СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
активность мклюль
АХЭ
эритроцитов,
мин ¦ ли САЭ - средняя активность АХЭ
эритроцита, 10 -----------
мин • эр
АКО - активность АХЭ клеточного объема эритроцита,
ск - стволовая клетка
с.-х. - сельскохозяйственные
животные
т, -моной одтирози н;
т2 - дийодтирозин;
Тз -трийодтиронин;
т4 - тироксин;
8 мкмолъ • /л
мин • эр
АХ - ацетилхолин; АХЭ - ацетилхолиэстераза; АКТГ - адренокортикотропный гормон;
КА - катехоламины; КОЕс - полипотентные клетки
костного мозга, формирующие
колонии в селезенке и костном
мозге; КОЕ- Э — колониеобразующая
единица эритроцитарная
НА - норадреналин; ОАС - общий адаптационный синдром;
ТТГ - тиреотропный гормон;
цАМФ - циклический аденозин-
монофосфат;
цГМФ - гуанозинмонофосфат; ЭА - электроанальгезия; эр - эритроцит; Kj - ингибирующая константа;
циркулирующей
окисление Утах
ОЦК - объем крови;
ПОЛ - перекисное липидов;
С АС - симпато-адреналовая система;
[S] V
- константа Михаэлиса;
константа скорости ингибирования;
- концентрация субстрата;
скорость гидролиза субстрата (ацетилхолина);
- максимальная скорость гидролиза ацетилхолина;
Примечание:, в обзоре литературы иногда приводятся внесистемные единицы дозиметрии облучения (рентген, рад) из оригинальных источников.
-5-
ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. В Концепцию развития ветеринарной науки
на период до 2010 года, в которой определены перспективные и приоритетные направления ее развития, включено и решение теоретических вопросов в области цитологии, молекулярной биологии и др. (Смирнов A.M., Авилов В.М., 1999). В числе этих направлений находится изучение биохимии адаптационных процессов у с.-х. животных. После открытия явления стресса (Селье Г., 1960) и при его последующем разностороннем изучении (Горизонтов П.Д. и соавт., 1983; Судаков К.В., 1997) установлено, что стресс не является только медицинской проблемой (Меерсон Ф.З., 1993), но и проблемой ветеринарной медицины (Голиков А.Н, 1985, 1999; Давыдов В.У., 1986; Никитченко И.Н. и др., 1988; Ипполитова Т.В., 1989, 1999; Байматов В.Н., Волкова Е.С., 2001 и др.). Считается, что воздействие стресс-факторов является патогенетической основой для 90% случаев незаразных заболеваний сельскохозяйственных животных (Фурдуй Ф.И., ред., 1986). Стресс возникает при содержании, эксплуатации животных и птиц (Ковальчикова М.,Ковальчик С, 1978; Надводнюк А.И. и соавт., 1987; Волчков А.И., 2000), а также при их транспортировке (Кузнецов А.Ф., Пастухова Л.А., 1985; Буянов A.A. и др., 1994), вакцинации и формировании иммунитета (Болотников И.А., Конопатов Ю.В., 1987), при воздействии УФ-облучения (Стекольников A.A., 1985; Лебедев A.B. и др., 1988; Рудаков В.В. и др.. 1988), постоянного электрического поля (Андреева Н.Л., 1987). Особое значение стресс-факторы имеют в промышленном животноводстве. В практике ветеринарной медицины значительное место занимают травматический и операционный стрессы (Семенов Б.С., 1978; Видении В.Н., Макеева Е.Е., 1995; Шахмарданов З.А., 1999), в том числе при кастрации животных (Соколов В.И., 1974).
