Введение
На протяжении последних десятилетий сперматозоиды различных животных служили предметом интенсивных исследований. Причины этого предопределены бурным развитием репродуктивных технологий животных и человека. Один из важнейших вопросов такого рода исследований - оценка фертильности сперматозоидов в эякулятах, либо в тех или иных суспензиях сперматозоидов. Известно множество работ, в которых оценивалась жизнеспособность сперматозоидов в соответствии с их морфологическими, физиологическими и биохимическими показателями. Это, прежде всего, двигательная активность сперматозоидов; структура акросомы и выраженность акросомальной реакции; целостность мембраны клетки; активность митохондрий; морфология ядра и состояние хроматина. Однако, до сих пор нет методов, позволяющих гарантированно предсказать фертильность всякого эякулята по отдельно взятым показателям сперматозоидов.
Очевидно, что наиболее достоверной, исчерпывающей характеристикой качества сперматозоидов является успешность оплодотворения (при условии качественности женских гамет). Этот способ, однако, по сути процедуры, достаточно редко приобретает прогностическую ценность. Нарушение нормального (часто недостаточно четко определенного) статуса структурных компонентов сперматозоидов - каждого в отдельности, либо в тех или иных сочетаниях одного с другим - как правило, достаточно для прерывания сложнейшего каскада событий оплодотворения. Из этого следует, что
оплодотворяющая способность сперматозоидов находится в прямой связи с их жизнеспособностью: непосредственно после получения, либо по мере хранения эякулята или суспензии in vitro.
Что такое "жизнеспособность" сперматозоидов? Как конкретизируется это понятие до уровня оцениваемых, измеряемых величин? Для ответа на эти вопросы следует обратиться к общеизвестной, но крайне редко употребляемой в сперматологии, общебиологической закономерности.
Факт полового размножения предполагает чередование различающихся плоидностью поколений, т.е. жизненный цикл организмов. В таком контексте зрелые половые клетки высших организмов есть ни что иное, как гаплоидная форма этих организмов. У позвоночных гаплоидная фаза существования представлена в крайне редуцированной форме. Внутреннее оплодотворение фактически исключает контакт гаплоидных особей с внешней средой многоклеточного протагониста, но предопределяет весьма специфическую среду обитания гамет.
Естественные изменения, происходящие со сформированными мужскими гаметами, нельзя назвать "дифференцировкой", поскольку клетки уже приобрели все черты специализации. Те события, которые происходят на протяжении спермиогенеза, в том числе события процесса капацитации сперматозоидов млекопитающих, более напоминают своего рода онтогенез - онтогенез гаплоидной формы организмов, -несомненно, имеющий собственные, отличные от онтогенеза многоклеточных диплоидных особей, закономерности.
События такого "онтогенеза" гаплоидных форм очевидно (1) осуществляются в пределах одной клетки (2) без регуляционной активности собственного генома.
Признание гаплоидной формы существования организмов позволяет применить методологию и хорошо развитые приемы анализа выживаемости в популяции диплоидных, наделенных "сомой",
организмов (Доронин, Максудов, 2002). Показатели выживаемости, по определению, опосредуют все многообразие жизненных проявлений, и могут служить исчерпывающей интегральной характеристиками.
Ранее мы предприняли попытку такого рода по отношению к женским гаметам - неоплодотворенным, активированным икринкам костистой рыбы (Мохаммедзаде и др., 2002).
Сразу после помещения икринок в адекватный солевой раствор развивается активация яйца. Через 10-15 минут изменяется сферическая форма клетки. Неоплодотворенное яйцо "имитирует" характерные изменения зиготы: бедная желточными гранулами цитоплазма концентрируется на одном из полюсов. Часто протоплазматический бугорок разделяется на две части, имитируя форму двуклеточного зародыша. Позднее клетка отделяет несколько разновеликих фрагментов, часть из которых распадается. В перивителлиновом пространстве на фоне некротических масс длительное время сохраняются один или два отграниченные мембраной фрагменты яйца. В конечном итоге под вторичной яйцевой оболочкой остаются только некротические массы. Именно такие структуры служили свидетельством гибели яйца.
