I. ВВЕДЕНИЕ
Современный этап развития биологии характеризуется исследованиями в ряде приоритетных научных направлений, одним из которых является изучение механизмов мембранного транспорта. Менее всего в настоящее время изучены эти механизмы применительно к специфичной для растений мембране - вакуолярной.
Наличие вакуоли является отличительной особенностью растительной клетки. Её роль в жизнедеятельности растений достаточно велика. В настоящее время показано, что это полифункциональный компартмент, который занимает особое место в структурной и функциональной организации растительного организма. Трудно переоценить роль вакуоли в регуляции клеточного объёма, тургора, а также pH и ионного гомеостаза цитозоля, что обеспечивает работу ферментов цитоплазмы, в изоляции вторичных продуктов метаболизма и метаболических ядов, в трансдукции сигналов различной природы, в процессах апоптоза, в ответных защитных реакциях растения на стрессовое воздействие и т.д. (Андреев, 2001). Одна из важнейших функций вакуоли состоит в запасании метаболитов (Курсанов, 1976).
В выполнении указанных функций ключевая роль принадлежит уникальной клеточной мембране - тонопласту. На сегодня известно, что вакуолярная мембрана содержит ряд специализированных систем пассивного и активного переноса веществ: каналы, переносчики, протонные помпы. Основной вклад в транспорт на тонопласте вносят две протонные помпы: Н^-АТФаза (ЕС 3.6.1.34) и ЕГ-пирофосфатаза (ЕС 3.6.1.1.)(Rea, Sanders, 1987). Оба фермента способны преобразовывать освобождённую при гидролизе АТФ и неорганического пирофосфата энергию в перенос протонов через тонопласт. Генерируемая разность электрохимического потенциала расходуется на вторичный транспорт ионов, Сахаров, аминокислот, который осуществляется через каналы и
переносчики. Таким образом, Н^-АТФаза и К^-пирофосфтаза являются ключевыми ферментами в системе переноса углеводов и других соединений в антипорте с протоном (Briskin et al., 1985; Саляев, Катков, 1988). В связи с этим протонные насосы тонопласта привлекают постоянное внимание исследователей и интенсивно изучаются. Однако процессы регуляции активности этих ключевых ферментов изучены слабо и представляют особый интерес с точки зрения возможности управления транспортом метаболитов.
Основным метаболитом, запасаемым в растении (в отличие от глюкозы в животной клетке), является сахароза. Процессы синтеза и транспортировки сахарозы по растению в настоящее время изучаются. Но каким бы способом ни транспортировалась сахароза (по симпласту или по апопласту), конечный этап дальнего транспорта - вакуолярная мембрана, которая содержит переносчик сахарозы и протонные помпы, обеспечивающие процесс транспорта. Путь к тонопласту идёт по донорно-акцепторным градиентам, а скорость закачивания сахарозы в вакуоль, которая зависит от активности протонных помп тонопласта, может являться в этом процессе одним из определяющих звеньев, регуляция которого будет определять процесс аттракции.
Аттракция - давно известное в физиологии растений понятие, значимость изучения которого в последнее время существенно возросла, поскольку большая часть исследователей склоняется к мнению о ведущей роли аттракции в продуктивности (Ламан, Прохоров, 1999). Процессы онтогенеза обеспечивают постоянное существование в растении аттрагирующих центров, т.е. структурных зон с большим фондом активных генов, возникающих в ходе реализации генетической программы развития. В аттрагирующих центрах происходят либо интенсивная репликация генетического материала и новообразование структур, либо интенсивный однонаправленный синтез и накопление запасных веществ. В
том и другом случаях состояние аттрагирующих центров и их метаболическая активность определяют потребность в ассимилятах, величину "запроса на фотосинтез", скорость и направление транспорта ассимилятов (Мокроносов, 1981).
