СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
• ГА — гексозамины
• ГАГ - гликозаминогликаны
• ГК — губчатая кость
• ГМ-ФСК - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
• Ж — женщины
• ИЛ - интелейкин
• ИПФР -инсулинподобный фактор роста
• КК — компактная кость
• КТ - калыдитонин
• КФ - кислая фосфатаза
• М — мужчины
• НК — нуклеиновые кислоты
• НКБ — неколлагеновые белки
• ПТГ - паратиреоидный гормон
• СК — сиаловые кислоты
• СМЭ - судебная медицинская экспертиза
• СТГ - соматотропный гормон
• ТФР-? трансформирующий фактор роста ?
• УК — уроновые кислоты
• ФНО - фактор некротизирующий опухоль
• Щф - щелочная фосфатаза
• ЭДТА - этилендиаминтретраацетат натрия
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В настоящее время в экономически развитых странах Европы и Америки, а в последние годы и России, наблюдается выраженное старение населения [59]. Эти демографические сдвиги представляют собой социально обусловленный процесс. Старение населения планеты делает актуальными ряд проблем социально-экономического и медико-санитарного характера. Сегодня исследователи уже говорят не о простом увеличении количества лет прожитой жизни человека, а о продлении его творческого долголетия [46; 47].
Старение костной ткани проявляется, прежде всего, интенсификацией и рассогласованием процессов костеобразования и резорбции, в результате чего развивается разрежение костной ткани — остеопороз [44]. Сенильный (возрастной) остеопороз определяется у подавляющего большинства людей старше 45—50 лет и является почти универсальным признаком старения организма человека. По данным ВОЗ, остеопоротические изменения выявляются у 15—50 % всего населения России старше 55 лет, при этом у 30% рарефикация кости настолько выражена, что может привести к переломам [79; 82; 103; 154].
Несмотря на огромное количество исследований по данной проблеме, невыясненными остаются вопросы об изменениях в химическом составе межклеточного матрикса кости, возникающих с возрастом, и схожести этих изменений с дегенеративными при различной патологии. С каждым годом увеличивается число остеопоротических переломов, лечение их весьма трудоемко и долговременно. Доля переломов у трудоспособного населения также увеличивается [10; 58]. Однако недостаточное знание механизмов этого заболевания не позволяет эффективно бороться с ним [79; 82]. Многие исследователи находят в основе патогенеза остеопороза потерю минеральной фазы кости [83], некоторые обнаруживают потерю костной ткани в целом [87; 108], и
4
практически полностью отсутствуют данные о состоянии биополимеров костной ткани и органического матрикса.
Кроме этого, исследования костной патологии, проводимые непосредственно на биопсийном и аутопсийном материале, невозможны без сравнения со здоровой костной тканью, состав и строение которой изменяется в течение жизни. В связи с этим изучение возрастных особенностей строения кости становится актуальным и для понимания патологических процессов, протекающих в кости.
С развитием техники и урбанизацией населения России и других стран в последние десятилетия участились случаи массовых катастроф, ведущих к появлению неопознаваемых фрагментов тел их жертв. В связи с этим в бюро судебной медицинской экспертизы (СМЭ) все чаще возникает вопрос об определении пола и возраста трупа по его останкам [112]. На сегодняшний день нет общепринятой системы оценки возраста человека по остеологическим данным, за исключением методов с применением атомно-абсорбционной спектрометрии, которые недоступны подавляющему большинству бюро СМЭ.
Отсутствие достоверных данных о составе и строении костной ткани людей различного возраста определили направление предпринятых нами исследований. Их необходимость связана также с тем, что остаются неизученными различия в составе костной ткани мужчин и женщин. Кроме того, изучение минерального состава, характеристики состояния биополимеров и ферментных систем костной ткани человека позволят более точно определять возраст индивидуума в судебно-криминалистических целях.
Цель исследования. На основе биохимических показателей охарактеризовать возрастные изменения и половые отличия химического состава компактной и губчатой костной ткани человека.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать возрастные изменения химического состава компактного и губчатого вещества бедренной кости человека.
