Введение.
Влияние любых видов радиации на неорганические и особенно органические объекты всегда играло огромную роль в жизни человечества. Поэтому медицина со времени открытия радиоактивности тесно связана и с использованием этого воздействия, и с защитой от него.
Ионизирующее излучение занимает особое место в ряду воздействий. Это связано, во-первых, с существованием естественного радиоактивного фона, играющего важную роль в мутационных и эволюционных процессах. Во-вторых, технологическое использование ионизирующего излучения и ядерных реакций привело к возможности высвобождения огромного количества энергии и к загрязнению экосистемы радиоактивными отходами и выбросами. Все это постоянно ведет к повышению коллективной дозы облучения и синергическому действию ионизирующего излучения и других видов радиации совместно с техногенными загрязнителями разных типов, а также с лекарственными препаратами и пищевыми добавками, активно применяемыми сегодня в повседневной жизни. Результат таких совместных воздействий и степень опасности, связанная с модификацией действия излучения этими препаратами, в каждом конкретном случае четко не определены из-за влияния большого числа факторов, а главное из-за неизученного взаимного действия. Таким образом, активно начатые в 50-х годах исследования по действию радиации на биологические объекты до сих пор актуальны, и основное отличие сегодняшнего подхода к этой проблеме заключается в новых методах исследования и развитии концепции комплексного (многофакторного) воздействия и их комплексного изучения. Особое значение такие исследования имеют для фармацевтической химии при разработке новых лекарственных средств, в основном, из-за сочетанного действия радиации и лекарственных средств.
Другой важный аспект использования радиации базируется на том, что радиационное воздействие может служить более быстрым процессом, вызывающим те же изменения, что и другие природные факторы, которые действуют достаточно медленно и поэтому трудно фиксируемы. Это позволяет использовать радиацию для модельных исследований, например, других радикалообразующих процессов. Возможно это и для более сложных процессов. Так, известно [1], что радиационно-индуцируемый рак по механизму возникновения аналогичен химическому и спонтанному. Следует отметить, что в последнее
время в медицине возникает много вопросов о действии малых доз радиации, особенно если эти дозы действуют в течении очень короткого времени (импульсное воздействие), а также по-прежнему актуальны вопросы действия лекарственных препаратов при радиотерапии.
Исследования последствий и профилактики радиационных воздействий и радикалообразующих процессов традиционно развиваются в Японии, Польше, России. Прикладные аспекты этих исследований, в частности, касающиеся скриннинга фармакологических агентов, являющихся различного рода модификаторами, используются в США и Франции. По радиационной тематике издаются многочисленные международные журналы (Rad.Res., J.Rad Res, Int.J.Rad.Biol), однако встречаются работы на эту тему и в других журналах (например, "Медицинская радиология" и др.), если они связаны с комплексным исследованием проблемы.
Один из важнейших аспектов моделирования радикалообразующих процессов связан с радикальным повреждением ферментов и ферментных систем, физиологическую роль которых трудно переоценить. Особенно важно, что сами ферменты являются лекарственными средствами или мишенями для них.
Метод радиационного воздействия на ферменты не является селективным радикалообразующим методом, но имеет свои особенности, способствующие изучению каталитических и кинетических свойств исследуемых объектов. Фундаментальный аспект данной работы связан с разработкой и применением метода, который можно назвать методом радиоэнзимологии, в частности, для целей фармацевтической химии. Метод является комплексным и включает в себя радиохимические, кинетические, каталитические и генноинженерные исследования и направлен на то, чтобы по совокупному конечному изменению свойств объекта сделать прогностический вывод об его особенностях как структурных, так и энзимологических. Прогностические модели могут использоваться в медицине, биотехнологии и фармхимии.