-6-
Воздействие различных видов энергии на животных характеризуется . как воздействие стрессогенных факторов (Злобин B.C., 1981; Горизонтов
П.Д. и соавт., 1983; Докшина Г.А., 1984; Киршин В.А. и др., 1986; Фролов В.П., 1993; Дешевой Ю.Б. и соавт., 1996; Барабой В.А., Олейник CA., 1999; Идрисов Г.З., Ситдиков Р.И., 2000; Лысенко Н.П., 2000). Определенные проблемы в животноводстве могут вызывать гомеостатические стрессы, обусловленные голоданием или изменением компонентов рациона (Панин Л.Е., 1983; Жаров A.B., 1995) и стрессиндуцированная гипотрофия (Лютинский СИ. и др., 1989). Злободневны стрессы инфекционной и паразитарной этиологии (Бочкарев В.Н., 1990). Стресс у животных возникает не только в вышеперечисленных условиях, но и в условиях повышения стрессогенности экологических факторов (Zlobin V., Neniskiene V., 1989; Маслов СП., 1994; Ильязов Р.Г. и др., 1996) и природных катаклизмов, воздействии техногенных факторов, катастроф и других факторов, генерирующих экстремальные состояния (Куценко CA., 1994; Иванов К.П., 1994; Плющиков В.Г., 2001).
Необходимость изучения стрессов, вызываемых острой кровопотерей и часто встречающихся как в медицинской практике (Брюсов П.Г., 1997), так и в практике ветеринарной медицины, диктуется их частотой и не подвергается сомнению.
Усиливающаяся стрессогенность условий животноводства (Плященко СИ. и соавт., 1987; Жученко A.A., 1994; Белов А.Д., Лысенко А.П., 1997; Баранников В.Д. и др., 1997) требует адекватного решения - оценки стрессоустойчивое™ с.-х. животных (Кокорина Э.П., 1986) и создания эколого-адаптационной стратегии ветеринарной защиты их здоровья и обеспечения высокой продуктивности (Селиверстов В.В., Шахов А.Г., 2000). В связи с этим встает проблема не только ведения адаптивного у животноводства (Надводнюк А.И. и соавт., 1987; Хайдарлиу С.Х., 1991;
Монастырев A.M., Фенченко Н.Г., 2001), но и, в первую очередь, изучения
-7-
биохимических и физиологических механизмов адаптации (Панин Л.Е., 1983; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Фурдуй Ф.И., 1986: 1990; Голиков А.Ы., 1999; Ипполитова Т.В., 1999), регуляции гомеостаза (Жаров A.B. и соавт., 1989, 1995). На этой основе возможны разработки диагностических методов оценки стрессовых состояний (Гуськова A.M. и др., 1999; Ланкин B.C., 2000) и создание стрессофармакологии с целью лекарственной коррекции стрессовых состояний у животных (Соколов В.Д., Андреева Н.Л., 1990). Для фармакологической коррекции стрессовых состояний животных необходимо знать физиологические и биохимические механизмы стресса (Панин Л.Е., 1983). Адаптация может возникнуть только с изменением регулирующих систем, например, ферментных, и без изучения последних невозможно проникнуть в механизмы приспособления целых организмов (Ковальский В.В., 1974). Особенно это касается изучения неиромедиаторных механизмов стресса и адаптации и, в частности, холинергических (Тонкоглас В.П., 1980; Кассиль Г.Н., 1983; Скопичев В.Г., Пруцков В.И., 1988; Попов СМ., 1989; Хайдарлиу С.Х., 1989; Максимова О.П. и др., 2000), которые относятся к нейроэндокринным стресслимитирующим системам (Новиков B.C. и соавт., 1998).