Развитие корнеплодов свёклы тесно связано с процессами сахаронакопления. Конечным этапом дальнего транспорта сахарозы в период сахаронакопления является переносчик сахарозы на тонопласте в корнеплоде. Его аффинность и активность протонных помп тонопласта будут отвечать за процесс сахаронакопления. Поэтому нами была предпринята работа по изучению функциональной активности протонных помп тонопласта и процессов сахаронакопления, которые они определяют. Вначале нами были использованы подходы, которые оказались плодотворными при изучении других мембран растений, в частности плазматической, но в дальнейшем был сделан акцент на изучение гормонального влияния на протонные помпы тонопласта и процесс сахаронакопления. Прежде всего, это было сделано потому, что имеются данные, показывающие, что аттрагирующая способность акцепторов ассимилятов находится под гормональным контролем, т.е. фитогормоны обладают аттрагирующем действием и претендуют на одну из ведущих ролей в процессе аттракции (Кузьмина, 1997; Роньжина, 1999).
Гормональная регуляция активности протонных помп тонопласта и сахаронакопления была нами изучена на изолированных вакуолях на всех этапах онтогенеза, а также на целом растении в полевых экспериментах, что дало возможность сделать ряд интересных выводов. Сопоставление регуляции активности протонных помп тонопласта с регуляцией сахаронакопления позволило выдвинуть гипотезу об одном из вероятных механизмов аттракции, который состоит в стимуляции протонных помп тонопласта - конечном этапе дальнего транспорта запасаемого метаболита.
При этом все вещества и способы, содействующие увеличению активности протонных помп тонопласта, могут претендовать на роль аттрагенов.
Работа выполнена в лаборатории физиологии растительной клетки Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).
Автор выражает благодарность научному консультанту советнику РАН, члену-корреспонденту РАН Р.К.Саляеву за внимание и ценные замечания, к.б.н., с.н.с. Е.В.Прадедовой и всем сотрудникам лаборатории за помощь в работе и поддержку, а также сотрудникам группы физических методов исследования, обеспечившим проведения ряда экспериментов.
Список часто применяемых в работе сокращений: АТФ - аденозинтрифосфат ПФн - неорганический пирофосфат Н^-АТФаза - Н*- аденозинтрифосфатаза Н+-ПФаза - Н+-пирофосфатаза ЭБ - эпибрассинолид ИУК - индолил-3 -уксусная кислота ГК - гибберелловая кислота ГПВ - гиббереллиноподобные вещества АБК - абсцизовая кислота Кинетин - 6-фурфуриламинопурин ДДС - додецилсульфат натрия ПХМБ - парахлормеркурийбензоат БАП - бензиламинопурин
10
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Основная часть процессов активного транспорта сахарозы на тонопласте (более 90%) осуществляется с участием протонных помп.
2. Протонные помпы тонопласта отвечают за поступление сахарозы в вакуолях (корнеплод), а изменение их активности связано с изменением сахаронакопления.
3. Регуляция протонных помп тонопласта осуществляется разными путями: изменением редокс-условий, ионного окружения, протеолизом, фитогормонами. Почти всегда, когда активируется одна протонная помпа, вторая либо не меняет своей активности, либо ингибируется.
4. Фитогормоны способны изменять активность протонных помп тонопласта и сахаронакопления. Этот процесс существенно зависит от онтогенеза и на всех фазах развития растения обеспечен фитогормонами в необходимых соотношениях.
11 II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вакуолярная мембрана и роль вакуоли в растительной клетке
Отличительной особенностью растительной клетки является наличие в ней центральной вакуоли, которая в ряде случаев может занимать до 90% объема зрелой растительной клетки и играет особую роль в структурной и функциональной организации растительного организма (Matile, 1975). Вакуоли активно участвуют во внутриклеточном перераспределении веществ, а также выполняют функции лизосом (Саляев, 1969). Вакуоли аккумулируют большие количества запасных веществ и других метаболитов, составляющих пищевую и лекарственную ценность растений (сахара, аминокислоты, органические кислоты, витамины, белки и др.) (Курсанов, 1976). При отложении веществ в запас вакуолярная мембрана выступает в качестве конечного барьера, регулирующего процессы накопления и удержания питательных веществ в запасающих органах растений.