Метод радиационной инактивации, являющийся базовой частью представленного метода радиоэнзимологии, насчитывает достаточно длительный период использования. Изучение поведения ферментов под действием ионизирующего излучения проводилось давно [2,3], как один из способов его действия на организм человека. Сначала эти исследования считались путем к прямому моделированию повреждения организма, но быстро стал
понятным сложный характер этой взаимосвязи, и интерес к такого рода исследованиям уменьшился. Однако результатом их явилось появление метода радиационного определения молекулярных масс ферментов, который используется и ныне для сложных ферментных систем [4]. Кроме того, поскольку ферменты представляют достаточно сложные объекты, определение структуры которых является чрезвычайно важной задачей, метод радиационной инактивации стал применяться с целью изучения самих ферментов, их структуры и каталитических свойств, в основном, в водных растворах, где рентгеноструктурный метод не работает, а действие самих ферментов наиболее интересно и перспективно. Что же касается непосредственного действия излучения на твердый или иммобилизованный фермент, то метод радиационной инактивации получил прикладное значения благодаря использованию энзимов в бессеребряных фотографических и радиодозиметрических материалах, а также в медицине и фармацевтической химии. Различие в действии ионизирующего излучения на объект, в том числе и на ферменты в зависимости от условий, заключается в вариации радиационно-химического выхода продуктов радиолиза (т.е. их количества на 100 эВ поглощенной энергии). Соответственно изменяется либо качественный состав этих продуктов при косвенном облучении (т.е. при непосредственном первичном контакте излучения с растворителем, когда на вещество действуют продукты радиолиза воды), либо ионной трек (при прямом действии излучения). Отличие от действия других видов радиации определяется уменьшением длины волны (<100 нм) и возрастанием энергии (область ионизации начинается с 5 эВ).
Данная работа проводилась в течение достаточно длительного времени и представляет обобщенное исследование, посвященное. 1 - разработке комплексного метода (радиоэнзимологии); 2 - его применению для изучения структуры и каталитических свойств трех видов ферментов: сериновых протеиназ (на которых отрабатывался метод), растительных пероксидаз и металлосодержащей гидролазы - ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), и 3 - применению для целей фармацевтической химии с целью создания и классификации новых лекарственных средств. На основании результатов разработаны общие методологические подходы к использованию данного метода и получены принципиально новые данные по свойствам изученных объектов, являющихся лекарственными средствами или их мишенями.
7
Базовая концепция работы основана на существовании набора допустимых конформационных состояний для каждого фермента, которые существуют в равновесии и могут реализовываться преимущественно в строго определенных условиях. Конформационные изменения молекулы и ее активного центра на первом этапе носят колебательный (обратимый или равновесный) характер (при малых дозах), что соответственно может выражаться в дозовом ответе молекулы фермента в виде эффектов при строго определенных в данных условиях дозах. Кроме того, мы считаем, что сложные ферментные молекулы имеют несколько различных степеней защиты, которые также определяются возможностью изменения конформационного состояния (опять же из числа изначально определенных его структурой и классом). Защитные "действия" молекулы могут протекать без потери каталитической активности (или с протеканием ее чередующихся изменений) при наличии точечных модификаций, которые затем ведут к постепенному разворачиванию с потерей каталитической активности. Т.е., другими словами, мы считаем основополагающим, что конформационные изменения (вызванные точечными модификациями или волновыми явлениями) могут первоначально являться обратимыми, вызывающими конформационный дисбаланс, как форму сохранения структуры и ферментативной активности и характеризуют адаптацию молекулы в данной среде и условиях. При более высоких дозах они становятся необратимыми, что приводит к изменению доступной поверхности молекулы в целом и, соответственно, ее активного центра, т.е. к необратимой инактивации. При этом набор допустимых конформаций и степеней защиты определяется конкретной функцией фермента. Кроме того, существуют особые точки на дозовой кривой, определяемые дозой в совокупности с мощностью дозы и спектром облучения, которые могут на любой стадии воздействия, т.е. даже при очень малых дозах, приводить к фиксации определенной конформаций, т.е. к необратимым изменениям, сказывающимся и на каталитической активности. Особенно важной является в структуре фермента функция остатков триптофана, для которых, по предложенной нами гипотезе, при радиолизе в водных растворах может происходить поворот ароматического кольца с одновременным изменением функционирования активного центра. Это особенно важно в случае ферментов, содержащих единственный остаток тритофана.