Одним из важнейших компонентов холинергической системы и маркером холинергических элементов является фермент ацетилхолинестераза (АХЭ) (Батоева Т.Ц., 1985; Рощина В.В., 2000; Parent А. et al., 1976). Как известно, АХЭ занимает особое положение среди множества ферментов. Это объясняется тем, что она играет центральную роль не только в таком биологически важном для организма процессе как передача нервного импульса, но и в регуляции обмена веществ (Фурдуй Ф.И., 1986). Изучению роли холинергических систем в регуляторных механизмах биохимических процессов в организме вообще (Денисенко П.П., 1980; Турпаев Т.М. и соавт., 1981; Кассиль Г.Н., 1983; Голиков Н. и
-8-
соавт., 1985; Беллер H.H. и соавт., 1986) и при острых действиях стресс-факторов, в частности (Денисенко П.П., 1978; Демин H.H., 1979;
'* Тонкоглас В.Л. и соавт., 1980; Горизонтов П.Д., 1983; Фурдуй Ф.И., 1986;
Тайц М.Ю. и соавт., 1988; Липшиц Р.У. и соавт., 1989; Хайдарлиу С.Х., 1989; Судаков К.В., 1992; Konecka A., 1992), придается большое значение. Считается, что АХЭ, как важный компонент холинергической системы, занимает ключевую позицию в неирогуморальнои регуляции (Марченко А.Ф. и соавт., 1980), а изменение ее активности по существу является одним из интегральных тестов не только холинергических, но и других медиаторных систем. Показано также (Суворова Н.В., Суворов В.В., 1975), что активность ХЭ по сравнению с содержанием АХ является более стабильным показателем и в большей степени отражает характер реагирования холинергических систем при изменении условий среды и способности к адаптации.
Следует отметить, что вышеизложенное относится к АХЭ мозга, нервных элементов и других органов. Что же касается АХЭ эритроцитов, то ее физиологическая роль полностью не установлена. До недавнего времени (Бородюк Н.Р., 1990, 2000; Брагинская Ф.И. и др., 1990; Маслова М.Н., 1994; Казеннов A.M., Маслова М.Н. и др., 1999; Somani S.M., 1995; Grisaru Dan et al., 1999) АХЭ, как фермент эритроцитов, практически не изучалась с точки зрения участия в обмене веществ при адаптации организма. Причиной этому могут служить обстоятельства, связанные с необходимостью определения активности АХЭ при стрессе в нативных эритроцитах. Выбор нами эритроцита, как объекта исследования, объясняется сравнительной простотой его морфологии и, в связи с этим, возможностью абстрагирования от влияний на активность АХЭ многих продуктов обмена веществ самой клетки. С другой стороны,
|. плазматическая мембрана эритроцита, как важнейший элемент клетки,
содержит центры специфического связывания биологически активных
-9-
веществ (инсулин, СТГ, АХ, ?-адренергические центры и др.), что свидетельствует об ее участии в передаче сигналов гормональной и нервной систем (Казеннов A.M., Маслова М.Н., 1987) и может иметь значение для коррекции реакции на стрессовые воздействия. Систематическое изучение АХЭ нативных эритроцитов при воздействии на сельскохозяйственных животных условий, однозначно характеризующихся как стрессовые, дало нам возможность интерпретировать полученные результаты с позиции развития адаптационного синдрома.
Стресс проявляется на различных (морфологическом и физиологическом) уровнях организма животного: молекулярном, клеточном, органном и системном. Выполненные нами исследования по изучению действия ионизирующей радиации на АХЭ, полученной из эритроцитов, на АХЭ целых эритроцитов in vitro и на АХЭ целых эритроцитов in vivo могут помочь проследить за стрессогенным изменением изучаемого фермента на различных уровнях его функционирования.
Из анализа источников литературы следует, что такие воздействия на организм животных как хирургическая операция, острая кровопотеря, кровопаразитарная патология, алиментарный дискомфорт, воздействие дийодтирозина, ионизирующее излучение широко распространены в практике ветеринарной медицины и являются факторами стрессогенной природы. Изучение литературы по исследованию активности АХЭ при воздействии на сельскохозяйственных животных вышеперечисленных стрессоров свидетельствует о недостаточной изученности вопроса о сопряженном изменении эритрона и кинетических характеристик фермента АХЭ целых эритроцитов крови в процессе формирования стрессовой реакции, развития адаптационного синдрома.