Полученные в результате этого исследования кривые выживания активированных икринок по форме соответствуют известным кривым выживания ряда лабораторных организмов - плодовой мушки, мыши. Такая, достаточно распространенная в животном мире форма кривой выживания свидетельствует о том, что вероятность гибели (полной деструкции) икринки возрастает по мере ее существования. Последнее, будучи в полном соответствии с общепринятым определением, позволяет заключить, что неоплодотворенные, активированные женские гаметы костистой рыбы, экспонированные во внешней среде, испытывают процесс, названный "старением".
Множество переживающих в тех или иных условиях in vitro половых клеток, например, сперматозоидов, возможно представить как своеобразную клеточную культуру. Поскольку эти клетки, по определению, не пролиферируют, такая культура должна быть признана "стационарной" и, соответственно, испытывать "стационарное старение" (Khokhlov, 2000). Старение клеточных культур на протяжении стационарной фазы их существования связывают с изменениями структуры и состояния ДНК (Виленчик, 1987, Хохлов 1988). Поскольку
гаметы транскрипционно пассивны, то последствия стационарного старения смогут проявиться только после активации их генома, т.е. после оплодотворения в составе диплоидного ядра, но никак не участвуют в собственно "старении" переживающих гамет. Иными словами, если гаметы стареют, то механизмы этого процесса следует полагать связанными с изменениями морфологии и функциональных проявлений образующих их структур, но только не ядер.
При исследовании выживания активированных рыбьих икринок мы столкнулись с простым, на первый взгляд, но в действительности очень серьезным вопросом: что считать гибелью яйца? Как следует из приведенного выше краткого изложения материалов исследования, мы приняли, что клетка гибнет тогда, когда полностью разрушаются пограничные мембраны каждого из фрагментов яйца. Можно было бы полагать, что клетка гибнет в момент нарушения исходной целостности, т.е. в момент фрагментации. Определение момента гибели сперматозоида, как следует из представленного ниже исследования, оказалось еще более сложной задачей.
Опираясь на изложенное выше, мы предприняли попытку оценить жизнеспособность зрелых мужских гамет как по динамике изменения их численности, так и в соответствии с "парциальной" динамикой изменения их функциональных проявлений. Для достижения этой цели мы воспользовались достаточно стандартными набором средств для оценки состояния клеточной мембраны, митохондриального аппарата и двигательной системы клеток, регистрируя эти показатели по мере существования суспензий сперматозоидов рыбы и мыши in vitro и сперматозоидов мыши in situ post mortem. Своего рода интегральной оценкой жизнеспособности сперматозоидов служила внутриклеточная концентрация АТФ. Этот показатель опосредует, как минимум, три из названных выше: двигательную активность, деятельность митохондриона и состояние клеточной мембраны.
Обзор литературы
Механизмы специфической активности сперматозоидов Сперматозоиды рыб
У большинства водных видов позвоночных с внешним оплодотворением сперматозоиды неподвижны в семенниках, но приобретают подвижность при высвобождении во внешнюю среду. Продолжительность двигательной активности сперматозоидов рыб после выделения из семенников короток и длится от 20 секунд до 10 минут (Scott, Baynes, 1980).
Движения сперматозоидов зависимости лососевых (Ginsburg, 1963; Турдаков, 1971), щуковых, карповых тресковых и окуневых (Турдаков, 1971, 1972) рыб зависит от температуры среды. Эта зависимость хорошо описывается экспоненциальными уравнениями.
Внутриклеточные механизмы, участвующие в активации движения сперматозоидов пресноводных рыб, в основном, исследовались на сперматозоидах форели и карпа. Для лососевых показано, что отсутствие подвижности зрелых сперматозоидов в семенниках и в семявыводящем канале определяется высоким содержанием ионов калия в этих структурах (Morisawa, Susuki, 1980; Baynes et al., 1981; Boitano, Omoto, 1991). Однако, в семеннике сперматиды и ранние сперматозоиды не способны к движению, прежде всего, в связи с низким содержанием ионов кальция в этой структуре (Billard, Cosson, 1992).
