1. ВВЕДЕНИЕ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Рак толстого кишечника (РТК) является одной из самых распространенных онкопатологий в развитых странах. В России эта форма рака занимает 3-место после рака легкого и желудка. За период 1992-1995 г. зарегистрировано 40000 случаев заболевания. Смертность составила более 75%. Статистика заболевания по Европе за 1992-1995: в 130000 случаях заболевания смертельные исходы наблюдались в 75% [Александров, 2003]. В США в 2002 году было зарегистрировано 142000 случаев заболевания РТК. Кумулятивный риск заболевания РТК на протяжении жизни индивида составляет 5-6% [Grady, 2003]. 3-5 % всех случаев заболеваний приходится на наследственную (семейную) форму, которая характеризуется высоким риском заболевания (до 90% в течение жизни). Во всех случаях наследственной формы РТК в опухолевых клетках обнаруживаются свидетельства дефицита пострепликативной корректирующей репарации ДНК (MMR, mismatch repair).
Из всех известных на сегодня заболеваний, связанных с генетическими дефектами и предрасположенностью к раку, только в двух прослеживается однозначно связь с дефектами в механизмах репарации ДНК. Это наследственный неполипозный рак толстого кишечника (НРТК, синдром Линча) и пигментная ксеродерма [Jiricny, 1994; Friedberg et al., 1995; Bootsma et al., 1998]..В случае НРТК дефекты MMR проявляются в виде мутаций в генах системы MMR и/или в виде микросателлитной нестабильности (МСН). Поэтому мутации генов системы MMR и
6
микросателлитная нестабильность генома в опухолевых клетках стали распространенными маркерами заболевания НРТК [Vasen et al., 1999].
В то же время в многочисленных исследованиях показано, что в 30% случаев заболевания спорадическим РТК в клетках опухолей также наблюдается МСН генома [Штам и др., 2004; Boland et al., 1998]. Однако, в отличие от семейной формы заболевания, здесь МСН чаще всего ассоциирована не с мутациями в генах системы MMR, а с гиперметилированием промоторов этих генов [Veigl et al., 1998]. Сюда же можно отнести и многочисленную группу заболеваний, формирующих так называемый «спектр РТК» [Vasen et al., 1999]. Таким образом, для довольно большой группы заболеваний РТК такой показатель как мутации генов MMR не может быть исчерпывающим маркером заболевания. Мы полагаем, что в большей степени этому требованию соответствует такой показатель как функциональная активность MMR. Кроме того, разработка более-менее универсальных маркеров заболевания позволило бы выделить группы риска, прогнозировать возникновение заболевания и предупреждать его.
Как следствие дефицита MMR, в опухолевых клетках формируется мутаторный фенотип и устойчивость к цитотоксическому действию алкилирующих/метилирующих агентов [Aquilina et al., 2000]. Главным цитотоксическим повреждением при химическом метилировании ДНК является О6-метилгуанин (O6-MeG) [Kaina et al., 1993]. Две особенности отличают O6-MeG от других алкилированных оснований: в клетках млекопитающих он может быть репарирован только прямым деметилированием при участии метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) [Kaina et al., 1990]; не будучи репарированным, это повреждение не блокирует репликацию и сохраняется в пострепликативный период [Kaina et al., 1997]. В этом случае образуется некорректная пара O6-MeG : Т, которая является субстратом для механизма коррекционной репарации
7
ДНК (MMR). O6-MeG сильно напоминает аденин, и потому полимераза в процессе синтеза вставляет комплементарный ему тимин, формируя неправильную пару O6-MeG : Т. В ответ инициируется MMR, начинающая процесс эксцизионного удаления тимина в дочерней цепочке ДНК. Создается тупиковая для MMR ситуация, когда в матрице присутствует неудаляемый дефект, а полимераза не может подобрать ему комплементарную пару, всякий раз в процессе ресинтеза воспроизводя пару O6-MeG : Т. Если клетка, содержащая в геноме такую пару, вступит в следующий цикл репликации, то неизбежной будет транзиция G : С—»А : Т (последовательно: G : С + Alk -» O6-MeG : С +. I цикл репликации-» O6-MeG : Т + II цикл репликации —> А : Т). Показано, что в опухолевых клетках эпителия ТК (дефицитных по MMR) частота таких транзиций соответствует 1 на 8 O6-MeG для гена hprt [Rasouli-Nia et al., 1994], но может быть и выше в случае, например, онкогена K-ras [Esteller et al., 2000; Jackson et al., 1999]. Однако вступлению во второй цикл репликации препятствует активная система MMR, которая возобновляет процесс эксцизии и последующего ресинтеза. Разрешается эта коллизия радикально: длительное существование обширной бреши в дочерней цепи ДНК делает неизбежным формирование двунитевого разрыва под действием внутриклеточных эндонуклеаз. Его появление запускает механизм апоптоза. Таким образом, эффективная система MMR инициирует программу гибели полноценных по репарации клеток, содержащих O6-MeG. Дефицитные по MMR опухолевые клетки при РТК сохраняют жизнеспособность. При этом они приобретают новые мутации за счет G : С -» А : Т транзиций, что, с одной стороны, увеличивает вероятность их трансформации, а с другой — расширяет селективные возможности опухолевых клеток и позволяет им адаптироваться к генотоксическим воздействиям. Этот механизм может частично объяснять
8
их пониженную способность к апоптозу в ответ на действие алкилирующих агентов [Bedi et al., 1995]. Таким образом, в основе механизма цитотоксического действия O6-MeG лежат вторичные разрывы ДНК, которые формируются в ходе функционирования системы MMR [Kaina, 2003].
Как видно, активная система MMR трансформирует первичное повреждение О -MeG в двунитевой разрыв ДНК. Эти вторичные разрывы, возникающие в пострепликативный период (спустя >1 цикла репликации), могут быть показателем функциональной активности MMR в клетке и маркером в оценке риска возникновения РТК у человека. Экспериментальная проверка этого предположения составляет содержание данной диссертации.
Цель и основные задачи исследования
Цель настоящего исследования состоит в проверке на опухолевых клетках человека предположения о том, что количество вторичных двунитевых разрывов ДНК (ДР) в ответ на действие монофункционального метилирующего агента может отражать эффективность функционирования системы MMR в клетке.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Отобрать три линии клеток опухолей человека, которые генетически отличаются по активности коррекционной репарации ДНК.
2. Оценить чувствительность этих клеток к действию монофункционального метилирующего агента метилнитрозомочевины (МНМ) по показателю цитотоксичности.
3. Исследовать частоту гибели этих клеток по механизму апоптоза, индуцированного метилнитрозомочевиной.
9
4. Исследовать количество и динамику образования вторичных двунитевых разрывов в клетках под влиянием МНМ.
5. Исследовать первичную структуру генов MLH1 и MSH2 в линии опухолевых клеток Colo320HSR с неохарактеризованной системой коррекционной репарации с целью выявления мутаций в этих генах, приводящих к возникновению рака толстого кишечника.
6. Сопоставить эти показатели между собой и прокоррелировать их с предполагаемой активностью MMR.
Научная новизна
1. В работе предложен механизм реализации генотоксического действия монофункционального метилирующего агента метилнитрозомочевины в цитотоксический эффект через вторичные двунитевые разрывы ДНК, возникающие в результате функционирования пострепликативной MMR.
Ч Таким образом, три показателя: количество вторичных МНМ-
индуцированных разрывов ДНК, цитотоксический эффект МНМ (частота отсроченного апоптоза) и эффективность MMR - представлены взаимосвязанными в одном механизме.
2. На основании этого предлагается простая процедура оценки функциональной эффективности пострепликативной репарации, MMR. Процедура апробирована на трех линиях опухолевых клеток человека, различающихся генетически по эффективности MMR. Впервые эффективность MMR этих клеток выражена количественно в виде числа вторичных двунитевых разрывов ДНК, возникающих в ответ на действие метилнитрозомочевины.