2. Изучить возрастное изменение количества минеральных веществ и отношения органической компоненты к неорганической в бедренной кости человека.
3. Оценить различия в составе компактной и губчатой костной ткани бедренной кости мужчин и женщин в возрастные периоды 21-35, 36-60, 61-74 и более 74 лет.
4. Исследовать различие содержания уроновых кислот(УК), сиаловых кислот (СК), гексозаминов (ГА), нуклеиновых кислот (НК), коллагена, кальция, фосфатов, магния в компактной костной ткани (КК) бедренной кости и губчатой кости (ГК) головки бедра человека биохимическими методами.
5. Исследовать ферментативную активность белков, выделенных из компактной костной ткани человека в различные возрастные периоды.
Положения, выносимые на защиту.
1 Биохимический состав и строение костной ткани человека зависят от пола и возраста. С возрастом наиболее изменяются содержание анионов (SO42", PO43") минеральной фазы костной ткани. Наибольшие половые различия наблюдаются во втором зрелом возрасте в составе и строении губчатой костной ткани, выражающиеся в достоверном изменении содержании уроновых кислот, увеличении сульфатов и превышающем, более чем в 5 раз содержании ДНК у женщин.
2 Активность биосинтетических процессов, протекающих в губчатой костной ткани человека, выше, чем в компактной кости, что выражается в большем содержании в губчатой кости количества нуклеиновых кислот и невысоком содержании коллагена.
Объекты исследования. Работа выполнена на базе лаборатории биохимии Государственного учреждения Российского научного центра
«Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова. Объектами исследований явились трупы людей, умерших от травм и других причин, не связанных с костной патологией, в г. Кургане (50 трупов). Материалом исследования служили: компактная и губчатая костная ткань, выделенная из бедренной кости человека в результате танаталогического вскрытия в бюро СМЭ г. Кургана. В ходе выполнения данной работы использовались биохимические методы, методы математической обработки результатов исследований.
Научная новизна исследования. Впервые комплексно изучены изменения содержания ионов Са2+, РО43", Mg2"1", SO42", коллагена, нуклеиновых, сиаловых, уроновых кислот, гексозаминов, компактной и губчатой костной ткани человека в возрастном аспекте. Впервые в возрастном аспекте изучены активность щелочной и кислой фосфатаз в нормальной компактной костной ткани человека. Впервые показано различие в интенсивности биосинтетических процессов, протекающих в компактной и губчатой ткани человека, отражающееся на биохимическом составе кости. Впервые изучены различия в обменных процессах протекающих в костной ткани у мужчин и женщин в зрелом, пожилом и старческом возрасте.
Практическое значение, область внедрения. В комплексе оценены изменения в химическом составе костной ткани человека в течение жизни, что позволит внести ясность в исследование патогенеза сенильного остеопороза. По результатам работы в лабораторию биохимии Центра внедрены методы исследования, характеризующие состояние биополимеров костной ткани и методы получения биологически активных веществ. Показано, что результаты работы могут быть использованы при определении паспортного возраста в условиях бюро СМЭ. По теме диссертации оформлено два изобретения: «Способ выделения гликозаминогликанов из минерализованной соединительной ткани и косметическое средство по уходу за кожей на основе выделенных
гликозаминогликанов» (приоритетная справка на изобретение № 2003131580 033777 от 27.10.2003) и «Способ выделения коллагена из минерализованной соединительной ткани и косметическое средство на его основе» (приоритетная справка на изобретение № 2003134131 036658 от 24.11.2003).
Материалы диссертации включены в планы выполнения курсовых и дипломных работ студентов Курганского государственного университета.
Материалы работы доложены на первом Всероссийском симпозиуме «Возрастные изменения минеральной плотности костей скелета и проблем профилактики переломов», Курган, 2002; работа стала лауреатом республиканской итоговой научно-практической конференции молодых ученых и студентов республики Башкортостан с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины», Уфа, 2004; IX Российском конгрессе «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2004.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в республиканских и областных изданиях.