8
В работе представлена математическая модель, описывающая конкретный дозовый ответ фермента в условиях существования активации. Она же дает описание условий появления так называемых триггерных эффектов.
S*, В качестве прикладного результата совместно с лабораторией
органических меченых соединений кафедры радиохимии разработана прогностическая протеазная модель для анализа органических веществ - потенциальных радиомодификаторов, являющихся лекарственными средствами - при синергическом действии совместно с ионизирующим облучением. В модели может
: использоваться для обсчета метод QSAR и она имеет перспективу
для применения в фармахимии и радиоэкологии. Однако наиболее важной ее возможностью является применение в радиотерапии совместно с химиотерапией для анализа эффективности и опасности применения в этих случаях различных лекарственных
¦ препаратов совместно с радиацией.
1 Вторым приложением работы является создание совместно с
кафедрой химической энзимологии (лаб. д.х.н. Казанской Н.Ф.) бессеребряных радиодозиметрических материалов, действие которых основано на инактивации протеиназ. На эту работу было получено авторское свидетельство СССР.
Глава I.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. РАДИАЦИОННАЯ ИНАКТИВАЦИЯ
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
1.1.1. Сериновые протеиназы.
Поведение сериновых протеиназ при облучении как в твердом виде, так и в растворах изучено наиболее тщательно. В литературе детально рассмотрены вопросы, связанные с механизмом радиационного повреждения трипсина и химотрипсина (ферменты поджелудочной железы) и некоторых субтилизинов (ферменты микроорганизмов, продуцируемые различными штаммами Bac.Subtilis). Значительно менее изучены в этом отношении ферменты крови (тромбин, плазмин), а по некоторым ферментам информация в литературе не встречаются. Это связано с тем, что такие ферменты как трипсин, химотрипсин, пепсин и папаин были получены достаточно давно и изучались много и плодотворно. Немаловажно, что для большинства из них известна третичная структура [5] . Методом радиационной инактивации уже в 50-е годы были получены данные об их молекулярных массах [6] Применение метода в этом направлении было развито позднее для сложных структур [4,7-9], а в дальнейшем метод использовался для их структурного изучения.
Облучение ферментов в твердом состоянии является первой ступенью исследования, так как дает возможность изучать последствия прямого действия излучения, а не вторичных продуктов радиолиза среды. Считается, что при облучении биохимических объектов в сухом состоянии место действия радиации локализовано в точке попадания, в отличие от растворов, где эффективный объем реакции увеличивается за счет диффузии продуктов радиолиза воды. Однако в твердом состоянии при облучении фермента происходит передача энергии по молекуле до ее наиболее радиочувствительной составляющей, что значительно увеличивает эффективный объем, доводя его иногда до размеров домена или даже всей молекулы [10], и в то же время в замороженных растворах может наблюдаться локализация центра взаимодействия [11]. Анализ таких процессов проводится с помощью теории мишени [12], что в ряде случаев дает возможность сделать выводы о структурной организации сложных ферментных систем. В частности, это было продемонстрировано на примере кальмодулинзависимой фосфодиэстеразы [13] и компонентов системы аденилатциклазы в эритроцитах [14]. Присутствие или влияние активатора или ингибитора предлагалось
10
определелять в этих случаях по виду дозовой зависимости [8], однако, это не всегда верно. В ряде случаев предлагалось оценивать роль переноса энергии в сложных олигомерных субъединицах облучаемого объекта, если возможно моделирование диссоциации олигомерного комплекса [8,13,15,16].
В литературе имеются сведения по инактивации следующих сериновых протеиназ в твердом или иммобилизованном состоянии: трипсина [11,17-19], пепсина [11], химотрипсина, субтилизина и карбоксипептидазы [17,18]. Общепринятая точка зрения заключается в том, что при облучении возникают два взаимосвязанных процесса: радикалообразование и инактивация при прямом попадании в активный центр молекулы. Радиационно-химический выход радикалов равен -1-7. Вид образующихся радикалов в белках подробно разбирается в литературе [20]. Была получена информация о распределении углеродных радикалов при у- облучении а-химотрипсина при 195К, которые предшествуют вторичным радикалам, видным при 295К. Их так и разделяют на две группы: образующиеся при Т<195 К - они не зависят от аминокислотной последовательности фермента - и образующиеся при Т>195 К - они целиком зависят от конформации молекулы фермента, точнее от доступности отдельных аминокислот и активного центра [21].