Инициация поступательного движения сперматозоидов связана с повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция, выходящих в цитоплазму из "внутриклеточных депо" (Tinamoto, Morisawa, 1988; Cosson et al., 1989, Boitano, Omoto, 1992). Этот процесс (т.е. выход ионов кальция из депо и движение сперматозоида), в свою очередь, запускается изменением потоков ионов (в частности, ионов калия) и, соответственно, мембранного потенциала клетки (Boitano, Omoto, 1988; 1991; Gatti et al.,
1990). Активация сперматозоидов форели сопровождается также понижением внутриклеточного значения рН. Однако, при блокаде калиевого обмена через мембрану, одного снижения рН недостаточно для активации движения (Boitano, Omoto, 1991).
Движение сперматозоидов форели продолжается 20 - 25 секунд. Частота биения жгутика на протяжении этого периода падает от 60 Гц до 20 Гц (Cosson et al., 1985). С понижением температуры окружающей среды падает частота биения жгута, но удлиняется период подвижности спермиев (Billard, Cosson, 1988). Параллельно с падением частоты биения жгутика понижается внутриклеточная концентрация АТФ (Christen et al., 1987; Robitaille et al., 1987; Billard, Cosson, 1990). Для активации нормального, (т.е. характерного и, вероятно, необходимого для успешного оплодотворения оптимального числа яиц), движения сперматозоидов форели важно поддержание определенного внутриклеточного соотношения циклического АМФ и АТФ (Cosson et al., 1995).
Неподвижность сперматозоидов в семенниках и семенной плазме карпа обеспечены высокой осмоляльностью среды (около 300 - 400 мкосмолей на кг) (Morisawa et al., 1983, Redondo-Muller et al., 1991; Perches et al., 1995). При понижении осмоляльности в результате разбавления пресной водой сперматозоиды приобретают движение, которое длится от 45 секунд до 1,5 минут. На протяжении этого периода падает скорость движения сперматозоидов (от 130 до 10 мкм/сек) и частота биения жгутов (от 50 до 7 Гц) (Cosson et al., 1985; Billard, Cosson, 1992; Perchec et al., 1995).
При помещении сперматозоидов карпа в гипоосмотическую среду наблюдали существенные изменения проницаемости их наружной мембраны, в т.ч. к йодистому пропидию (Marian et al., 1993). Изменение проницаемости к йодистому пропидию происходит скачкообразно. В суспензии сперматозоидов численность меченых йодистым пропидием возрастает градуально, зависит от осмоляльности среды и выходит на
Ю
стационарный уровень (плато) через 5-10 минут после активаций. Предполагается, что изменение проницаемости мембраны связано с реорганизацией двумерной структуры липидов.
Гипоосмотичность среды (<200 - 300 млосмолей/кг) инициирует набухание сперматозоидов в результате поглощения воды (Perchec et al., 1997). Активация движения сперматозоидов сопровождается повышением значения внутриклеточного рН. Экспериментальное повышение или понижение значения рН во внешней среде в пределах от 6,5 до 8,5 не сказывается на движении жгутиков сперматозоидов, но блокируется при внешних значениях рН ниже 6 или выше 9,5. Изменения значений внутриклеточного рН чувствительны к амилориду. Последнее свидетельствует о том, что процесс активации связан с Na+/H+ обменом (Marian et al., 1997).
Внутриклеточное содержание ионов натрия у сперматозоидов карпа равно 62,4±5,3 мМ. Поскольку концентрация ионов натрия в семенной жидкости карпа равна 87±16 мМ, следует полагать, что мембрана зрелых сперматозоидов, находящихся в семенной жидкости, деполяризована (Marian et al., 1997).
При содержании сперматозоидов в среде с высокой осмоляльностью, концентрация АТФ в клетках остается неизменной (Perchec et al., 1995). Активация движения при разбавлении среды сопровождается быстрым падением внутриклеточного содержания АТФ. По мере пребывания в среде с высокой осмоляльностью, все большее количество сперматозоидов приобретает способность к движению. Повторные активации порций сохраняющихся в гиперосмотической среде сперматозоидов в течение 10 минут исчерпывает резерв способных к движению сперматозоидов и внутриклеточный резерв АТФ. Авторы исследования полагают, что гиперосмотичность среды блокирует активную денеиновую АТФ-азу, что приводит к накоплению АТФ в результате деятельности митохондрий (Perchec et al., 1995).