Объем и структура работы: диссертация состоит из введения, представлений о структуре и химическом составе соединительной ткани, материалов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 191 работу (из них 113 отечественных, 78 зарубежных); изложена на 111 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 12 таблицами. Диссертационная работа выполнена по плану НИР РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова № 0.34/1-15 (номер государственной регистрации 01.2.00 109073).
8
ГЛАВА 1. ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ И ХИМИЧЕСКОМ СОСТАВЕ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Соединительная ткань составляет примерно 50 % от массы тела [7]. Несмотря на большое разнообразие соединительнотканных образований и их морфологические различия, построены они по общим, единым принципам:
1) соединительная ткань, как и всякая другая, содержит клетки, однако межклеточное вещество занимает больший объем, чем клеточные элементы;
2) для соединительной ткани характерно наличие фибриллярных структур - коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон в окружении межуточной субстанции;
3) межклеточное вещество имеет сложный химический состав [7]. Наиболее интересным соединительнотканным объектом для
исследований в последнее время становится костная ткань. Наименее изученными остаются вопросы онтогенетического развития костной системы. Проблема старения является одной из социально значимых в нашей стране и за рубежом. Понимание закономерностей развития и старения костной ткани даст возможность понизить травматизм людей в репродуктивном возрасте и снизить количество переломов в пожилом и старческом возрасте.
1.1. Клетки костной ткани
В костной ткани различают несколько основных типов клеток -это остеобласты, остеоциты, остеокласты, моноциты, макрофаги и некоторые другие [172; 181]. Остеобласты - клетки костной ткани, продуцирующие компоненты костного матрикса, имеющие характерные морфологические признаки, выявляющиеся на электроно-микроскопическом уровне [57]. Известно, что остеобласты обладают развитым эндоплазматическим ретикулумом, комплексом Гольджи и
9
множеством секреторных гранул, содержащих проколлаген [16]. Ядро в клетке расположено эксцентрично, цитоплазма резко базофильна. Зрелые остеобласты не способны к делению. Считают, что основная функция остеобластов заключается в синтезе всех продуктов матрикса, однако их роль в период созревания остеоида остается не выясненной [79]. Исследованию регуляции активности остеобластов посвящено много исследований [111; 173]. Отмечено, что регуляция активности остеобластов имеет многоступенчатый характер. В этот процесс вовлечены как системные факторы регуляции - гормоны, прежде всего паратиреоидный гормон (ПТГ) и соматотропный гормон (СТГ) [20; 96], так и локальные факторы роста - инсулинподобный фактор роста (ИПФР), трансформирующий фактор роста ? (ТФР-?) и др. Кроме этого, на активность костных клеток влияют механические нагрузки [39].
Остеоциты - зрелые неделящиеся клетки, расположенные в костных полостях или лакунах [79; 16]. Остеоциты образуются из остеобластов, которые в результате своей синтетической деятельности оказываются замурованными в обызвествленном матриксе. При этом интенсивность синтетических процессов в замурованных клетках резко падает [144; 138]. Тем не менее, остеоциты поддерживают нормальное состояние костного матрикса (и баланс Са2* и РО43" в организме), обладая способностью не только вырабатывать его компоненты, но и частично растворять его. Они запускают локальный процесс перестройки костной ткани, ограниченной мелким участком скелета [120; 162; 188; 189].
Остеокласты - крупные многоядерные клетки, сформированные посредством слияния мононуклеарных клеток гемопоэтической природы, расположенных в костном мозге [175]. Эти клетки имеют ряд характерных особенностей строения. У остеокластов выделяют гофрированный край и светлую зону. Гофрированный край, как правило, обращен к резорбируемой поверхности, а светлая зона определяет место
10
прикрепления остеокласта к матриксу. Цитоплазма остеокластов имеет ацидофильный характер. Остеокласт - первичная клетка, резорбирующая кость, которая может находиться в активном и неактивном состоянии. В активном состоянии остеокласты продуцируют гидролитические ферменты и ионы Н+, растворяя, таким образом, как органические, так и неорганические компоненты костного матрикса [120; 123; 189]. В настоящее время выяснены механизмы активации костной резорбции, однако непонятно, каким образом выбирается место резорбции и механизм прикрепления чистой зоны.