Основной характеристикой радиационного процесса является дозовая кривая, т.е. зависимость эффект-доза, называемая дозовым ответом, где в случае энзимов эффектом является изменение каталитической активности. Вид таких зависимостей может быть разным, обычно в литературе описываются экспоненциальные дозовые кривые. Однако, очевидно, что, как и для живых организмов [22], эти кривые могут в ряде случаев быть S-образными или иметь различные отклонения от экспоненты. Математическое обоснование таких отклонений было сделано в работах [23,24] на основе более точного учета изменения концентрации радикалов в процессе радиолиза папаина.
Особенно часто неэкспоненциальные кривые наблюдаются при облучении ферментов в виде растворов, хотя и для кристаллических сериновых протеиназ такие данные имеются. Например, на рис.1 приведены дозовые кривые инактивации трех сериновых протеаз в твердом состоянии. Как видно, для кристаллических трипсина [19] и а-химотрипсина [25] наблюдаются прямолинейные дозовые зависимости в условиях соответственно у- и Х- облучения до доз 110 кГр. В то же время
и
' ' I ' '___I___I---1---1---1---1
10
110 D/kGy
Рис. 1. Радиационная инактивация ферментов в кристаллическом состоянии: 1 - сс-химотрипсин (рентгеновское излучение) , 2 - трипсин (у-излучение), 3 - гликозидаза+каталаза (рентгеновское излучение), 4 - субтилизин-72 (рентгеновское излучение).
12
для субтилизина-72 (Х-облучение) [25] эта зависимость приближается к экспоненциальному виду.
Обращаясь к иммобилизованным ферментам, следует отметить, что для них имеет место повышение стабильности по сравнению с нативными, и поэтому радиолиз иммобилизованных ферментов активно используется в медицине, в частности, при получении перевязочных материалов. Была сделана попытка моделировать механизм воздействия ионизирующего излучения на иммобилизацию в системе органическая основа - фермент через исследование получающихся радикалов. Такие работы проведены для трипсина, иммобилизованного на диальдегидцеллюлозе (ДАЦ), в сравнении с чистым трипсином [26,27]. Интервал доз облучения составлял 0,05-10 Мрад (0,5-100 кГр). Проведено сравнение спектров ЭПР для иммобилизованного и нативного фермента, а также для подложки, и это позволило авторам предположить, что увеличение стабильности иммобилизованного трипсина связано с рекомбинацией радикалов трипсина с радикалами ДАЦ и с миграцией их к ослабленным связям в ДАЦ. При облучении активность иммобилизованного трипсина не меняется, в то время как нативный трипсин теряет 25% своей активности при дозе 100 кГр [27]. Такая стабильность позволяет применять иммобилизованные протеиназы в ферментотерапии с использованием у-стерилизации, так как трипсин, иммобилизованный на ДАЦ может храниться в жестких условиях весьма длительное время. Сравнение поведения ферментов при у-облучении водных растворов и иммобилизованных на нейлоновых волокнах показало [28], что не все ферменты в иммобилизованном состоянии значительно повышают свою радиорезистентность, однако, этот вывод не относится к протеиназам, в частности, и к сериновым.
Радиолиз водных растворов сериновых протеиназ описан в литературе наиболее полно. Основной особенностью этого процесса является достаточная устойчивость к действию ионизирующего излучения активных центров, содержащих остаток серина, в то время как уязвима конформационная устойчивость молекулы. Было показано [29,30], что основной вклад в инактивацию сериновых протеиназ вносят ОН-радикалы, получаемые при радиолизе воды. Это легко подтверждается при облучении химотрипсина в среде N2O, где происходит увеличение количества ОН-радикалов за счет реакции:
e-aq + N2O + Н2О -> ОН- +ОН" +N2
13
V
В этом случае наблюдается соответственно и увеличение радиационно-химического выхода инактивации.
