5 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Многообразие факторов окружающей среды воздействующих на сельскохозяйственных птиц определяет широкий диапазон морфофункциональных изменений в их организме. Специфическое воздействие на органы, ткани, клетки и субклеточные структуры, наряду с разнообразными биотическими факторами оказывают и лекарственные препараты, большинство из которых для организма являются чужеродными, то есть ксенобиотиками, способными нарушать морфофункциональный гомеостаз.
В физиологических условиях постоянство гомеостаза поддерживается системами детоксикации и экскреции: почками и печенью, а жизненно важные функции реализуются по определенным схемам биохимических взаимоотношений под контролем центральной нервной системы. При попадании в организм лекарственных ксенобиотиков, когда органы гомеостатического обеспечения не справляются с детоксикацией и элиминацией лекарств, развиваются цитотоксические явления и органопатии [261, 23, 247, 249, 10]; кроме того, существует вероятность загрязнения продовольственного сырья и пищевых продуктов лекарственными контаминантами [114, 214, 331, 296, 297]. Поэтому так важна структурно-функциональная оценка общетоксического и специфического воздействия лекарственных препаратов на органы и ткани, отвечающие за адаптационно-приспособительные реакции, обеспечивающие гомеостаз.
Ведущим звеном в механизме стабилизации гомеостаза у птиц (из-за отсутствия потовых желез) являются почки. Однако морфофункциональные особенности и динамика становления почек кур в постнатальном онтогенезе изучены недостаточно, нет единого представления о сроках их морфологического созревания [283, 171, 289]. Кроме того, отсутствуют сравнительные данные о морфофункциональном развитии органов гомеостатического обеспечения у кур различных кроссов.
б
Широкое применение лекарственных средств в промышленном птицеводстве требует знания механизмов выведения их из организма птицы. Известно, что главными путями освобождения организма от чужеродных веществ является печеночный метаболизм и почечная экскреция, последняя включает в себя фильтрацию в сосудистых клубочках и канальцевый транспорт. Исследования Варшавского, Берхина, Наточина, Вейнара [63, 41, 190, 452] позволили составить общее представление о механизме канальцевого транспорта в почках. Однако до настоящего времени остается недостаточно освещенным вопрос о морфологическом субстрате и цитохимической природе этого процесса, а имеющиеся данные носят противоречивый и фрагментарный характер.
Весьма анальным является поиск методов, способных осуществлять общую детоксикацию организма птиц при лекарственных воздействиях с тем, чтобы с одной стороны нормализовать гомеостатические функции, а с другой — организовать разрыв порочной цепи перехода и кумуляции лекарственных контаминантов в системе "птица - продукция птицеводства - человек". Одним из доступных в ветеринарной практике способов освобождения внутренней среды организма от ксенобиотиков, является энтеросорбция [155, 234, 250, 218], однако нам не известны сведения о влиянии энтеросорбции на показатели морфофункционального гомеостаза кур и уровень лекарственных контаминантов в птицеводческой продукции при лекарственных воздействиях.
Таким образом, изучение становления органов гомеостатического обеспечения у кур в постнатальном онтогенезе, исследование морфофункционального гомеостаза при воздействии лекарственных ксенобиотиков, изучение механизма их элиминации, а также разработка способа коррекции цитотоксического действия и снижения уровня лекарственных контаминантов в птицеводческой продукции представляется весьма актуальным.
7
Цель и задачи исследований. Основная цель представленной работы заключалась в изучении становления органов гомеостатического обеспечения и параметров морфофункционального гомеостаза у кур в постнатальном онтогенезе и при воздействии лекарственных ксенобиотиков, исследовании цитофункциональной природы транспорта лекарств в почках и обосновании способа получения экологически чистой птицеводческой продукции.
