Список сокращений и условных обозначений
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АРП - активность ренина плазмы
АНГ-1 - ангиотензин-1
А4 - А4-андростендион
БИК - болезнь Иценко-Кушинга
ВГКН-СФ - стертая форма врожденная гиперплазия коры надпочечников
ВГКН-ПВФ - простая вирильная форма ВГКН
ГА - гиперандрогения
ГСПГ — глобулин, связыающий половые гормоны
ГНО - гормонально-неактивная опухоль
ДГТ - 5а-дигидротестостерон
ДГЭА- дегидроэпиандростерон
ИФА — иммуноферментный анализ
ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста -1
ИМТ - индекс массы тела
ЛГ - лютеинизирующий гормон
НГА - надпочечниковая гиперандрогения
ОЖ- ожирение с розовыми стриями
ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная
хроматография
РИА - радиоиммунологический анализ
СИК - синдром Иценко-Кушинга
СПКЯ - синдром поликистозных яичников
CV - коэффициент вариации
Т — тестостерон
УЗИ - ультразвуковое исследование
ФСГ - фолликулостимулирующий гормон
11 Р-ГД - 11 Р-гидроксилаза
21 -ГД - 21 -гидроксилаза
1 lp-OHD - недостаточность 11 Р-гидроксилазы
21-0HD — недостаточность 21-гидроксилазы
р-ЦД - Р-цикло декстрин
F - кортизол
Е - кортизон
В - кортикостерон
DOC-11-дезоксикортикостерон
S -11-дезоксикортизол
UFF - свободный кортизол мочи
UFE - свободный кортизон мочи
Ф
ВВЕДЕНИЕ
Заболевания, протекающие с нарушением функции гипофизарно-надпочечниковой системы, всегда привлекали пристальное внимание эндокринологов ввиду сложности их диагностики и лечения [31,39,50,55,64,108]. В последние годы в связи с развитием современных технологий и диагностических возможностей отмечается значительный рост частоты выявления больных с патологией коры надпочечников, как с опухолями, так и с неопухолевыми формами. Несмотря на достигнутые успехи в этой области, клиницисты часто сталкиваются с трудностями в дифференциальной диагностике различных форм вирильного синдрома ив ранней диагностике органического эндогенного гиперкортицизма.
Определение источника гиперпродукции андрогенов представляется трудной и важной задачей лабораторной диагностики. Отмечают многообразие форм гиперандрогении: надпочечниковая гиперандрогения (НГА), овариальная гиперандрогения (ОГА), смешанные формы гиперандрогении [53,55,71]. НГА наблюдается как самостоятельная патология и как сочетание с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ). Одной из причин НГА является явная или стертая форма врожденной ф гиперплазии коры надпочечников (ВГКН), которая встречается чаще, не
имеет клинических маркеров и может протекать как синдром поликистозных яичников (СПКЯ). Авторы отмечают как врожденные формы ферментной недостаточности надпочечникового стероидогенеза, обусловленные генетическим дефектом, так и вторичные формы ферментных нарушений биосинтеза стероидов [342,347]. У значительной части больных НГА может быть не связана с ферментными нарушениями биосинтеза стероидов [55].
Отсутствие клинических маркеров стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников, возможность развития вторичных форм ферментных нарушений биосинтеза стероидов, сочетание надпочечниковой
7
гиперандрогении (НГА) с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) осложняют поиск источника гиперпродукции андрогенов.
Определение базального уровня 17-гидроксипрогестерона в большинстве случаях не позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [83,131]. Нет единой точки зрения по диагностическим критериям стертой формы ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы [42,131,160,218,282,354,357]. Особую сложность представляет диагностика дефекта Пр-гидроксилазы [304,355]. При стертых формах ВГКН с недостаточностью lip-гидроксилазы биохимические критерии диагностики заболевания не разработаны. У гетерозиготных носителей недостаточности lip-гидроксилазы не отмечено каких-либо биохимических критериев, даже при стимуляции кортикотропином [355]. Альтернативный путь образования андростендиона из 11-дезоксикортизола и функциональное снижение активности 11 Р-гидроксилазы в условиях гиперандрогении любой этиологии создают определенные трудности при диагностике дефекта lip-гидроксилазы [130,175,232,294]. Дифференциальная диагностика дефекта 21-гидроксилазы от других форм ВГКН возможна только с помощью получения полного стероидного профиля [291].