Каждый получающийся в результате радиолиза воды радикал имеет свой коэффициент поражаемости (характеризует эффективность инактивации фермента при атаке данного активного вида) в зависимости от облучаемого фермента. Для химотрипсина и папаина они получены и приведены в таблицах 1(1) и 2(1) [2,3].
Таблица 1(1). Радиационно-химические выходы радика-лообразования (Gr) и инактивации (Gm) в водных растворах химотрипсина и папаина при у-облучении в различных условиях.
Среда Радикалы Gin Эффективность инактивации, f Gr f/Gr
а-химотрипсин
Воздух OH 0.265 0.266 2.8 0.095
N2O 2OH H 0.83 0.30 0.7 0.43
N2O +t-BuOH H 0,091 0.091 0.7 0.13
Ar OH H 0,61 0,044 2,8 2,6 0.17
Ar +t-BuOH H 0.234 0.143 2.6 0.055
Папаин
N2O OH H - - 5,9 0,43
Таблица 2(1). Эффективность инактивации ферментов продуктами радиолиза
14
воды.
V
Реагенты Трипсин[32] а-Химотрипсин [30]
Н 0,1 0,13
ОН 0,05 0,137
0,09 0,055
Н2О2 0,04 -
но2 0,03 -
В некоторых случаях были определены константы скоростей реакций с продуктами радиолиза воды (табл.3(1)). Показано, что изменения, вызванные радикалами ОН и Н, приходятся в химотрипсине, в основном, на остатки триптофана, а -15% гидратированных электронов реагируют по S-S связям.
Таблица 3(1). Величины констант скоростей реакций протеиназ с продуктами радиолиза воды (у-облуче-ние).
Вещество k 10"10, М"1 с"1 еач" ОН О2" Ссылка
Белки 5 1-6 <10'7 10
Химотрипсин - 3,7 +0,4 - 33
Папаин 4,1 4,7 - 34
В работах [35,36] разрабатывался механизм инактивации химотрипсина с использованием метода радиационной инактивации. Методом тритиевого обмена [31,36] было зафиксировано изменение доступной поверхности глобулы, так как метод позволяет ввести Т-метку только в поверхностные (экспонированные) участки молекулы. Скорость обмена по мере роста дозы облучения от 30 до 50 Гр увеличивалась на 16% по сравнению с необлученным ферментом. К сожалению, этот метод, развитый позднее в метод тритиевой планиграфии [37] и позволяющий не только оценить величину доступной поверхности биомолекулы, но, в ряде случаев, сделать выводы о третичной
15
структуре [38], используется пока недостаточно для исследований в биохимии.
В работе [35] были дополнительно использованы методы флюориметрии, микрокалориметрии и вискозиметрии с целью выяснить на примере Хтр, какие аминокислотные остатки наиболее важны на первоначальных стадиях облучения и к каким изменениям в молекуле это приводит. Авторы сделали вывод о первоначальном разворачивании глобулы и нашли корреляцию между радиационно-химическим выходом разворачивания (Gpa3B.) с радиационно-химическим выходом разложения остатков триптофана [G(-Trp)] - (табл.4(1)). В то же время данные по связыванию профлавина [39] показали, что одновременно происходят локальные стерические изменения около субстрат-связывающих центров. Указанные факты в этих работах приведены для доз облучения, начиная с ~ 2 кГр в процессе протекающей инактивации.
Важно, что повреждения дисульфидных мостиков не происходит при дозах, определяющих изменение остатков триптофана и тирозина, а имеет место при больших дозах облучения. Поэтому этот процесс не играет существенной роли в первоначальном нарушении каталитической активности.
Таблица 4(1). Сравнение радиационно-химических выходов разворачивания молекул фермента (GPa3B) и инактивации (Ghh.) с радиационно-химическим выходом разложения аминокислотных остатков. Данные [35] и автора.
Фермент Усло- GpasB- Ghh. G(-Trp) G(-Tyr) Gf-Тпз) Gf-Tvrt
вия облучения Gpa3B.