Были поставлены следующие задачи:
L Изучить общие закономерности и последовательные этапы развития почек у кур в постнатальном периоде онтогенеза на основе морфометрического, цитохимического и ультраструктурного анализа; а так же установить последовательность цитодифференцировки нефронов с учетом их гетерогенности;
2. Выявить ультраструктурные механизмы и цитохимическую природу трансцеллюлярного транспорта лекарственных ксенобиотиков в нефроцитах половозрелых кур;
3. Провести сравнительный анализ развития органов гомеостатического обеспечения, с учетом возрастной динамики морфобиохимических показателей крови у кур различных кроссов;
4. Установить основные изменения параметров морфофункционального гомеостаза у кур в условиях экспериментального лекарственного воздействия и исследовать уровень остаточных количеств лекарственных контаминантов в пищевых продуктах птицеводства: мясе, субпродуктах и яйцах птиц;
5^ Изучить влияние энтеросорбента (полифепана) на показатели морфофункционального гомеостаза кур и уровень лекарственных контаминантов в птицеводческой продукции в условиях экспериментального лекарственного воздействия.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное морфофункциональное исследование органов гомеостатического обеспечения у кур в возрастном аспекте и при воздействии лекарственных ксенобиотиков.
Получены новые данные о морфологическом субстрате и цитохимической ^ природе канальцевого транспорта лекарственных веществ в нефроцитах кур.
Уточнены сроки морфофункционального созревания органов, обеспечивающих гомеостаз (почек, печени, головного мозга) у кур различных кроссов. Установлено, что чрезмерное лекарственное воздействие в период морфологической и функциональной незрелости органов гомеостатического обеспечения у кур, приводит к каскаду цитотоксических проявлений, развитию органопатий и контаминации птицеводческой продукции лекарственными препаратами. Впервые предложен способ снижения цитотоксического действия и уровня лекарственных контаминантов в продукции птицеводства при применении энтеросорбента - полифепана (Заявка на изобретение №200312721/13, приоритет от 14.07.03).
Практическая значимость. Материалы дисссертационной работы легли в основу методических рекомендаций: «Методы оценки морфофункционального статуса сельскохозяйственной птицы при воздействии лекарственных ксенобиотиков» (Красноярск, 2004), одобренных и принятых к внедрению НТС КрасГАУ (протокол № 5 от 23 декабря 2003), НТС при Министерстве сельского хозяйства республики Хакасия (протокол № 1 от 15 января 2004), на заседании отделения ветеринарной медицины ГНУ ИЭВСиДВ * СО РАСХН (протокол № 16 от 17 июня 2004), и используются для оценки
морфофункционального статуса сельскохозяйственных птиц при воздействии биотических факторов, в частности лекарственных ксенобиотиков, на птицефабриках Красноярского края («Березовская», ОАО племзавода «Таежный») и республики Хакасия (2002-2004), а так же в работе ГУ Красноярской краевой ветеринарной лаборатории (2002, 2003), ГУ Управления ветеринарии ЕМО г. Норильска Красноярского края и ГНУ НИИ сельского хозяйства Крайнего Севера.
Основные материалы работы используются в учебном процессе на 20 ' кафедрах аграрных ВУЗов России: Казанской и Санкт-Петербургской
9
государственных академий; Мордовского и Хакасского государственных f<4 университетов; Алтайского, Дальневосточного, Красноярского,
Новосибирского, Омского, Ставропольского государственных аграрных университетов; Бурятской, Вятской, Дагестанской, Кабардино-Балкарской, Приморской, Самарской, Ярославской государственных сельскохозяйственных академиях, Красноярском институте переподготовки кадров.