11
Сперматозоиды хрящевых ганоидов (осетров, веслоносов), так же как в предыдущих случаях, неподвижны в семенной жидкости (Linhart et al., 1995; Cosson, Linhart, 1996; Cosson et al., 2000), но немедленно приобретают движение при попадании в наружную пресную или солоноватую воду. Движение спермиев в семенной жидкости блокируется достаточно высоким содержанием ионов натрия в составе последней. Разбавление семенной жидкости в два и четыре раза активирует движение сперматозоидов (Mims, 1991).
Подвижность сперматозоидов (частота биения жгута, скорость поступательного движения) максимальна сразу после активации и постепенно затухает в течение 6 — 10 минут (Cosson et al., 2000). Так же как у карповых, активация сперматозоидов веслоноса инициируется как понижением осмотичности среду (Linhart et al., 1995), так и изменением концентрации и отношения концентраций потенциалобразующих ионов - калия и натрия (Linhart et al.,1995; Cosson, Linhart, 1996; Toth et al., 1997; Cosson et al., 2000; Linhart et al., 2002).
Движение сперматозоидов морских рыб, так же как пресноводных, активируется в результате изменения осмотического давления во внешней среде. В этом случае, гиперосмотическая среда приводит к изменению концентрации и соотношения концентраций потенциалобразующих ионов и высвобождению из внутриклеточных депо ионов кальция (Oda, Morisawa, 1993; Takai, Morisawa, 1995; Darszon etal., 1999).
Любопытны проявления сперматозоидов одного из видов сельди, Clupea pallasi. Самцы этого вида приступают к нересту раньше, чем самки выделяют икру. Сперматозоиды, после выделения во внешнюю среду, остаются неподвижными, взвешенными в толще воды на протяжении нескольких дней (Yanagimachi et al., 1992; Griffin et al., 1998). Подвижность и, соответственно, способность к оплодотворению, спермин приобретают после нереста самок, оказавшись в непосредственной близости к икринкам (Hay, 1985). Активация
12
сперматозоидов обеспечивается кислым гликопротеином, SMIF ("sperm motility initiation factor"), локализованным в хорионе в области микропиле (Pillai et ah, 1993; Griffin et al., 1996). Взаимодействие сперматозоида с SMIF нарушает внутриклеточный ионный баланс: увеличивается поток ионов кальция в клетку, и выход из клетки ионов натрия. Наружная клеточная мембрана при этом деполяризуется (Vines et al., 2002).
Движение сперматозоидов посредством изгибания жгута, так же как движение других, несущих жгутики клеток, осуществляется в результате скольжения микротрубочек в наружных дуплетах аксонемы. Это скольжение предопределено цАМФ-зависимым фосфорилированием динеина, причем наиболее активно фосфорилируются легкие динеиновые цепи (Witman, 1992; Stephens, Prior, 1992; Luconi, Bald, 2003). Описанные выше, вызванные гипо- или гиперосмотическим шоком изменения в проницаемости для ионов клеточной мембраны сперматозоидов рыб, в конечном итоге результируется в повышении внутриклеточной концентрации ионов кальция. Ионы кальция участвуют в механизме движения сперматозоида, являясь кофакторами протеинкиназ или фосфотаз. Последние, в свою очередь, выполняют роль факторов, регулирующих взаимодействие динеина с тубу л ином микротрубочек (Tash et al., 1988).
Иммунохимическое исследование сперматозоидов лосося продемонстрировало существование специализированных органелл — протеосом, содержащих набор протеаз широкого спектра, локализованных в поверхностном слое цитоплазмы вдоль жгута. Протеосомы контактируют как с нуржной рукояткой динеинового комплекса, так и с наружной мембраной (Inaba et al., 1993; 1998). Авторы этих исследований полагают, что протеосомы могут выполнять ключевую роль в фосфорилировании компонентов динеинового комплекса, запуская, либо останавливая этот процесс.
13
Сперматозоиды млекопитающих
Вопрос о судьбе сперматозоидов в половых путях самцов активно дискутировался еще в начале прошедшего столетия. Ряд исследователей (J. Benoit, В.Т. Baldwin, О. Nakano, R.M. Oslund) полагали, что неэйякулировавшие сперматозоиды выводятся из половых путей с мочой (Simeone, Young, 19...). Другие исследователи (C.S. Minot, E. Wertheimer, С. Dubois, H.A Marshall) считали, что невостребованные спермин деградируют в половых путях и поглощаются эпителием, либо клетками подлежащей ткани. Ряд исследователей (С. Wegelin, Z.Morgenstern, J.Lehner, A.Priesel, A. Nemiloff) выдвинули концепцию "сперматофагии", доказывая существование в половых путях "спермифагов".