3. Впервые проведено исследование первичной структуры генов MLH1 и MSH2 системы MMR клеток рака сигмовидной кишки человека Colo320HSR. Обнаружена мутация-трансверсия в 520 кодоне 10-го экзона гена MSH2. Показано, что по эффективности MMR, выраженной в
10
количестве вторичных разрывов ДНК, эта линия клеток занимает промежуточное положение между линиями HeLa и НСТ116, занимающих крайние позиции MMR-профицитных и MMR-дефицитных клеток. 4. Результаты проведенного исследования являются основанием для разработки простой системы тестирования MMR с целью прогноза эффективности химиотерапии, а также для оценки риска возникновения рака (используя соматические клетки человека — лимфоциты здоровых доноров и онкологических больных).
Научно-практическая значимость работы
Результаты данного исследования могут иметь фундаментальное и прикладное значение.
1. Они позволяют понять механизм реализации генотоксического сигнала алкилирующих агентов в цитотоксический эффект.
2. Оценить роль вторичных разрывов в цитотоксическом эффекте алкилирующих агентов и разработать на этой основе модельные системы для определения эффективности новых лекарственных препаратов и прогноза их использования в терапии опухолей с дефектной системой MMR.
3. Эффективный механизм MMR является фактором, противостоящим генотоксическому прессингу алкилирующих агентов эндогенного происхождения и в окружающей среде. С другой стороны, эффективная MMR является предпосылкой успешного применения противоопухолевых лекарств, включая алкилирующие соединения (поскольку дефицит MMR сочетается с устойчивостью клеток ко многим химиотерапевтическим препаратам). Результаты данного исследования помогут разработать простую систему тестирования MMR с целью прогноза эффективности химиотерапии, а также для оценки риска возникновения рака.
11
Положения и результаты, выносимые на защиту
1. Один из путей реализации цитотоксического эффекта метилнитрозомочевины в клетках включает в себя: образование O6-MeG - 1-й цикл репликации - формирование неканонической пары (O6-MeG : Т) - активизацию MMR, повторяющиеся циклы эксцизия-ресинтез в функционирующей MMR (абортивная MMR) -формирование обширной долго живущей однонитевой бреши в ДНК - трансформация бреши в ДР - инициация сигнального пути апоптоза.
2. Цепочка в полной мере реализуется только в делящихся клетках с функционирующей системой MMR (в данной работе - в клетках HeLa).
3. Клетки, дефицитные по MMR (в данной работе - клетки НСТ116), проявляют устойчивость к МНМ (по показателям клеточной гибели) и не обнаруживают предшествующих апоптозу двунитевых разрывов в ДНК.
4. Клетки аденокарциномы сигмовидной кишки Colo320HSR содержат нейтральную мутацию в 520 кодоне 10 экзона гена MSH2. По количеству МНМ-индуцированных вторичных разрывов клетки Colo320HSR занимают промежуточное положение между MMR-профицитными клетками HeLa и дефицитными клетками НСТ116. В клетках линии Colo320HSR наблюдается пониженная способность МНМ-индуцированных ДР вызывать апоптоз.
5. Предлагаемая процедура определения количества вторичных ДР в ответ на действие МНМ может стать основой для оценки функциональной эффективности MMR в опухолевых и соматических клетках.
12
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ТЕМЕ
2.1. МЕХАНИЗМЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ДНК В КЛЕТКЕ
Геном клетки на протяжении ее существования в организме подвергается различным «запланированным» (функциональным) и случайным перестройкам. Последние происходят в результате воздействия различных химических агентов эндогенного происхождения или повреждающих факторов внешней среды. На протяжении длительного времени эти воздействия являются факторами биологической эволюции, а на протяжении индивидуальной жизни эти воздействия служат источником мутаций, канцерогенеза и гибели организма. В противовес этому в клетке сформировались механизмы, поддерживающие стабильность генома на протяжении существования клетки — механизмы репарации генома. Идентификация и описание этих механизмов является важнейшим достижением современной биологии.