-10-
Целью исследования являлось установление направления эволюционной трансформации АХЭ нативных эритроцитов крови на основе изучения ее кинетических свойств у различных видов млекопитающих и человека и подтверждение его направленностью изменений фермента в условиях воздействия на животных адаптогенных факторов.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить активность АХЭ нативных эритроцитов крови, среднюю активность АХЭ эритроцита, константу скорости взаимодействия фермента с ингибитором необратимого действия (Кц) у с-х. животных нескольких видов и оценить их как результат эволюционного процесса.
2. Изучить закономерность адаптационного изменения некоторых характеристик эритрона и активности АХЭ нативного эритроцита при воздействии на животных следующих факторов стрессогенной природы: хирургической операции в условиях электроанальгезии, электроакупунктурной анальгезии, проводниковой анестезии, искусственной геморрагии, гемолитической анемии, изменения состава кормового рациона, воздействии рентгеновских лучей, введения дийодтирозина, ограничивающего в определенной степени стрессовую реакцию.
3. Исследовать в сравнительном аспекте изменение количественных и морфологических параметров эритроцитов и кинетических характеристик АХЭ этих клеток в динамике адаптационного синдрома.
4. Выявить гидролитические возможности АХЭ эритроцитов в условиях воздействия дистрессора на фермент in vitro и оценить их с позиции наличия потенциального резерва адаптационных свойств фермента.
-11-
5. Разработать рекомендации по применению в практике ветеринарной медицины результатов исследования активности АХЭ целых эритроцитов крови животных при адаптации к воздействию стрессогенных факторов.
Научная новизна. Установлен видовой ряд млекопитающих по возрастающему значению средней активности АХЭ нативного эритроцита мыши, собаки, норки, лошади, кролика, овцы, свиньи, крупного рогатого скота и человека, отражающий направление эволюционной трансформации фермента и ее зависимость от экологических и доместикационных факторов. Такое направление подтверждается направленностью изменений АХЭ в условиях воздействия на животных адаптогенных факторов, встречавшихся на эволюционном пути развития млекопитающих.
Проведено комплексное исследование АХЭ целых эритроцитов, сообразуясь с морфологическими параметрами клеток при стрессовом состоянии животных и в динамике адаптационного синдрома.
Впервые для анализа стрессового состояния и развития адаптационного синдрома использованы следующие величины: средняя активность АХЭ эритроцита, Кц (константа скорости ингибирования АХЭ) в сочетании с изменением его морфологического параметра - объема.
Впервые определены кинетические характеристики АХЭ на высокоочищенных препаратах фермента отечественного производства, АХЭ целых эритроцитов при облучении in vitro и in vivo и интерпретированы с позиции проявления стрессовой реакции на молекулярном, клеточном уровнях и на уровне организма.
Исследования по изучению АХЭ целых эритроцитов в динамике адаптационных процессов впервые выполнены на крупных сельскохозяйственных животных или животных, имеющих сельскохозяйственное значение.
- 12-
Установлено, что эндогенный ингибитор АХЭ эритроцитов, выделяющийся при стрессах, устойчиво фиксируется на эритроцитах, не отмывается физиологическим раствором и способствует парасимпатическим проявлениям в организме.
При стрессовых проявлениях умеренного (физиологического) характера активность АХЭ целых эритроцитов увеличивается для превалирования симпато-адреналового звена, имеющего
мобилизационный характер. При дистрессах уменьшение активности фермента трактуется с позиции необходимости усиления парасимпатического эффекта для снижения темпа чрезмерного расходования энергетических ресурсов, защиты сердца и других важнейших органов.
Установленное при дистрессах изменение активности АХЭ целых эритроцитов является тестом состояния холинергических процессов и их смещения в равновесной системе: симпатический - парасимпатический (холинергический) отделы вегетативной нервной системы.