Большинство исследователей считают, что потенциальными предшественниками остеокластов являются моноциты и макрофаги, хмежду которыми существует несколько отличий. Моноциты имеют складчатую мембрану, активную кислую фосфатазу, нескольких ядер и большую подвижность, но они не образуют гофрированный край, направленный к матриксу и их взаимодействие с участком кости происходит посредством фагоцитоза [181]. Одной из наиболее важных функций моноцитов и макрофагов является продукция фактора, некротизирующего опухоль а (ФНО-а), интелейкина 1а и ? (ИЛ-1а, -?), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-ФСК) [171; 185].
По одной из наиболее распространенных теорий остеобласты и остеокласты, формирующие кость, происходят от мультипотентной стволовой клетки, которая является родоначальницей хрящевой, мышечной, жировой и других клеток соединительной ткани [163]. Из этой клетки сначала образуется скелетная клетка предшественница, которая в дальнейше*м может давать начало костным клеткам, хондробластам и преостебластам. Наличие общей клетки предшественницы подтверждено экспериментально [141; 149]. К тому же, клетки предшественники присутствуют в зрелой костной ткани и обладают хондрогенными возможностями. Количество этих клеток может снижаться с возрастом,
11
этим .можно объяснить медленное заживление переломов в пожилом и старческом возрасте. [149].
1.2. Внеклеточный матрикс
Минерализованный матрикс костной ткани — уникальный секреторный продукт, создаваемый преимущественно клетками остеобластной линии [7; 79]. Он поддерживает структуру скелета под координирующим влиянием остеобластов и остеокластов [16; 73].
Коллаген. Коллагеновые волокна — главный компонент большинства соединительных тканей, а коллаген — наиболее распространенный белок. Молекула коллагена — спираль из трёх про-а-цепей. Длина подобной спирали — 300 нм, диаметр — 1,5 нм. Все типы коллагена содержат области с повторяющейся последовательностью из трёх аминокислот с глицином в третьем положении. Первая аминокислота в такой последовательности может быть любой, вторая — пролин, гидроксипролин или лизин [42]. Благодаря обилию поперечных связей между остатками лизина коллагеновые волокна обладают высокой прочностью [45; 75; 92]. Известно не менее 13 типов коллагена. Наиболее распространены коллагены первых пяти типов, остальные встречаются сравнительно редко и в небольших количествах; иногда в литературе их называют минорными [107]. Коллагены типов I, II и Ш образуют фибриллы с периодичностью 65 нм. Коллаген типа I — один из наиболее распространённых, синтезируется фибробластами, остеобластами [131; 180]. Коллаген типа II синтезируется хондробластами, хондроцитами, нейронами сетчатки, присутствует в стекловидном теле. Коллаген типа Ш входит в состав ретикулиновых волокон, образующих нежную поддерживающую сеть в некоторых органах и тканях, синтезируется фибробластами. Коллаген типа IV образует сетевидную основу базальных мембран, синтезируется большинством эпителиальных клеток. Коллаген типа V присутствует в кровеносных сосудах и в костном матриксе, синтезируется остеобластами [131; 180].
12
Синтез коллагена изучен достаточно глубоко [93; 131; 135; 165]. Наиболее интересным является процесс посттрансляционной модификации коллагена (Рис. I). Отечественными и зарубежными учеными в 70-х годах прошлого столетия было установлено, что на этом этапе гидроксилируются определенные пролиновые, в положение Q или С2, и лизиновые остатки [93]. Кроме того, определенные остатки гидроксилизина гликозилируются специфическими трансферазами углеводов с образованием галактозил-гидроксилизил или глюкозил-галактозил-гидроксилизиновых остатков, значение которых в формировании структуры коллагена изучено недостаточно. Взаимосвязь трех созданных а-цепей в начале формируется за счет дисульфидных «мостиков» в С-концевых неколлагеновых пептидах. Процессы гидроксилирования и гликозилирования продолжаются в эндоплазматическом ретикулуме до тех пор, пока а-цепи преобразуются в стабильную молекулу, имеющую форму тройной спирали [165; 176].