На сегодня описаны 5 механизмов репарации ДНК в клетках: эксцизионная репарация оснований (base excision repair, BER), эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER), коррекционная репарация некорректных пар (mismatch repair, MMR), прямое восстановление поврежденных оснований и репарация двунитевых разрывов ДНК (включает репарацию по механизму гомологической рекомбинации, HRR и воссоединение негомологичных концов, NHEJ). Из всего спектра повреждений ДНК наибольшую долю составляют повреждения оснований. Они и результат их ошибочной репарации приводят к мутациям и канцерогенезу. Поэтому в обзоре рассматриваются
13
в основном первые три механизма репарации ДНК, объединяемых общим названием эксцизионных механизмов репарации. Следует отметить, что первые два из них (BER и NER) оперируют в основном с такими повреждениями, которые являются стопором для ДНК-полимеразы. В силу этого их функция осуществляется главным образом в дорепликативный период. Третий механизм является пострепликативной репарацией, так как он направлен на исправление ошибок ДНК-полимеразы.
2.1.1. ДОРЕПЛИКАТИВНАЯ ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ
Эксцизионная репарация оснований (BER) начинается с активации специфических гликозилаз, которые, не нарушая целостности сахаро-фосфатного остова ДНК, гидролизуют N-гликозидную связь и удаляют поврежденное основание [Sakumi and Sekiguchi, 1990]. В результате образуется апуриновый/апиримидиновый сайт (АП). АП может заблокировать работу ДНК-полимераз, но часто фермент обходит АП, вставляя некомплементарный нуклеотид в синтезируемую молекулу ДНК [Goodman et al., 1994], что является причиной мутаций. В Escherichia coli чаще других таким нуклеотидом оказывается dATP. Это привело к постулированию, так называемого, «А-правила»: ДНК-полимераза напротив АП делает нематричную вставку в дочернюю нить в виде аденина [Strauss, 1991]. Полимеразы эукариот допускают отклонения от этого правила (обзор [Ramotar, 1997]).
АП может быть репарирован. Для этого привлекается АП-эндонуклеаза, которая делает разрыв в 5'- либо в З'-положении от АП и удаляет сахарный остаток. Образовавшаяся брешь заполняется ДНК-полимеразой ? (Рис. 1). Размер бреши варьирует в пределах нескольких нуклеотидов и определяется двумя обстоятельствами: наличием у
>
14
Гликомлааа
АР-эццо
Поврежденное основание
Эксцизия короткого участка
Брешь: ДНК-полимераза ?
I
Лигирование: ДНК-лигазаШ + ERCCI
Эксцизия протяженного участка
Ник-трансляция: ДНК-полимеразы ? или е/6 + PCNA
1
Ооразование flap
1
Удаление flap: FEN1 ч-PCNA
1
Лигирование: ДНК-лигаза I
Рисунок 1. Механизм репарации поврежденного основания
(BER)
15
АП-эндонуклеазы фосфодиэстеразной активности и участвующей в ресинтезе полимеразой. Полимераза ? заполняет очень короткие бреши [Randahl, Elliott and Linn, 1988], а полимеразы 5 и с заполняют брешь по механизму ник-трансляции с привлечением PCNA (proliferating cell nuclear antigen) в качестве процессирующего фактора [Savio et al., 1998]. В этом случае образуется свисающий конец из нескольких нуклеотидов (flap <6 нуклеотидов [Seeberg, Eide and Bjoras, 1995]), который удаляется flap-эндонуклеазой (FEN-1) [Harrington and Lieber, 1994; Barnes et al., 1996]. Субстратный диапазон BER определяется количеством типов гликозилаз, инициирующих этот тип репарации.
Ясно, что BER с эксцизией коротких участков ДНК характеризуется низкой вероятностью ошибки и малым временем жизни брешей. Кроме того, оказалось, что BER включает в себя также редактирование ошибок, допускаемых ДНК-полимеразой. В работе [Chou and Cheng, 2002] показано, что АР эндонуклеаза1 обладает З1—>5' экзонуклеазной активностью. Эта активность в 50 раз выше в случае наличия некорректных пар (например, Т : G). Благодаря этой активности осуществляется «редактирование» вновь синтезированной цепи ДНК и исправление допущенных полимеразой ошибок. Небольшая степень эксцизии и ресинтеза, а так же коррекция вновь синтезированной цепи обеспечивает высокую точность механизма BER. Все это говорит о том, что вклад этого типа репарации в апоптоз невысок и объясняет малое количество публикаций, в которых апоптоз рассматривался на фоне функционирующей системы BER [Schreiber et al., 1995].
Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER) характеризуется более широким набором дефектов, удаляемых этим механизмом -тиминовые димеры, фотопродукты, аддукты взаимодействия псоралена с тимином, аддукты цисплатины и др. Универсальность NER достигается благодаря большому количеству белков, участвующих в процессах
16
узнавания дефекта и присоединения к нему. Репаративный комплекс NER включает в себя, по крайней мере, 16 полипептидов [Yu et al., 1999]. Большинство ферментов, входящих в систему NER человека, идентифицировано в исследованиях клеток человека с заболеванием пигментной ксеродермой (ХР-синдром). Поэтому их названия часто содержат сокращение ХР. Первая группа ферментов ответственна за выполнение начальных операций NER - узнавание, связывание и инцизию. В нее входят следующие белки: ХРА (р31), ответственный за узнавание дефекта; RPA/HSSB (р70) осуществляет связывание комплекса с повреждением в ДНК; TFIIH/XPB/ERCC3 (р89) формирует эксцизионный комплекс, обладает хеликазной активностью; XPF/ERCC4 (рП2) делает 5'-разрыв; ERCC1 (рЗЗ) взаимодействует с XPF; XPG/ERCC5 (р135) делает 3'-разрыв, обладает FEN-активностью.
Благодаря активности комплекса, формируется однонитевой «flap», содержащий 27 — 29 нуклеотидов, включая поврежденный [Huang and Sancar, 1994]. Удаление flap может быть связано с этапом инцизии, в результате формируется брешь [Svoboda et al., 1993]. Ее заполнение осуществляет одна из ДНК-полимераз 5 или 8 совместно с фактором PCNA, облегчающим диссоциацию эксцизионного комплекса от ДНК [Shivji, Kenny and Wood, 1992]. Разрывы по концам вставки сшиваются ДНК-лигазой. Как видно, эксцизия протяженного участка при BER и эксцизия в NER отличаются только длиной формируемого flap - <6 и 27 - 29 нуклеотидов соответственно.
Как и в случае с BER, сигнал к апоптозу в процессе NER может генерироваться на этапе репаративного синтеза. Учитывая, что длина эксцизионной бреши больше 20 нуклеотидов, при высокой локальной плотности повреждений несколько брешей могут слиться в одну. В связи с возникновением сравнительно протяженных участков однонитевой ДНК
17 возрастает вероятность их атаки нуклеазами и превращения в двунитевой
'г разрыв.
Часть повреждений ДНК, индуцированных цисплатиной, является диаддуктами и формирует сшивки между соседними основаниями ДНК [Fichtinger-Schepman et al., 1985]. Репарация таких дефектов может проходить через образование временного двунитевого разрыва. Не будучи репарированными, сшивки блокируют репликацию. Такой блок может фиксировать неканонические структуры в ДНК, приводящие к «структурному стрессу». Все это приводит к индукции апоптоза цисплатиной как в пролиферирующих, так и в покоящихся клетках [Borner, Joncourt and Hotz, 1997]. Зависимость апоптоза от PARP (poly(ATP-ribose)-polymerase) свидетельствует об участии в индукции апоптоза разрывов ДНК, которые формируются в результате функционирующей в клетках эксцизионной репарации [Beneke et al., 2000].
г.'
2.1.2. ПОСТРЕПЛИКАТИВНАЯ ЭКСЦИЗИОННАЯ РЕПАРАЦИЯ
Корректирующая репарация, MMR осуществляет очень важную функцию маркировки и исправления неканонических пар оснований G : Т, G : А, С : А и др., возникающих при репликации. Такие неправильные пары (mispairs, MM) возникают случайно с частотой 1/10000 как результат ошибки ДНК-полимеразы [Eger and Benkovich, 1992]. Кроме того, при репликации участков ДНК, содержащих многократно повторяющиеся последовательности из нескольких оснований (микросателлитные ДНК), фермент допускает "проскальзывание", пропуская несколько оснований
[Verma et al., 1999]. В результате нить, синтезируемая на матрице, в этом к»
месте становится короче своего оригинала на пропущенное число

Получить работу