентгенографических и других исследований [2,10,12]. Как и все гидрофильные линейные полимеры, целлюлоза обладает склонностью к образованию первичных (элементарных) фибрилл, в которых группы параллельно расположенных цепей макромолекул связаны между собой множественными водородными связями. Первичная фибрилла представляет собой наименьшее надмолекулярное звено целлюлозы. Общепринятой в настоящее время является модель первичной фибриллы Денниса и Престона (рис. 1.2) [2,13].
У
П
t f f f f f t f f
f
- 4 t t.„ t f
/
t './ I 7
Рис.1.2. Модель первичной (элементарной) фибриллы целлюлозы по Деннису и Престону: а - поперечное сечение, в центре кристаллическое ядро, вокруг -аморфная зона; б — продольное сечение, сплошные линии обозначают макромолекулы целлюлозы. Пунктиры - неглюкозные полимеры.
Макромолекулы целлюлозы в первичных фибриллах образуют однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны (кристаллиты), которые чередуются с неоднородными менее упорядоченными аморфными зонами. В кристаллитах существует трехмерный дальний порядок в расположении цепей целлюлозы. В аморфных участках дальний порядок отсутствует, и сохраняется лишь общая продольная направленность цепей. В аморфных участках относительно легко могут проходить реакции целлюлозы с другими веществами. Длина макромолекул
15
целлюлозы значительно больше длины кристаллических участков, поэтому каждая макромолекула проходит последовательно ряд кристаллических и аморфных участков.
Первичные фибриллы целлюлозы соединяются между собой с помощью водородных связей в микрофибриллы, которые и являются основными звеньями строения волокон целлюлозы. Микрофибриллы состоят из нескольких первичных фибрилл, поперечное сечение их составляет примерно 100 х 200 A, длина - около 600 А. Общепринятая в настоящее время структура микрофибриллы (модель Фрей-Висслинга) [2,10] отображена на рис.1.3. Между первичными фибриллами в микрофибрилле находится лигнин и гемицеллюлозы.
а
/ 4 ttt'/jftt / / / 4 t / f f
о о t f I f f ОКК :::::// у ::::: ... / / /... людированная вода ' ' / / / / 't
о / ', ' J /
f ч / / / / f / t t ... // ... / У f t f * f t f / t t / Г , / / / / / '
70/ I 30 A
200 A
Рис.1.3. Модель микрофибриллы целлюлозы (по Фрей-Висслингу): а - общий вид, б - поперечный разрез.
Специфика морфологической структуры целлюлозы обеспечивает ее устойчивость при воздействии значительных массовых сил. Структурная мощность обусловлена тем, что природная целлюлоза представляет, по существу,
16
композиционный материал с кристаллической матрицей и необычными по составу и свойствам наполнителем (лигнин и гемицеллюлозы играют роль адгезивов). Это позволяет противостоять столь большой осмотической силе, как 20000 кг/см2 [14].
Целлюлозные волокна характеризуются индексом (степенью) кристалличности. Этот показатель отражает плотность упаковки целлюлозы и соотношение аморфных и кристаллических участков в ее структуре. Индекс кристалличности (ИК) определяют рентгенографически (метод основан на измерении дифракции рентгеновских лучей), по дифракции электронов, с помощью ИК-спектроскопии, ЯМР, по различию плотности целлюлозы в аморфных и кристаллических участках, путем адсорбции воды и йода, по скорости обмена D2O, а также по скорости протекания различных реакций: таких, как кислотный гидролиз, перйодатное окисление, формилирование и т.д. - см., например, [2,15]. Данные, установленные разными методами, могут отличаться друг от друга. Поэтому на практике нельзя определить абсолютное значение кристалличности или аморфности, однако, имеющиеся методы позволяют достоверно судить об относительных изменениях в структуре гомологических рядов целлюлозных материалов. Наиболее воспроизводимым, точным и простым в интерпретации является метод дифракции рентгеновских лучей. В настоящее время большинство исследователей применяют именно этот метод [2]. Для количественного определения ИК используют формулу, предложенную Сегалом:
- 4 ИК=------------ х 100%
где /оо2 - интенсивность рефлекса 002 на дифрактограмме (26 = 22°); /а -интенсивность рассеяния на угле 2$ = 19° (см. рис. 1,46).
Наибольшей упорядоченностью структуры и содержанием кристаллических участков характеризуется целлюлоза хлопка и целлюлоза рами. Их ИК по данным рентгеновской дифрактометрии составляет 90% и более. Целлюлоза древесины менее упорядочена, однако так же, как и хлопок, относится к высокоупорядоченным образцам (ИК составляет 70-90%). Бактериальная целлюлоза обладает ИК, близким по значению к таковому для хлопковой целлюлозы [2].
17 |