Формирование структуры тройной спирали полностью заканчивается в эндоплазматическом ретикулуме, и молекула перемещается в аппарат Гольджи, где продукты жизнедеятельности клетки упаковываются для секреции.
Синтез полипептидных а-цепей, их гидроксилирование и гликозилирование, а также образование спирали из трех а-цепей происходят в гранулярной эндоплазматической сети и комплексе Гольджи. Молекулы проколлагена накапливаются в секреторных пузырьках и выделяются во внеклеточное пространство. Вне клетки от полипептидов отщепляются концевые пептиды и формируются коллагеновые фибриллы [123].
13
Синтез про-а-цепи
Гидроксилирование остатков пролина I и лизина I
он ом
Гликозилирование
остатков гидроксилизина
_. ОН
Три про-а-цепи
разование ной спирали
Молекула проколлагена
Рибосома гранулярной эндоплазматической сети
Процессы, происходящие во внутриклеточных мембранных структурах (эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи, секреторные пузырьки)
Плазматическая мембрана
Отщепление он концевых пептидов
он'
Сборка зрелой коллагеновой фибриллы
Молекула коллагена (тропоколлагена)
Сборка микрофибриллы
Микрофибрилла
kW
I Агрегация фибрилл I в коппагеиовое У волокно
Коллагеновая фибрилла
Коллагеновов
ВОЛОКНО
Рис.1 Образование коллагенового волокна по В Alberts [114]
Затем секреторные пузырьки перемещаются к поверхности клетки и молекулы проколлагена выходят в межклеточное пространство. В этот момент «неколлагеновые» N- и С-терминальные области интерстициальных фибриллярных коллагенов тина I, II, III, V и XI удаляются специфическими N- и С-пептидазами, которые могут регулировать формирование фибрилл [135]. Кроме того, в последние десятилетия отечественными и зарубежными учеными предпринимаются попытки применять метод количественного определения пропептидов коллагена для диагностики патологии связанной с нарушением синтеза,
14
коллагена, однако на сегодняшний день значение этого показателя остается малоизученным [55; 56]. Волокна формируются путем агрегации трехспиральных молекул в параллельно расположенные структуры с определенным продольным сдвигом в 67 нм, что придает им типичный полосатый вид при электронной микроскопии. Неколлагеновые концевые пептиды других нефибриллярных типов коллагена, из которых наиболее примечателен тип IV, по-видимому, не отщепляются. Возможно, что по этой причине данные коллагены не формируют взаимосвязанных фибриллярных структур, а имеют сетчатое строение [79]. Однако в доступной нам литературе мы не встречали сообщений, подтверждающих данное утверждение.
В исследованиях, проведенных С. Niyibizi, установлено, что, депонируясь в тканях, сформированные фибриллы коллагена стабилизируются посредством образования ковалентных поперечных связей [160]. Эти связи образуются вследствие превращения лизиновых или гидроксилизиновых остатков в их альдегидные производные под действием фермента лизиноксиоксидазы [180].
Эти две видоизмененные аминокислоты конденсируются вместе с лизиновыми и гидроксилизиновыми остатками и формируют внутри- и межмолекулярные поперечные связи. Могут также возникать сложные поперечные «сшивки» между цепями (пиридинолины). Поперечные «сшивки» фибрилл, по-видимому, расположены преимущественно в коротких телопептидных частях N- и С-концевых отделов, хотя подобные поперечные связи найдены и внутри спиральных отделов молекулы. Несмотря на достигнутые успехи в изучении формирования коллагеновой фибриллы и ее катаболизма, невыясненным остается детальный механизм и полный ферментный спектр этих процессов.