Теоретическая и практическая ценность работы. Изучение кинетических свойств АХЭ нативных эритроцитов крови различных видов животных и человека позволило установить их возрастание от млекопитающих животных к человеку и зависимость эволюционирования системы АХЭ-эритроцит от экологических и доместикационных факторов. Однонаправленное изменение кинетических констант фермента АХЭ эритроцитов у животных в процессе формирования адаптационно-компенсационных механизмов в стадии резистентности общего адаптационного синдрома после воздействия на животных различных адаптогенных факторов совпадает с направлением эволюционного совершенствования фермента и его носителя — эритроцита. Установленные биохимические и морфологические изменения эритроцита являются адаптивным отражением стрессорных воздействий,
-13-
встречавшихся на эволюционном пути развития, следствием молекулярных механизмов эволюции и отражает адаптивность эволюционного процесса.
Теоретическая значимость работы состоит и в том, что она позволяет представить взаимодействие двух отделов вегетативной нервной системы при стрессах на основе химического равновесия концентрации веществ в крови, осуществляющих симпато-адреналовую и парасимпатическую функцию. АХЭ целых эритроцитов является триггером этого равновесия, с помощью которого оно может продолжаться или смещаться скачком по сигналу непосредственно от центральной нервной системы, или — через гормональную систему.
Практическая ценность работы заключается в том, что коррекция стрессовых состояний и адаптационного синдрома у животных в условиях промышленных технологий, стихийных бедствий, аварий, катастроф может быть основана на возможности сдвига равновесия между симпато-адреналовым и парасимпатическим звеньями вегетативной нервной системы путем воздействия лекарственных препаратов - ингибиторов и активаторов - на АХЭ целых эритроцитов. Для практической ветеринарной медицины могут иметь значение результаты по определению силы реакции организма при болевом стрессе в условиях различных видов обезболивания по степени изменения активности АХЭ целых эритроцитов крови животных при полостных операциях. Кроме того, использование величины средней активности АХЭ эритроцита, как методического приема, способствует более раннему выявлению начала адаптационного механизма повышения активности АХЭ при дистрессах, чем это следует из расчета активности фермента на 1 мл крови (эритроцитов). Эта величина может найти применение в лабораторной практике, отражать интенсивность адаптационных процессов в нервной
-14-
системе и костномозговом кроветворном процессе и, таким образом, иметь прогностическое значение.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Видовое значение кинетических свойств АХЭ эритроцита млекопитающих отражает филогенетическое совершенствование фермента и его носителя в направлении видов, занимающих верхние ступеньки эволюционной лестницы, а также зависимость этого процесса от воздействия экологических факторов и доместикации. Эволюционная направленность совершенствования фермента подтверждается улучшением его кинетических свойств у животных в стадии резистентности общего адаптационного синдрома после воздействия стрессогенных факторов.
2. Устойчивые изменения эритрона и кинетических свойств АХЭ эритроцита после воздействия на животных стрессогенных факторов отражают фенотипический процесс адаптации и характеризуют сдвиг адаптационных процессов на новый уровень.
3. Для анализа адаптационных процессов, состояния эритроцитарного равновесия и равновесия между симпато-адреналовым и холинергическим отделами нервной системы может быть использована величина активности АХЭ эритроцитов, средняя активность АХЭ эритроцита, активность АХЭ клеточного объема эритроцита (АКО).
4. Проявление стрессовой реакции при воздействии ионизирующей радиации на АХЭ эритроцитов на молекулярном, клеточном уровнях при облучении in vitro и на клеточном уровне при облучении in vivo характеризуется схожестью и различием.
5. Существует необходимость и возможность использования в клинической практике кинетических показателей АХЭ целых эритроцитов и АХЭ эритроцита при адаптационных процессах, изменяющих количество эритроцитов в единице объема крови.
- 15-
Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации изложены и обсуждены на конференциях Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, 8-ой, 9-ой, 10-ой Межгосударственных межвузовских научно-практических конференциях «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (СПб., 1996, 1997, 1998), в материалах II Международной конференции (Белая Церковь, 4-5 июня 1998), на научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии (Казань, 2001), на Первом международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (СПб, 2001).