Основные итоги исследований отражены в монографии «Цитофункциональная эндоэкология сельскохозяйственных птиц при воздействии лекарственных ксенобиотиков» (Красноярск, 2004); практикумах: по морфологии «Общая гистология» (Красноярск, 2001) и по цитологии,
гистологии и эмбриологии «Частная гистология» (Красноярск, 1999, 2002).
fr
Основные положения, выносимые на защиту:
- основные этапы развития почек и закономерности цитодифференцировки нефронов с учетом их гетерогенности у кур в постнатальном онтогенезе;
ультраструктурная и цитохимическая характеристика трансцеллюлярного транспорта лекарственных ксенобиотиков в нефроцитах половозрелых кур;
- особенности развития органов гомеостатического обеспечения (почек, * печени и головного мозга) и возрастная динамика морфобиохимических
показателей крови у кур различных кроссов в условиях птицефабрик;
- параметры морфофункционального гомеостаза и уровень лекарственных контаминантов в организме кур при экспериментальном лекарственном воздействии;
- энтеросорбция полифепаном на фоне экспериментального лекарственного воздействия нормализует параметры морфофункционального гомеостаза кур и снижает уровень лекарственных контаминантов в мясе, субпродуктах и яйцах птиц.
10
Апробация работы. Основные материалы исследований доложены, ?;* обсуждены и одобрены на: научно-практических конференциях
Ленинградского ветеринарного института (Ленинград, 1984-1987) и Красноярского государственного аграрного университета (Красноярск, 1988-2003), Всесоюзном симпозиуме «Клеточные механизмы адаптации» (Крым, Карадаг, 1985), XXIV конференции студентов и аспирантов морфологических кафедр и лабораторий Ленинградских ВУЗов и научно-исследовательских институтов, (Ленинград, 1985); заседании Ленинградского отделения Всесоюзного общества АГЭ (Ленинград, 1987); Всесоюзном совещании «Теории параллелизма A.A. Заварзина и современная биология» (Ленинград, 1986); II Всероссийском съезде АГЭ (Ленинград, 1988); III зональной научно-производственной конференции «Пути повышения эффективности сельскохозяйственного производства Восточной Сибири» (Красноярск, 1989); Всероссийской научно-производственной конференции «Гигиена, ветсанитария и экология животноводства» (Чебоксары, 1994); научно-практической конференции «Достижения науки и техники - развитию г. Красноярска» (Красноярск, 1997); IX Международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза» (Красноярск, 1998); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Достижения науки и техники -*¦ развитию сибирских регионов) (Красноярск, 1999, 2001, 2003); X
Международном симпозиуме «Гомеостаз организма: медико-биологические аспекты» (Красноярск, 2000); межрегиональной конференции морфологов «Теоретические и практические аспекты ветеринарии и медицины» (Улан-Удэ, 2001); заседании Красноярского отделения Всероссийского общества физиологов им. И.П. Павлова (Красноярск, 2001); региональной научной конференции «Красноярский край — освоение, развитие, перспективы» (Красноярск, 2003); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биологии» (Оренбург, 2003); * Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука на рубеже
11
веков» (Красноярск, 2003); XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и tp экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003); Международной
научно-практической конференции «Актуальные аспекты экологической, сравнительно-видовой, возрастной и экспериментальной морфологии» (Улан-Удэ, 2004).
Публикации. Основные научные положения, выводы и разработки диссертации изложены в 39 работах, в том числе в монографии «Цитофункциональная эндоэкология сельскохозяйственных птиц при воздействии лекарственных ксенобиотиков», двух практикумах, методических рекомендациях и научных изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 332 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Список литературы включает 457 наименований, из них 165 зарубежных источника. Материалы диссертации иллюстрированы 35 таблицами, 80 микрофотографиями, 36 диаграммами и схемой.
12
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПО ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ И ВОЗРАСТНОЙ МОРФОЛОГИИ ПОЧЕК В ОНТО- И ФИЛОГЕНЕЗЕ
Почки являются одним из наиболее полифункциональных органов, вся деятельность которых направлена на стабилизацию состава внутренней среды организма, гомеостаз [190]. Почки участвуют в осмо-, волюмо- и ионной регуляции, в поддержании кислотно-щелочного равновесия; они осуществляют экскреторную функцию и служат важным инкреторным органом [20, 107, 282, 192, 193]. Все большее значение приобретает изучение их метаболической функции [229]. Все эти разнообразные функции обеспечиваются несколькими процессами, протекающих в паренхиме органа — ультрафильтрацией в клубочках, реабсорбцией, тубулярной экскрецией и синтезом новых соединений [188-192].