Механизмы формирования вакуолей при дифференциации клеток подробно рассматривались Матилем (Matile, 1975), который показал, что центральную вакуоль нужно рассматривать как скомбинированную органе ллу, образованную путём объединения и слияния мембран различных клеточных органелл. Она является конечным продуктом дифференциации эндомембранной системы растений (Matile,Wiemken, 1976). Образование центральной вакуоли стало решающем условием и основой выживания при выходе растений из воды на сушу (Walter, Stadelmann, 1968). Формирование центральной вакуоли со
специализированной мембраной - тонопластом, имеет фундаментальное значение в эволюции сосудистых растений и, видимо, является генетически закреплённым способом поддержания гомеостаза целого
12
растения. То, что центральные вакуоли имеются практически во всех растительных организмах, свидетельствует о фундаментальной значимости этих органелл, поскольку в противном случае они бы элиминировали в процессе эволюции, по крайней мере, у некоторых видов или в некоторых тканях (Wiebe, 1978). Возникновение вакуоли способствовало ускорению эволюции растений и, в свою очередь, привело к изменению функциональной нагрузки и дифференциации вакуолей и их мембран в связи со специализацией клеток в системе целого растения.
1.1. Функции вакуоли в клетках высших растений
В настоящее время убедительно доказано, что вакуоль является полифункциональным компартментом растительных клеток (Андреев, 2001). Она играет основную роль в запасании метаболитов, регуляции клеточного объёма, тургора, а также pH и ионного гомеостаза цитозоля, что обеспечивает работу ферментов цитоплазмы. Вакуоль изолирует вторичные продукты метаболизма и метаболические яды, в ней происходят процессы детоксикации и катаболической деградации целого ряда соединений эндогенного и экзогенного происхождения, переваривание «стареющих» или повреждённых органелл. В последние годы выявлена важная роль вакуоли в трансдукции сигналов различной природы, в процессах апоптоза и в ответных защитных реакциях растений на стрессовое воздействие. Это перечисление наиболее значимых функций вакуоли скорее всего не является исчерпывающим.
Трудно сказать, какая из этих функций является наиболее важной для растения. Одной из первых была сформулирована концепция о функции растительных вакуолей как о литическом компартменте, который, по аналогии с лизосомами животных клеток, переваривает «стареющие» или повреждённые органеллы (Matile, 1975). Кислые гидролазы были
13
обнаружены в вакуолях, изолированных из всех изученных растительных объектов (Leigh, Branton, 1976; Boiler, Kende, 1979 и др.). Многие клеточные белки, имеющие дефект в своей структуре, способны накапливаться внутри вакуоли и там претерпевать протеолитическую деградацию под действием вакуолярных гидролаз (Canut et al., 1986). Интенсивная деградация белков внутри вакуоли свойственна также процессу вакуолярной аутофагии растительных клеток, который происходит в условиях сахарозного или углеводного голодания, когда содержание Сахаров и крахмала в клетках, а также их метаболическая активность заметно снижаются (Journet et al., 1986). Установлено, что вакуолярная аутофагия свойственна также стареющим клеткам растений (Matile, Winkenbach, 1971). Из-за наличия внутриклеточных пулов углеводов и способности контролировать процесс аутофагии растительные клетки в условиях голодания могут некоторое время сохранять свою жизнеспособность. Литическая функция вакуолей тесно связана с апоптозом, который, как было показано в последние годы, является важным фактором развития и дифференциации многоклеточного растительного организма. В частности, он имеет место в клетках листьев как ответная, защитная реакция на действие патогена (Greenberg, 1996) или во время старения таких клеток, способствуя транслокации тех или иных компонентов к другим, более молодым, растущим растительным клеткам (Smart, 1994).
