ВВЕДЕНИЕ
Аквакультура является одной из важнейших отраслей народного хозяйства, непосредственно связанной с удовлетворением населения продуктами белкового питания. Развитие аквакультуры во многих странах мира идет быстрыми темпами, производство продуктов питания начинает соперничать с добычей в естественных водоемах. До недавнего времени основным поставщиком рыбной и нерыбной пищевой продукции в аквакуль-туре был мировой океан, возможности которого казались неограниченными. Однако, в настоящее время человечество сталкивается с явлениями истощения рыбных и нерыбных морских ресурсов под влиянием антропо-
• генных факторов, многие из которых оказывают необратимое воздействие
на океан и внутренние водоемы. Поэтому разведение рыб и других водных животных, выращивание водорослей, особенно ценных в удовлетворении пищевых потребностей человека и потребностей технических производств, становится вопросом сегодняшнего дня. К концу 20-го века аквакультура заняла 4 место в мире по производству мясной продукции (после свиноводства, производства говядины и мяса птицы). Крупнейшими про-
Ф изводителями рыбной продукции стали страны Азии и, в первую очередь,
Китай (Щелкунов, 2002). В России неоправданно мал сектор производства продукции пресноводной аквакультуры, в годы перестройки пришли в упадок или были ликвидированы многие рыбхозы. Укрепление и развитие
отрасли должно быть связано с продолжением научных исследований по следующим направлениям:
1) выбор новых объектов разведения и создание технических устройств для содержания и ухода за ними;
2) создание специализированных кормов и комбикормовой промышленности для аквакультуры;
3) селекционно-генетическое улучшение объектов, создание спектра пород и гибридов, приспособленных к новым условиям обитания и интенсивной эксплуатации;
4) разработка способов и устройств для лечения и профилактитки болез-ней рыб и других водных организмов.
Культурные породы, кроссы или гибриды создаются путем длительного целенаправленного отбора в ряду поколений. Основные методы селекции - скрещивание и отбор по отдельно взятому признаку или комплексу признаков, заданных селекционной программой. В последние десятилетия селекционная работа в рыбоводстве достигла заметных успехов. В Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к ис-* пользованию (2003 г.) внесено 12 пород и типов карпа, 6 пород форели, 3
породы толстолобиков, 1 - тиляпии, 3 породы бестера, в качестве породы "одомашненная форма" представлены белый и черный амур, белуга, вес-лонос, пелядь, стерлядь, сибирский и русский осетры. В описании каждой
породы должна быть представлена генетическая характеристика этой группы рыб.
Целью настоящей работы было изучение возможностей использования продуктов белковых и ферментных локусов в качестве биохимических маркеров в селекции и разведении карповых и осетровых рыб,
В задачи исследования входило следующее:
1) выбор биохимических маркеров для проведения генетического мониторинга в племенных группах карпа и сазана (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758);
2) изучение генотипического и аллельного разнообразия различных породных групп карпа (парского, московского чешуйчатого и разбросанного, ангелинского чешуйчатого и разбросанного, селекционных групп среднерусского карпа, немецкого, тремлянского, лахвинского карпа) и амурского сазана;
3) использование данных биохимического тестирования для выявления засорения в маркированных отводках карпа и сазана;
4) анализ изменений в генетической структуре селекционных групп карпа в процессе селекции;
5) изучение влияния процесса криконсервации спермы рыб на полноту воспроизведения генетической гетерогенности групп;
6) оценка возможности использования полиморфных и видоспецифичных мономорфных белковых и ферментных систем у белого (Hypophtalmich-
thys molitrix (Valenciennes, 1844) и пестрого (Aristichthys nobilis (Richardson, 1846) толстолобиков;
7) поиск биохимических маркеров у веслоноса (Polyodon spathula (Wal-baum,1792) и описание биохимического полиморфизма его стад;
8) выявление биохимических маркеров сибирского осетра (Acipenser baerii Brandt, 1869), пригодных для генетического мониторинга племенных стад и изучение характера их наследования;
9) выявление биохимических маркеров стерляди (Asipenser ruthenus Linnaeus, 1758), пригодных для генетического мониторинга племенных стад и изучение характера их наследования.
Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции в рамках комплексных целевых программ "Пруд", "Амур" и контрактов ВНИИПРХ.
Автор приносит глубокую благодарность всему коллективу лаборатории генетики и селекции, в первую очередь, заведующему лабораторией, доктору биологических наук Юрию Ивановичу Илясову и его заместителю, доктору биологических наук Вячеславу Яковлевичу Катасонову за постоянную помощь в исследованиях. Автор глубоко признателен Лидии Александровне Шарт, Светлане Шакровне Михайловой, Юлии Павловне Бобровой, Людмиле Ивановне Цветковой, Алине Васильевне Под-дубной, Надежде Александровне Барановой, чьи поддержка и деловое сотрудничество способствовали написанию этой диссертации. Отдельная
благодарность коллективу лаборатории осетроводства и акклиматизации — Виноградову В.К., Мельченкову Е.А.,:Ситновой О.В., Бреденко М.В. за помощь в совместных исследованиях.
Автор приносит благодарность главному рыбоводу КЗТО Н.А. Ко-зовковой за проведение скрещивания стерляди и сибирского осетра и техническую помощь в ходе анализов, а сотрудникам института общей генетики (ИОГен РАН) Рябовой Г.Д., Офицерову М.В., Политову Д.В. - за сотрудничество при исследовании биохимического полиморфизма сибирского осетра и стерляди.
Глава 1. Использование биохимических маркеров в разведении и по-пуляционных исследованиях рыб.
1.1. Необходимость генетического мониторинга популяций рыб в современных условиях.
Вмешательство человека в жизнь дикой природы и в том числе такие его аспекты как искусственное воспроизводство природных популяций, доместикация (одомашнивание), разведение и селекция оказывает огромное влияние на все стороны биологии осваиваемых человеком видов. В результате возникают столь существенные отличия от диких популяций тех же видов, что некоторые авторы домашних животных классифицируют как особые формы в составе этих видов (Cautier , 1983). Поскольку селекция на доместикационный тип поведения ведет к резкой дестабилизации корреляционных систем онтогенеза и сильному возрастанию генетической изменчивости, предложено считать такой тип отбора дестабилизирующим отбором (Беляев, 1981).
Исследования, проведенные на рыбах, подтверждают формообразующее действие дестабилизирующего отбора при искусственном разведении. Так, сравнение естественных и культивируемых стад лосося в Японии показало, что внутри последних генетическая изменчивость меньше, а генетическая дифференциация отдельных стад больше, чем у природных по-
ю
пуляций (Nakajima et al., 1986). Локальные стада карпа также характеризуются значительной пространственной и временной изменчивостью генетических структур (Паавер, 1983, Сапрыкин, 1985, Гросс, 1991 и др.)
Дестабилизирующий отбор, возникающий при искусственном воспроизводстве объектов рыбоводства, может приводить к негативным явлениям. Так, отбор при воспроизводстве сахалинской горбуши наиболее крупных самцов привел к снижению адаптационных свойств популяции. Гомо-зиготность этих самцов по аллозимным генам, вызвала нарушение гомео-стаза развития. Через 7-8 поколений увеличилась средняя длина тела у рыб, но нарушилось соотношение полов, появились аномалии внешнего строения. По сравнению с природными популяциями возросли дисперсия размеров тела и уровень генного разнообразия (Алтухов и др., 1989).
К негативным результатам доместикации рыб, связанным с ослаблением стабилизирующей функции естественного отбора, следует отнести наблюдаемые во многих промышленных стадах смещения сроков полового созревания, снижение выживаемости молоди, повышение частоты встречаемости различных уродств. В таких условиях чрезвычайно важным ста-• новится контроль со стороны человека и его активное направленное воз-
действие на генофонд стада и среду обитания рыб. Путем предпочтительного воспроизводства одних генотипов при элиминации или переводе в гетерозиготное состояние других удается снизить дестабилизирующее
и
действие отбора, добиться постепенной стабилизации генетического состояния и повышения приспособленности объектов разведения.