На основании согласительного симпозиума в 2003 году в г. Роттердаме по диагностическим критериям СПКЯ диагноз его ставится при исключении других причин гиперандрогении, в том числе ВГКН и синдрома Иценко-Кушинга (СИК) [301]. Повышение экскреции свободного кортизола с мочой и уровня кортизола в крови при различных формах функционального гиперкортицизма и сохранение в некоторых случаях регуляции гипофизарно-надпочечниковой оси при субклиническом СИК вызывает определенные трудности в диагностике на данном этапе заболевания и требует изучения не только секреции кортизола, но и промежуточных продуктов стероидогенеза [111,334,343]. В настоящее время недостаточно изучены нарушения надпочечникового стероидогенеза у больных с инциденталомами. Ряд авторов отмечают, что случайно обнаруженные опухоли нередко выявляются
8
у больных с ВГКН и ферментные нарушения могут способствовать их развитию [168,223,300]. Показания к оперативному лечению при инциденталомах во многом зависят от обнаруженных у больных нарушений надпочечникового стероидогенеза [19,110,336,346].
В связи с этим представляется актуальной разработка дополнительных биохимических критериев стертых форм ВГКН и субклинического СИК. Особую актуальность приобретает поиск дополнительных маркеров недостаточности 11 р-гидроксилазы для выбора тактики лечения данных больных. Методы иммуноферментного и радиоиммунологического анализа не позволяют одновременно проанализировать в одном образце биологического материала содержание различных кортикостероидов, что необходимо для диагностики субклинических форм заболеваний коры надпочечников. Функциональные тесты могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты.
В последнее время подчеркивается значение мультифакторного анализа сложных биологических образцов в норме и при патологии и его связь с нарушениями, возникающими на уровне генома [94]. В связи с этим, особое значение приобретают хроматографические методы анализа, которые наряду с качественным и количественным анализом индивидуальных компонентов, позволяют получать стероидные профили крови и мочи, являющиеся наиболее ценными диагностическими тестами для заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов [73,335,345,350,353,359,364]. Для быстрой оценки общего состояния здоровья человека разрабатываются методы получения «обзорных» или «скрининговых» хроматограмм с оценкой всего профиля определяемых соединений [94]. Безусловный научно-практический интерес имеет разработка методов количественного определения и качественных характеристик индивидуальных кортикостероидов и оценка их дифференциально-диагностической значимости. Существующие в настоящее время клинико-лабораторные технологиим определения стероидных
9
профилей не адаптированы к диагностике субклинических форм заболеваний гипофизарно-надпочечниковой системы. Для оценки нарушений надпочечникового стероидогенеза отсутствуют четкие критерии выбора лабораторных методик, сведения о диагностической значимости исследуемых параметров, референтные значения для них. Решение данных вопросов необходимы для усовершенствования диагностики и выработки адекватной терапии пациентов с заболеваниями коры надпочечников.
Цель исследования.
Изучить информативность обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов, иммуноферментного и радиоиммунологического анализа для оптимизации существующих и разработки новых алгоритмов клинико-лабораторной диагностики заболеваний коры надпочечников.
Задачи исследования.
1. Разработать способ определения кортикостероидов в крови и моче на основе метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с учетом оптимизации регламента пробоподготовки и условий хроматографического анализа.
2. Изучить особенности надпочечникового стероидогенеза у больных с различными формами вирильного синдрома и у больных со случайно выявленными опухолями коры надпочечников на основании определения содержания кортикостероидов в крови и моче методом ОФ ВЭЖХ и в сопоставлении с традиционными методами иммуноферментного (ИФА) и радиоиммунологического анализа (РИА).
3. Установить информативные лабораторные биохимические критерии стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы, синдрома поликистозных яичников и смешанных форм гиперандрогении.