В результате исследований W.C.Young (1927, 1929 a,b, 1931) выяснилось следующее. Сперматозоиды поступают в эпидидимис незрелыми и дозревают по мере продвижения в этой структуре. Достигнув "зрелости" клетки, по определению автора "стареют", т.е. постепенно теряют способность к проявлению специфической функции и, далее, дегенерируют в cauda epididymis и vas deferens. Любопытно следующее заявление этого исследователя: "The death and degeneration which have been observed in this study are believed, therefore, to be a consequence of age and a natural sequence in a chain of events which is interrupted only if the spermatozoa are discharged". Иными словами, те проявления клетки, которые обычно полагают ее главным предназначением, являются лишь эпизодом ее естественной истории.
В современной литературе чаще употребляется понятие "капацитация", определяемое как еще недостаточно понятый этап созревания сперматозоидов, естественным образом происходящий в половых путях, как самца, так и самки, либо, in vitro, в искусственно созданных средах. В результате этого процесса сперматозоиды млекопитающих приобретают способность к осуществлению акросомальной реакции и оплодотворению яйца (Visconti et al., 1995).
14
Нужно подчеркнуть, что, поскольку у большинства млекопитающих сперматозоиды проявляют в той или иной степени выраженную двигательную активность еще в половых путях самцов, оплодотворяющая способность спермы связывают, главным образом, с успешностью и своевременностью акросомальной реакции, хотя существуют данные, свидетельствующие о существенном изменении подвижности (гиперактивации) капацитировавших сперматозоидов (Neill, Olds-Clarke, 1987).
Капацитация сопровождается реорганизацией состава и топологии поверхностных антигенов спермиев, изменением проницаемости мембраны, возрастанием внутриклеточного пула вторичных посредников (цАМФ, 1Р3, диацилглицерол) и уровня фосфорилирования белков (White, Aitken, 1989; Storey, 1995; Baldi et al., 1996; Visconti, Kopf, 1998).
Среда, окружающая сперматозоиды в период спермиогенеза и капацитации, существенно различается в разных отделах полового тракта. Концентрация ионов натрия в головке эпидидимиса составляет около 100 мМ, но снижается приблизительно вдвое в хвосте эпидидимиса (Jenkis et al., 1980). Концентрация ионов калия изменяется противоположным образом: в головке составляет около 20 мМ, и возрастает до 40 мМ в cauda epididymis. Возрастание концентрации ионов калия в дистальных отделах семявыводящих структур приводит к деполяризации наружной мембраны сперматозоидов и активирует потенциал-зависимые кальциевые каналы (Babcock, Pfeiffer, 1987; Сох, Peterson, 1989; Florman et al., 1992; Beltran et al., 1994). При этом преждевременное созревание сперматозоидов и спонтанная акросомальная реакция предотвращаются, вероятно, сравнительно низкой концентрацией в эпидидимальнои жидкости ионов натрия (Jenkis et al., 1980) и кальция. Низкая концентрация ионов натрия во внешней среде обеспечивает, вероятно, смещение значений внутриклеточного рН в кислую область (Zeng et al., 1996). "Кальциевые депо" в сперматозоидах некоторых видов млекопитающих, вероятно,
15
ассоциированы с акросомой, поскольку именно в области этой органеллы обнаружен кальретикулин (белок, связывающий ионы кальция) (Nakamura et al., 1993).
Ряд факторов, содержащихся в семенной плазме и в жидкостях женского полового тракта, способны предотвращать чрезмерное повышение внутриклеточной концентрации кальция (Lakoski et al., 1988; Okamura et al., 1990; Boettger-Tong et al., 1993), приводящего к спонтанной акросомной реакции и к чрезмерной двигательной активности сперматозоидов (White, Aitken, 1989). Примером такого фактора может служить калтрин - белок, присутствующий в семенной плазме, который ингибирует высвобождение ионов кальция (Rufo et al., 1982; Clark et al., 1993). Гепарин, который используется для капацитации спермы быка, связываясь, вероятно, с соответствующими специфическими рецепторами на наружной мембране сперматозоидов, регулирует внутриклеточную концентрацию ионов кальция, модулируя активность потенциал-зависимых кальциевых каналов (Parrish et al., 1989; Calvete et al., 1996; Cordoba et al., 1997).