Коллаген составляет приблизительно 90% органического матрикса кости. Коллагеновый состав кости в определенной степени необычен тем, что фактически представлен только коллагеном I типа [91; 132], хотя
15
следы других типов коллагена, таких как V, XT и XII, все же определяются [160; 180]. Происхождение этих типов коллагена в костной ткани не установлено. Не исключено, что эти типы коллагена принадлежат другим тканям, которые хотя и находятся в костной ткани, но не входят в состав костного матрикса. Согласно исследованиям P.G. Robey V тип коллагена, обнаруживаемый в сосудах, пронизывающих кость, обычно невозможно обнаружить до того, как будет осуществлена экстракция белков. Тип XI находится в хрящевой ткани и может соответствовать остаткам кальцифицированного хряща, а источником коллагена XII типа на самом деле могут быть «заготовки» коллагеновых фибрилл. До сих пор он обнаруживался в развивающейся костной ткани только иммунологическими методами, а изолировать его химическим путем или визуализировать с помощью электронного микроскопа пока не удалось. В отличие от других видов соединительной ткани, в костном коллагене I типа среди гликозилированных аминокислотных остатков преобладают производные моносахаридов (галактозил), а не дисахарида (гликозил-галактозил) [165; 177]. В костной ткани коллаген I типа имеет меньше поперечных связей, чем в других видах соединительной ткани, и формирование этих связей изучено недостаточно [132]. Еще одним возможным отличием является то, что N-терминальный пропептид коллагена I типа фосфорилирован [182], а также то, что этот пептид сохраняется (по крайней мере, частично) в минерализованном матриксе. Такая посттрансляционная модификация проколлагена в других видах соединительной ткани пока не выявлена, а также не установлена ее роль в формировании фибриллы.
Исследования коллагена ведутся очень давно, так как коллаген является одним из самых распространенных белков в организме, обладающим уникальными свойствами. Но, в тоже время, его исследования затруднены из-за того, что сложно выделить чистые препараты коллагеновых фибрилл. Наиболее удобным способом
16
t
установления количества коллагена является определение аминокислоты гидроксипролина, которая является характерной меткой этого белка. R.E. Neuman еще в 1951 году разработал формулу определения массы коллагена по гидроксипролину, исходя из того, что содержание этой аминокислоты составляет 13,7% [159]. В настоящее время этот показатель является общепринятым, но иногда для идентификации коллагенов используют определение гидроксилизина.
Для определения различных типов коллагеновых волокон используют более глубокий химический анализ, включающий определение молекулярной массы и изучение аминокислотного состава. В доступной нам современной литературе не удалось обнаружить данных о содержании гидроксипролина в различных его типах. Есть некоторые данные о содержании гидроксипролина в «незрелых формах» коллагена кожи эмбрионов на различных этапах развития. [99]. По мнению A.A. Тустановского и соавт. у новорожденного содержание гидроксипролина практически линейно возрастает от 1,1% до 12,8% от веса сухой ткани, т.е. к рождению плода коллагеновые фибриллы практически «дозревают» и мало отличаются от зрелого коллагена. В 1969 году Л.И. Слуцкий и соавторы подробно описали аминокислотный состав коллагеновых он и аг цепей. По их данным содержание остатков 3-гидроксипролина составляет от 0,5 до 1 остатка на 1000 аминокислотных остатков цепи, а содержание 4-гидроксипролина - 86-97 остатков на 1000 [54].
Подробно изменения коллагена при старении человека описаны Л.И. Слуцким и Е.П. Пфафордом и датируются 1980 годом. По их данным, содержание коллагена в компактной кости человека при старении увеличивается, достигая максимума к 60 - 74 годам, от 2,48±0,27 г/100г сухой обезжиренной ткани в возрасте 19-44- года до 3,02±0,30 г/100г в возрасте 60-74 года, а затем опять резко уменьшается и к 89 годам приближается к показателям молодых людей: 2,64±0,28 г/100г [92]. Другие данные приводит Е.Т. Хромяк - 1,9 г гидроксипролина на
17 |