Трипсин НС1,рН 3,0 0,37 - 0,9 - 2,4 -
Химотри псин НС1,рН 3,0 0,43 - 1,2 - 2,8 -
Трисин н2о, рн 6,6 0,32 - 0,7 - 2,2 -
Химотри псин Н2О, рН 6,6 0,31 - 1,1 - 3,5 -
Трипсин Глицин овый 0,26 - 0,6 - 2,3 -
16
V
буфер, рН6,9
Химотри псин Глицин овый буфер, рН6,9 0,18 0,6 2,5
Трипсин Фосфат ный буфер 0,36 0,9 2,5
Химотри псин Фосфат ный буфер 0,30 0,9 3,0
Субтили-зин-72 (данные автора)/ 0,Ш NaCl, рН5,6 0,23 0,19 0,35 0,82 1,5
Субтили-зин-72 (данные автора) 0,1 М NaCl+ NaOH, рН8,5 0,29 0,20 0,55 0,69 1,9
Субтили-зин-72 (данные автора) Ацетатн ый буфер, рН5,0 0,19 0,22 0,73 1,2 3,9
Так, при дозе 0,5 кГр в химотрипсине наблюдали 5,5 связей S-S, при 0,8 кГр - 4 [36]. В работе [36] было также проведено изучение изменения аминокислотного состава химотрипсина от дозы облучения. Использовалирь концентрации растворов 5 10~6 - 10~5М при рН 3,0 (НС1). Радиационно-химический выход инактивации фермента при рН 3,0 оказался выше, чем при рН 6,9, а среди аминокислот наиболее уязвимыми являются остатки тирозина, цистеина, фенилаланина и лизина.
В работе [40] изучали радиационные изменения субтилизина-BPN' и наблюдали корреляцию между падением каталитической активности и разрушением остатков тирозина. Оказалось, что в этом ферменте, в отличие от химотрипсина, играют значительную роль остатки гистидина. Так, при у-облучении дозой 1,1 кГр субтилизин-BPN' лишается двух остатков тирозина, одного остатка триптофана, одного гистидина и одного метионина. Реакция с диизопропилфторфосфатом показывает, что при этом 85%
17
V
активных центров сохранены. При дозе 2,4 кГр появляются изменения в остатках лейцина, пролина, фенилаланина, серина и аланина. При этом окисление метионина не приводит к инактивации субтилизина-BPN' [40], но существенно для субтилизина-Carlsberg [41], который, по данным работы [42], отличается от субтилизина-BPN' существованием ряда повторяющихся сегментов в полипептидной цепи. Использование метода электрофореза для изучения облученного субтилизина-BPN' показало наличие большого электрического заряда по сравнению с нативным при отсутствии изменений в каталитической активности. Это находится в согласии с более ранними предположениями, что меньшие дозы облучения приводят к образованию неинактивированных молекул, которые, однако, отличаются от нативных. Появление таких молекул подтверждается изменением кинетических параметров - константы Михаэлиса (Км) и максимальной скорости каталитической реакции (Vmax) [40,43,44]. Облучение разбавленных растворов ведет к увеличению Км и уменьшению Vmax как в случае химотрипсина, так и субтилизина-BPN' (табл.5(1)). Поскольку при меньших дозах существенное участие в инактивации химотрипсина принимают остатки триптофана, и так как в рибонуклеазе, не имеющей этих остатков, никаких изменений в величинах Км и Vmax не происходит [45], то первую стадию поражения, связанную с конформацией, большинство авторов связывают с модификацией остатков триптофана. К аналогичным выводам пришли авторы работы [46], которые облучали химотрипсин и химотрипсиноген.
Таблица 5(1). Изменение кинетических парамет-метров у облученных протеиназ.
Фермент Условия облучения Вид излучения Доза КГр Число активных Км М * max м мин'1 Субстрат Ссылк и
цент- мг*1
ров
Субтил изин-72 0,1М КС1, 30 С, рН 7,5 У 1,00 4,9 ю-2 7,6 102 АТЭЭ [40]
Субтил изин-72 0,1М КС1, 30 С, рН 7,5 0,95 0,86 5,6 ю-2 7,6 102 АТЭЭ [40] |