Внедрение. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедрах биохимии, радиологии и БЖ, патологической физиологии, фармакологии и токсикологии Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины и других академий. При этом используются написанные по материалам диссертации методические указания «Стрессы у животных при стихийных бедствиях, авариях, катастрофах» (Состояние холинергического звена вегетативной нервной системы при дистрессах) (СПб., 1996).
Изданы «Рекомендации по применению в практике ветеринарной медицины результатов исследования активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов крови животных при адаптации к воздействию стрессогенных факторов (СПб., 1998).
Результаты исследований использованы в учебно-методическом пособии по оперативной хирургии для студентов СПбГАВМ: В.Н.Виденин «Послеоперационные гнойно-воспалительные осложнения. Профилактика и лечение».- СПб., Лань, 2000.- 98 с.
Публикация. По материалам диссертации опубликовано 27 статей, в том числе в центральных журналах: «Радиобиология» (3), ВИНИТИ (1),
-16-
«Фармакология и токсикология» (1), «Лабораторное дело» (1); в материалах международной конференции (Белая Церковь) (1); в материалах 8,9,10 Межгосударственных межвузовских научно-практических конференциях (Санкт-Петербург) (3).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 328 машинописных листах и иллюстрирована 34 таблицами и 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, включающего 609 источников, из них 141 - иностранных авторов.
Диссертационная тема «Изменения ацетилхолинэстеразы целых эритроцитов у животных при стрессах», утвержденная на Ученом совете Академии 23 мая 1996 года, протокол № 9, является самостоятельным разделом плана научно-исследовательской работы Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины «Влияние некоторых стрессогенных факторов на активность ацетилхолинэстеразы». Номер Государственной регистрации 01860125583, 1996. На Ученом совете Санкт-петербургской Государственной академии ветеринарной медицины от 6 февраля 2003 г., протокол № 6, изменено (уточнено) название темы докторской диссертации «Адаптационные трансформации
ацетилхолинэстеразы эритроцитов у сельскохозяйственных животных».
Выражаю благодарность Злобину B.C., Самчуку В.И., Чучину В.Н., Стекольникову A.A., Конопатову Ю.В., Лютинскому СИ., Юшкевичу A.C., Курило А.И., Ильюткину Г.Н., Попову СМ; за оказание консультативной помощи в процессе работы над диссертацией и участие в ее обсуждении.
- 17-
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Эритрон и ацетилхолинэстераза. Строение, функция и биологическая роль фермента
Эритроцитам принадлежит важная роль в адаптации человека и животных к условиям внешней среды. Они доставляют в органы и ткани, связанные с АТФ-зависимыми процессами, немедиаторной АХ, катехоламины и инсулин. В результате реакции гидролиза немедиаторного АХ ацетилхолиэстеразой эритроцитов, которая сопровождается ритмическим выделением энергии, эритроциты задают околосуточный ритм и обеспечивают эргонтическую корреляцию АТФ-зависимых процессов со средой обитания. Повреждающее действие физических и химических факторов прежде всего отражается на биологической активности эритроцитов (Бородюк Н.Р., 1990,2000).
Коммитированные в эритроидном направлении стволовые клетки являются первым, наименее зрелым классом клеток, который следует отнести к популяции эритрон. Созревание этих клеток до стадии эритробласта, начинающего синтез гемоглобина, сопровождается изменением их пролиферативной активности и чувствительности к эритропоэтину. Далее в клетках происходят морфологические и функциональные изменения (синтез специфических белков
плазматических мембран и цитоплазмы), свойственные зрелым эритроцитам. В зависимости от стадии зрелости различают эритробласты, пронормобласты, базофильные, полихроматофильные и оксифильные нормоциты и ретикулоциты. Полностью созревание эритроцитов заканчивается в циркулирующей крови, куда клетки выходят из стадии ретикулоцитов.
Таким образом, популяция эритрон состоит из трех функционально различных классов клеток - класса коммитированных, созревающих |