Анализ данных литературы по морфологии почки показал, что строение почки наиболее полно изучено у млекопитающих и гораздо в меньшей степени у птиц [149, 184, 86, 373, 453], рептилий [81, 82, 86], амфибий [209] и рыб [84, 85, 135, 339].
Краткое описание топографии и строения почек птиц имеется в ряде анатомогистологических и физиологических пособий и руководств [260, 168, 77,238,223,236,372].
Согласно данным вышеупомянутых авторов, почки птиц представляют собой парные, относительно крупные органы, форма почек серповидная, с двумя-тремя вырезками снаружи. С поверхности почки заключены в оболочку, состоящую из волокнистой соединительной ткани. С вентральной стороны, кроме того, почки покрыты брюшиной, жира вокруг почек нет. С. Radu [425] описал возможные вариации морфологии и архитектуры почек домашних птиц.
По многочисленным наблюдениям [149, 170], относительная величина почек у птиц значительно превышает таковую у рептилий [174] и даже у млекопитающих [333], что, как считает Л.Н. Добринский [108], обусловлено
13
более интенсивным обменом веществ и отсутствием потовых желез у птиц. У взрослой курицы относительная масса почки составляет 1-2 % [260, ]; у скворца она составляет 1,2 %, у крачек - 1,6 %, у крохаля 2,6 % [196]; у галки - 1,25 %, у вороны - 0,9 %, у сороки - 0,9 % [76].
По данным ряда авторов [149, 226], каждая из почек у птиц подразделяется на три, связанных друг с другом, доли, состоящие в свою очередь из мелких долек, в которых можно выделить корковое и мозговое вещество. Наличие хотя и слаборазвитого мозгового вещества, вещества, принципиально отличает почки птиц от представителей низших классов позвоночных животных, в почках которых мозгового вещества нет [287]. Лишь птицы, а особенно млекопитающие, обладающие очень развитым мозговым веществом [217, 424, 384], приобрели и новое свойство - они могут экскретировать мочу, имеющую осмотическое давление большее, чем кровь [97, 270, 192, 446, 372, 441].
В.И. Беркович и Е.П. Ильина [38] отмечают в почках кур отсутствие выраженной границы между корковым и мозговым веществом. Корковое вещество почки сформировано в дольки, которые имеют коническую форму, широкое основание их обращено к поверхности почки, а узкий конец к мозговому веществу. Центр корковой дольки пронизывают внутридольковая вена, относящаяся к ренопортальной системе, и концевые ветви почечных артерий [295, 417, 453]. Ренопортальная кровеносная система имеется в почках морских рыб, амфибий, рептилий и птиц. Её нет в почках круглоротых, пресноводных рыб и млекопитающих.
Число нефронов в почках представителей различных классов животных неодинаково. Так, U. Bargmann [305] сообщает, что в каждой из почек человека содержится 1,2-1,3 млн нефронов, по данным Н. Smith [442], в обеих почках собаки содержится до 816 тыс. нефронов, а у крысы — до 62 тыс. нефронов, причем, в правой почке у них нефронов больше, чем в левой [423]. По данным Е. Marshall [397] общее количество нефронов у кур составляет 800 тыс., у уток - 2 млн, у гусей - 1,7 млн.