Доминирующая роль центральной вакуоли в регуляции внутриклеточного осмотического давления и клеточного тургора доказана результатами многочисленных исследований (Zimmermann, 1978). Она находится в соответствии с интенсивным накоплением внутри вакуоли неорганических ионов, а также целого ряда других соединений, в том числе органических. Осмотический баланс в клетке может достигаться благодаря аккумуляции внутри вакуолярного и цитозольного
14
компартментов осмолитов различной природы, что особенно важно в условиях осмотического стресса, когда в цитоплазме накапливаются осмолиты, способные защитить ферменты и другие биополимеры от инактивации в результате обезвоживания или сопутствующего ему окислительного стресса (Bohnert, Jencen, 1996). Осморегуляторная функция вакуоли не ограничивается участием в регуляции клеточного тургора и, по-видимому, связана с включением в регуляцию объёма или оводнённости цитозоля растительных клеток. Это предположение подтверждается обнаружением на вакуолярной мембране аквапоринов -интегральных белков, облегчающих пассивный трансмембранный перенос молекул воды (Шапигузов, 2004).
Одной из основных функций вакуоли является гомеостатическая регуляция ионного состава цитозоля растительных клеток, связанная с поддержанием оптимальных условий для активной работы ферментов цитоплазмы. Её потенциальная способность к выполнению этой важной функции в клетке обусловлена тем, что она может накапливать внутри себя значительные концентрации как основных физиологически важных ионов, таких как Н4", К+, Na+, Ca2+, Mg2+, СГ, N03", так и ионов, обладающих токсическим действием (Cd , Zn ). Недавно была убедительно продемонстрирована гомеостатическая регуляция уровня К+ в цитозоле растительных клеток за счёт его вакуолярной компартментации (Walker et al., 1996). Включение вакуоли в регуляцию уровня свободного Са2+ также является хорошо известным примером участия этой органеллы во внутриклеточном ионном гомеостазе растительных клеток. Регуляция уровня Са2+ в цитозоле с участием вакуоли включает в себя не только аккумуляцию Са2+ внутри этой органеллы, но и мобилизацию его из вакуоли в цитозоль. Экспорт Са из вакуоли выполняет также очень важную роль в трансдукции сигналов в растительной клетке (Sanders et al., 1999). В этом случае вакуоль выступает в роли донора вторичных
15
посредников, обусловливающих передачу сигналов к метаболическим системам клетки (Boudet, Ranjeva, 1989).
Одна из важных функций вакуоли состоит в изоляции вторичных продуктов метаболизма и метаболических ядов. К настоящему времени достигнут значительный прогресс в изучении обусловленных активностью вакуоли механизмов детоксикации экзогенных токсинов растительными клетками. Решающую роль в этом сыграло недавно обнаруженная способность изолированных вакуолей к Mg-АТФ-зависимой аккумуляции разнообразных глютатион-S-коньюгатов, в том числе и с гербицидами (Li et al., 1995). Экспорт из цитозоля в вакуоль соответствующих GS-коньюгатов предотвращает токсическое действие на клетку тех или иных ксенобиотиков (Ishikava et al., 1997). В настоящее время найдено, что через GS-коньюгат-транслоцирующую систему могут переноситься GS-коньюгаты антоцианина (Marrs et al., 1995), некоторые фенольные соединения с аллелопатическими свойствами, а также некоторые фитоалексины (Rea et al., 1998). В животных клетках через эту транспортную систему могут изолироваться соединения, образуемые в ходе перекисного окисления липидов клеточных мембран или окислительного повреждения ДНК под действием активных форм кислорода (Marrs, 1996). Поэтому есть основание предполагать, что эти же функции будут обнаружены и в растительных клетках.