Конечной задачей доместикации (разведения, селекции, акклиматизации и др.) является создание максимально приспособленных форм. Вид, популяция, стадо - это открытая биосистема, успешное существование которой возможно при оптимизации ее параметров, наиболее эффективном превращении поступающего потока энергии в собственную биомассу (Ле-кявичюс, 1986).
При проведения селекционной работы с рыбами, при формировании коллекционных или высокопродуктивных маточных стад исследователю необходимо четко представлять как изменяется генетическая структура объекта. Это позволит избежать нежелательных эффектов, обусловленных, например, истощением генетического разнообразия, утратой редких и ценных форм (Привезенцев, Пилиев, 1989).
Разведение человеком рыб является формой доместикации диких видов, мощным фактором воздействия на генофонд вида и должно сопровождаться постоянным контролем возникающих эффектов адаптационно-t го плана. Оценка и прогноз адаптационных возможностей вида в процес-
се доместикации и селекции являются целью комплексного эколого-генетического мониторинга (Илясов, 2001; Михайлова, 1992).
Понятие "мониторинг1 подразумевает следующую схему мероприятий:
12
- организация наблюдений за изменением "сигнальных" в отношении адаптационных возможностей характеристик объектов аквакультуры;
- оценка характера и масштаба обнаруженных отклонений;
- выявление причин смещения оптимальных характеристик биосистемы;
- прогноз основных тенденций преобразования адаптивных свойств биосистемы.
Ключевым моментом в осуществлении этой схемы является определение "сигнальных" характеристик, то есть параметров, изменение которых несет в себе информацию об уровне адаптационных процессов в биосистеме. К настоящему времени разработаны разнообразные методы, по-
* зволяющие с разной степенью приближения говорить о состоянии ряда
сторон биологии объектов аквакультуры: общем функциональном состоянии, состоянии их репродуктивной системы, стресс-реакции на неблагоприятные воздействия, уровне генетической изменчивости и степени дифференцированности природных популяций, уровне мутаций, индуцированных генотоксичной внешней средой и т.д. (Михайлова, 1992). Для изучения генетической структуры популяций и стад рыб применяют мето-
Ф ды биохимической генетики, фенетики, молекулярной генетики (исследо-
вание структуры ДНК).
13
1.2. Теоретические аспекты электрофоретического анализа полиморфизма белков.
В 1957 г. Хантер и Маркерт (Hunter, Markert, 1957), а в 1959 г. Маркерт и Меллер (Markert, Moller,1959) (цитата по Корочкину и др., 1977), сочетая методы электрофоретического разделения белков и гистохимической окраски, установили, что один и тот же фермент может быть представлен в организме множественными формами - изофермента-ми (изозимами), которые различаются по электрофоретической подвижности.
В основе белкового полиморфизма, то есть существования нескольких форм одного белка, лежат мутации генов, кодирующих полипептидные цепи. Изменения в первичной структуре белка, замена или выпадение одной из аминокислот ведут к изменениям молекулярной массы, формы молекулы и некоторых ее свойств, в частности, могут возникнуть различия в подвижности молекул в постоянном электрическом поле. На этом и основано их разделения в инертной среде-носителе (чаще всего, в крахмальном или полиакриламидном геле).
Метод электрофоретического разделения белков, как и всякий другой, имеет свои преимущества и недостатки. К преимуществам следует отнести возможность исследовать непосредственно продукты активности генов, выявлять структурные белки и ферменты, не имеющие внешних
14
проявлений, оценивать количество полиморфных и мономорфных локу-сов, а также отдельных генотипических классов, поскольку обычно наблюдается простой кодоминантный характер наследования белков. Кроме того, основные структурные белки и ферменты рано проявляются в онтогенезе (Иваненков, 1979; Нейфах, Абрамова, 1979; Тимофеев, 1979 ).