14
Диаметр почечных телец у кур составляет по данным Т.Р. Рузиева [226] 50-80 мкм, а по данным Ю.Т. Техвера [260] - 60-110 мкм; у индеек размеры почечных телец составляют 60-80 мкм [184]. Ю.Ф. Обмолова [203] показала, что площадь сечения почечного тельца в почках голубя составляет 255,5 мм . Изучая размеры почечных телец в филогенезе, Э.С. Валишин [61] установил, что наибольшие размеры гломерул выявляются у лягушки (до 200 мкм), а наименьшие у голубей (до 80 мкм). O.A. Каплунова [128], подтверждая данные предыдущего автора, вместе с тем указывает, что кровоснабжение почечных канальцев у рептилий и птиц улучшено, по сравнению с рыбами и амфибиями. Кроме того, как считает Э.С.Валишин [61, 62], если посмотреть на соотношение диаметров приносящих и выносящих артериол у различных животных, то окажется, что у лягушки этот показатель будет наименьшим, а у голубя наибольшим, вследствие чего у голубя создаются большие благоприятные условия для повышенного гидростатического давления крови в капиллярах клубочка, а отсюда, по-видимому, и фильтрации. Вместе с тем, фильтрационная способность почек птиц все еще уступает таковой у млекопитающих, что Т.Р. Рузиев [226] связывает с относительно малыми размерами клубочков, наличием развитой соединительной ткани и незначительным количеством капилляров'в почках кур.
В научной литературе нет единого мнения по вопросу классификации нефронов у птиц. Так, R.F. Wideman et al. [453] в почке курицы различают кортикальные, медуллярные и интрамедуллярные типы нефронов. Кортикальный нефрон по анатомической структуре подобен нефрону амфибий, а медуллярный по структуре напоминает суперфициальный нефрон млекопитающих. В.И. Беркович и Е.П. Ильина [38] выделяют в почках кур кортикальные и юкстамедуллярные нефроны, причем последние составляют 50 % от общего числа нефронов. Большинство же авторов [260, 191, 97] придерживаются мнения, что нефроны в почках птиц подразделяются на корковые и мозговые.
15
Sh. Kurihara [386] показал, что мозговые нефроны почек у кур имеют те же подразделения, что и у нефронов млекопитающих: их почечные тельца расположены в центральных частях долек, а петля нефрона, как правило, опускается в мозговое вещество. Корковые же нефроны за пределы коркового вещества не выходят, вместо петли нефрона у них есть короткая вставочная часть, соединяющая проксимальные и дистальные извитые канальцы, чем они напоминают нефроны рептилий [453]. В связи с этим, в литературе часто встречается описание корковых нефронов птиц как рептилиоподобных, а мозговых как млекопитающеподобных [313, 328, 413] Соответственно этому в функции почек птиц тоже отражен их переходной характер [282, 312].
Согласно исследованиям А.Г. Гинецинского [91] и Ю.В. Наточина [192], водовыделительная функция почки, начиная с класса амфибий, включает в себя не только фильтрацию и проксимальную реабсорбцию, как это имело в классе рыб, но и дистальную реабсорбцию. Одним из важнейших достижений эволюции почки явилось формирование у птиц и млекопитающих осмотического концентрирования мочи, связанного с делением почки на корковое и мозговое вещество [227, 328]. Согласно Ю.В. Наточину [191], эволюция функции почки обусловлена изменением интенсивности работы ее клеток, реорганизацией нефронов и изменением длины отдельных канальцев.
Данные литературы [74, 194, 189, 190, 239, 118, 327, 312, 374] свидетельствуют, что существующая специализация функций различных отделов нефронов почек объясняется их структурными, цитохимическими и ультраструктурными особенностями.
Из анатомических руководств [77] известно, что капсула сосудистого клубочка у птиц образована плоскими эпителиальными клетками. Клетки висцерального листка капсулы отросчатые, примыкают к эпителию капилляров; эти клетки (подоциты) состоят из крупного клеточного тела с ядром, митохондриями, пластинчатым комплексом, эндоплазматическим ретикулумом, фибриллярными структурами.