Поздние стадии капацитации бычьих и человеческих сперматозоидов сопровождаются возрастанием проницаемости наружной мембраны к ионам калия. Это приводит к гиперполяризации клетки - мембранный потенциал возрастает от -30 мВ до -60 мВ (Zeng et al., 1995). Гиперполяризация, в свою очередь, влияет на активность потенциал-зависимых ионных каналов, особенно кальциевых (Lievano et al., 1996) и связана с повышением уровня фосфорилирования ряда белков.
Состав липидов наружной мембраны влияет на ее текучесть и активность ионных каналов (Lundbaek et al., 1996). Например, количество холестерола в наружной мембране сперматозоидов быка и человека определяет уровень внутриклеточного рН (Cross, Razy-Faulkner, 1997). Очищенный от холестерола альбумин способен поглощать холестерол, содержащийся в клеточной мембране (Davis et al., 1979; Go,
16
Wolf, 1985; Langlais, Roberts, 1985). В результате изменяется текучесть (вязкость) наружной мембраны сперматозоидов и ее проницаемость к ионам Са2+ и НСО3~ (Visconti et al., 1995).
Гиперактивация и фосфорилирование некоторых белков посредством тирозинкиназы требует присутствия НСО3 - ионов в капацитирующей среде. Этот эффект может быть связан с
bsa-•--->¦ bsa-холестерол
I
2*
Са HCOi
выход холестерола |----"
дестабилизация мембраны
/
PDE
-АТР
плазматическая мембрана
-CAMP
1
РК-А
Рис. 1. Схематическое
изображение процессов,
развивающихся по мере
капацитации сперматозоидов
млекопитающих. Подробнее
см. текст.
ТКС - тирозинкиназы
сперматозоида.
По Visconti et al., 1995, с
изменениями.
1 г \ ' V
гиперактивация .».#.ТКС *.#. капацитация
возрастанием обеспеченного активностью аденилилциклазы цАМФ (Boatman, Robbins, 1991; Shi, Roldan, 1995; Visconti et al., 1995 a,b). Возрастание уровня цАМФ приводит к активации протеинкиназы, что, в свою очередь, стимулирует тирозинкиназу, которая, в конечном итоге, фосфорилирует ряд протеинов, участвующих в капацитации (см. рис. 1).
Фосфорилирование белков является необходимым этапом акросомальной реакции (рис. 2) и, возможно, также этапом активации движения сперматозоидов. Известно, что цАМФ необходим для инициации жгутикового движения (Tash, Means, 1983), так же как для изменения направления изгиба жгута (Lindemann et al., 1991).
17
Ce2+
Рис. 2. Схематическое изображение основных внутриклеточных процессов, сопровождающих капацитацию и запускающих акросомальную реакцию сперматозоидов млекопитающих (из Darszon et al., 1999).
Взаимодействие эффекторов в составе zona pellucida (ZP) яйца и (или) прогестерона (Prog) или GABA непосредственно, либо опосредовано (через Gi-белки) могут активировать транспортные системы Н+ и Na+, K+ - селективные каналы. Гиперполяризация мембраны деблокирует Са2+ каналы на наружной мембране и стимулирует выход Са2+ из акросомы, активирует аденилатциклазную систему. Возрастание уровня цАМФ и других вторичных посредников (диацилглицерол DAG, фосфатидилинщзитол Р1Рг, протеинкиназы РКА, РКС) активируют фосфолипазы, протеазы и фосфотазы.
Описанные выше, достаточно детальные исследования внутриклеточных процессов, завершающихся гиперактивацией движения и акросомальной реакцией, очевидно, не исчерпывают возможности регуляции состояния сперматозоидов. Хорошо известен поразительный факт долговременного сохранения сперматозоидов в половых путях самок (см. Максудов, Артюшкова, 1988). Иммобилизованные в половых путях самок сперматозоиды, через несколько минут после овуляции активируются и выходят из области, где они переживали (Flechon, Hunter, 1981). Очевидно, что клетки женского организма и созревшее |