К недостаткам метода относится возможность выявлять только те варианты белков, которые различаются по заряду белковой молекулы, что составляет лишь одну треть от общего числа ( Корочкин и др., 1977 ). Усложняет анализ полученных данных существование ненаследуемых изменений в структуре белков - конформаций, а также явление псевдопо-
• лиморфизма, достаточно подробно изученное на примере растительнояд-
ных рыб (Паюсова и др., 1988а). К числу наиболее важных причин псевдополиморфизма можно отнести широту субстратной специфичности, протеолиз, возрастную и половую изменчивость. Работая на "чужом" субстрате, ферменты с широкой субстратной специфичностью вызывают развитие окраски и появление дополнительных полос. Так, в печени растительноядных рыб сильную неспецифическую активность проявляют
Ф лактатдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа. Сравнение индивидуаль-
ных спектров протеаз и эстераз печени белого амура показало, что особи с высокой активностью протеаз характеризуются изменением ферментативной активности фракций эстераз, появлением новых полос и исчезновением существующих. В целом картина напоминает истинный полимор-
15
физм (Безруков, 1987а). Наиболее сильное влияние протеолиз оказывает на качество электрофореграмм при длительном хранении проб при недостаточно низких температурах и при многократном замораживании и размораживании. У трех видов растительноядных рыб (белого и пестрого толстолобиков и белого амура) обнаружена возрастная онтогенетическая изменчивость быстрых фракций миогенов (Безруков, Берды-шев,1983). Исследование неоднородной по возрастному составу выборки без учета онтогенетического характера изменчивости может привести к ошибочному выводу о существовании генетического полиморфизма. У ку-ринского лосося показано увеличение количества фракций гемоглобинов
• в онтогенезе от одной (у сеголеток) до восьми (у половозрелых особей) (Аббасов и др., 1989). У белого толстолобика и белого амура выявлен ряд фракций, свойственных только самкам этих видов, начиная с возраста полового созревания (Безруков, 19876). Ряд фактов свидетельствует о том, что эти специфические для самок белки являются вителлогенинами и наследуются как признак, ограниченный полом. Специфический для самок сывороточный протеин, появляющийся в период вителлогенеза, описан у
# тихоокеанской речной и дальневосточной ручьевой миноги (Fukayama et al, 1986) и у канального сомика (Bradley, Grizzle, 1989).
Наличие колебаний в активности ферментов в зависимости от стадии развития (Тимофеев, Нейфах, 1982; Куринный, 1984, 1988; Hinterleitner et al.,1987; Pfeiler, Vrijenhoek,1988), сезона (Щепкин, Эмерет-
16
ли, 1986; Яковенко и др., 1989), температуры (Немова и др., 1987) и присутствия токсикантов (Турунина,1989; Nemcsok et al.,1987) также может осложнить изучение биохимического полиморфизма рыб. Для уточнения полученных данных в таких случаях применяют дополнительные методи-ки. Так, на примере дрозофилы показано существование "температурных" вариантов изозимов, имеющих одинаковую электрофоретическую подвижность, но различающихся по теплоустойчивости (Levontin,1978). Выявление таких изозимов возможно при комбинировании электрофореза с нагревом тканевых гомогенатов до температур, подавляющих ферментативную активность.
Основным методом, позволяющим судить о генетической природе найденного полиморфизма, является генетический (или гибридологический) анализ наследования признака. Проведение полного генетического анализа предполагает электрофоретическое определение генотипов родителей и их потомства, выяснение соответствия полученного соотношения той или иной гипотезе о характере наследования. Генотипы родителей желательно определять заранее, с тем, чтобы иметь возможность поста- вить наиболее информативные варианты скрещиваний. Метод генетического анализа был использован при изучении характера наследования трансферринов (Балахнин, Галаган, 1972а; Щербенок,1976; Черфас, Тру-веллер,1978;) эстераз (Трувеллер и др., 1974; Щербенок,1976; Черфас, ТрувеллерД978; Щеглова, Илясов, 1979; Паавер, 1980), миогенов (Тру-
17 |