16
Форма подоцитов у различных позвоночных — папаротникообразная, и лишь у амфибий подоциты неправильной формы [366]. Подоциты связаны между собой пучковыми фибриллярными структурами, образующимися из плазмалеммы. Фибриллярные структуры отчетливо выражены между малыми отростками подоцитов, где они образуют щелевую диафрагму, которой отводится большая роль в гломерулярной фильтрации [239]. Париетальный листок капсулы почечного тельца у различных представителей млекопитающих и птиц представлен однослойным плоским эпителием, со светлой цитоплазмой [294]. Однако Pak Roy и J. Robertson [419] указывают на рудиментарный характер почечных клубочков у птиц, отмечая, что центральная масса клеток индифферентной соединительной ткани обособлена и морфологически отличается от функционирующей фильтрующей поверхности. J. Christensen et al. [319] отмечают, что в почках птиц хорошо развит юкстагломеруллярный комплекс.
Париетальный листок капсулы почечного тельца переходит в шеечный сегмент, по-разному выраженный у представителей различных классов позвоночных животных. В почке пресноводных и морских рыб, амфибий и рептилий шеечный сегмент образован реснитчатым эпителием, со скудным количеством мелких зернистых митохондрий [70, 209, 83, 85]. В почке птиц, по данным В.Г. Петровой [208], шеечный сегмент представлен всего тремя плоскими клетками, и лишь нефрон сорок характеризуется хорошо развитым шеечным сегментом, но его эпителий не имеет ресничек. Большинство же авторов [260, 203,38, 386] склонны считать, что в почках птиц непосредственно за капсулой сосудистого клубочка сразу следует проксимальный отдел нефрона.
Характерной особенностью проксимального отдела нефрона у различных представителей позвоночных является наличие эпителия, снабженного микроворсинками с хорошо развитым цитоскелетом [209, 85, 118, 435]. Кроме того, в эпителии проксимального отдела нефрона базальная мембрана
17
формирует глубокие складки, образуя, так называемую, базальную исчерченность, многократно описанную у различных видов млекопитающих [356, 387, 391]. Согласно данным Л.Н. Винниченко [70] и Sh. Kurihara [386] в почках амфибий, рептилий и птиц базальная исчерченность, либо полностью отсутствует, либо выражена очень слабо. По В.Г. Петровой [208] эпителий проксимального нефрона у птиц представлен крупными кубическими клетками, цитоплазма которых заполнена митохондриями разнообразной формы.
В эпителии проксимальных канальцев почек птиц Sh. Kurihara [386] описал темные и светлые клетки, различия между которыми обусловлены разным содержанием митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети и свободных рибосом. Автор отмечает, что в этом отделе нефрона у птиц щеточная кайма развита хорошо, а инвагинации базальной плазматической мембраны — слабо. У некоторых клеток базальные отделы цитоплазмы формируют пальцевидные отростки с коротким пространством между ними и базальной мембраной канальца.
Помимо морфологической полярности клеток проксимального отдела нефрона существует выраженная полярность в отношении распределения мембраносвязанных ферментов [202]. Согласно данным R. Kinne [380] и А. Kenny, A. Booth [379] в плазматической мембране люминальной и контрлюминальной сторон клеток проксимального канальца состав ферментов совершенно различен. Мембрана щеточной каймы содержит гидролазы, действующие на ферменты сложных эфиров (щелочная фосфатаза, 5-нуклеотидаза, Mg-АТФаза и НСО-АТФаза), на пептиды (аминопептидазы и у-глутамилтранспептидазы) и на дисахариды (трегалаза и мальтаза). Базолатеральная плазматическая мембрана содержит Na-K-АТФазу, Са-АТФ-азу и ПТГ-чувствительную аденилатциклазу.
За проксимальным канальцем во всех нефронах млекопитающих и в мозговых нефронах птиц следует петля нефрона, состоящая из тонкого и толстого колена [1, 383, 384, 316], а в корковых нефронах птиц и во всех |