Одной из наиболее важных функций вакуоли является запасающая. В некоторых случаях в вакуолях накапливаются значительные количества аминокислот (Wagner, 1979) и водорастворимых углеводов (Холодова, 1967), причём их содержание нередко достигает 70-80% от суммы всех аминокислот или углеводов клетки (Курсанов, 1976). Нередко в вакуолях обнаруживают значительный пул органических кислот. Так, на листьях Bryophylum показано, что всего 2% всей внутриклеточной изолимонной кислоты участвует в метаболизме, остальные 98% изолированы в вакуолях
16
(Kluge, Heining, 1973). Состав углеводов, накапливаемых в большом количестве в вакуолях, значительно различается. Если вакуоли из лепестков и листьев тюльпана содержат в основном глюкозу и фруктозу (Wagner, 1979), то корнеплоды столовой свёклы накапливают сахарозу (Саляев и др., 1982). В вакуолях накапливаются большие количества фенолов, нитратов, витаминов и других вторичных соединений (Grob, Matile, 1980; Martinoia et al., 1981 и др.), которые нередко являются антиоксидантами или относятся к лекарственным соединениям.
В выполнении всех этих функций важная роль принадлежит уникальной клеточной мембране - тонопласту, которая разделяет содержимое вакуоли и цитоплазму клетки.
1.2. Тонопласт: особенности химического состава и физиологическая роль белков
Изолированная вакуолярная мембрана обладает типичным трёхслойным строением при толщине 9,5-10 нм, присущим для пограничных мембран in suti (Саляев, Чернышов, 1975), и характеризуется достаточно сложной надмолекулярной структурой (Moore, Mollenhauer, 1976). При этом тонопласт имеет чёткую асимметрию, которая выражается в различной электронной плотности периферических слоев мембраны на поперечных срезах и в неодинаковой концентрации внутримембранных глобулярных частиц на вакуолярных и цитоплазматических сколах. Коэффициент распределения глобулярных частиц между вакуолярной и цитоплазматической сторонами составлял 725/1006 = 0.361 (Саляев и др., 1983а). Известно, что высокая насыщенность глобулярными частицами (до 1000 - 3500 частиц на 1мкм2) характерна для мембран, проявляющих особенно высокую функциональную активность (Branton, Deamer, 1972). Внутримембранные глобулы, как правило, представляют собой глобулы
17
трансмембранных (интегральных) белков (Shotton, 1978), которые могут являться ферментами, ионными каналами и переносчиками. Суммарная площадь, занятая частицами на продольных сколах, составляла около 23,5% от общей площади поверхности тонопласта, а объём, занимаемый глобулярными частицами, составлял около 22% от объёма мембраны (Саляев и др., 1983а). Это удовлетворительно коррелирует с результатами прямых биохимических анализов тонопласта, согласно которым во фракции вакуолярных мембран, тщательно очищенных от периферических белков, около 20% приходится на долю интегральных белков, извлекаемых из мембран только с помощью детергентов (Саляев и др., 1982). Белок / липидное соотношение в тонопласте столовой свёклы составляло 0,69. 6-8% белков тонопласта были отнесены к периферическим, остальные 92% -к интегральным, пронизывающим мембранный матрикс. При электрофоретическом разделении в ПААГ с ДС в спектре белков тонопласта выявлялось около 20 полипетидов, большинство из которых имели молекулярные массы менее 70 кД. Спектр белков тонопласта, солюбилизированных Тритоном Х-100, состоял из 15 белковых полос, 8 из которых были гликопротеинами (Salyaev, 1984). Такие биохимические характеристики, как белок/липидное соотношение, количественный и качественный спектр белков изменялись при использовании других объектов для получения вакуолярных мембран. Так, например, во фракции тонопласта, выделенной из корнеплодов столовой свёклы (Саляев и др., 1982) и из лепестков амариллиса (Wagner, 1981) обнаружены лишь следы углеводов, тогда как в тонопласте, выделенном из дрожжей, на 100 мг белка приходилось 79 мг углеводов (Kramer, 1978). Но все исследователи, независимо от объекта исследования, отмечают высокую текучесть и эластичность вакуолярной мембраны, которая обусловлена большим содержанием липидов, составляющих до 80% от её общего веса. В химическом составе липидов тонопласта преобладают полярные липиды - |