10
4. Установить информативные биохимические критерии субклинического синдрома Иценко-Кушинга и функционального гиперкортицизма по данным ОФ ВЭЖХ кортикостероидов в крови и моче.
5. Разработать алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников.
Научная новизна исследования. С использованием качественного и количественного и определения кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получены новые данные о механизмах нарушений этапов биосинтеза кортикостероидов на ранних стадиях заболевания при различных формах вирильного синдрома и опухолях коры надпочечников.
Впервые по данным ОФ ВЭЖХ установлены биохимические критерии для дифференциальной диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы. Информативные лабораторные критерии недостаточности различных изоферментов 11 Р-гидроксилазы выявлены по динамике уровней в крови 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона, соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и
кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином у больных с вирильным синдромом и у больных со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
Получены биохимические критерии, свидетельствующие о недостаточности Пр-гидроксистероиддегидрогеназы-1 у больных с синдромом поликистозных яичников (увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон).
Установлена информативность определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой на пробе с дексаметазоном, соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче для диагностики субклинического синдрома Иценко-
11
Кушинга и для дифференциальной диагностики органического и функционального гиперкортицизма.
Впервые разработаны алгоритмы лабораторной диагностики стертых форм врожденной гиперплазии коры надпочечников у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами.
Практическая значимость работы.
Исследования качественных и количественных нарушений надпочечникового стероидогенеза методом ОФ ВЭЖХ позволяют на ранних стадиях диагностировать заболевания коры надпочечников. Разработаны информативные биохимические критерии диагностики стертых форм ВГКН с дефектом 21-гидроксилазы и 11 Р-гидроксилазы, функционального гиперкортицизма, синдрома поликистозных яичников, смешанных форм гиперандрогении и субклинического синдрома Иценко-Кушинга. Показано диагностическое значение определения динамики уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, кортикостерона и соотношений кортизол/ 11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон при проведении пробы с кортикотропином для выявления недостаточности 11 р-гидроксилазы. Разработан алгоритм оценки гормональной активности различных аденом коры надпочечников, позволяющий диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном и стертые формы ВГКН у больных с инциденталомами коры надпочечников. Алгоритм лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома позволяет диагностировать стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином..
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Исследование качественного и количественного состава
кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой
высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет получить
специфические хроматограммы стероидных профилей при различных
• 12
заболеваниях коры надпочечников, установить на ранних стадиях нарушения надпочечникового стероидогенеза и метаболизма кортизола у больных с инциденталомами, дифференцировать стертые формы ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и Пр-гидроксилазы, органический и функциональный гиперкортицизм и способствует оптимизации тактики лечения больных с вирильным синдромом и со случайно обнаруженными опухолями коры надпочечников.
2. Общими информативными лабораторными критериями стертых форм - ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы и lip-гидроксилазы по
данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются уменьшение экскреции свободного кортизола с мочой, снижение соотношения свободный кортизол / свободный кортизон, уменьшение соотношения кортизол / кортизон до и в результате стимуляции кортикотропином, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
3. Недостаточность 11 Р-гидроксилазы диагностируется у больных с вирильным синдромом и у больных с инциденталомами при проведении пробы с кортикотропином на основании увеличения в крови уровней 11-дезоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона, снижения прироста уровня кортикостерона и соотношений кортизол/11-дезоксикортизол и кортизол/кортизон, полученных по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, и по снижению прироста в крови уровня альдостерона, полученного методом радиоиммунологического анализа.
4. Информативными биохимическими критериями синдрома поликистозных яичников по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизона с мочой и снижение соотношения свободный кортизол/свободный кортизон в моче, нормальные уровни в крови промежуточных продуктов стероидогенеза, а по данным традиционных методов анализа
13
- снижение в крови уровня глобулина, связывающего половые гормоны и увеличение уровней инсулина и С-пептида.
5. Наиболее информативными лабораторными критериями субклинического синдрома Иценко-Кушинга по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии являются увеличение экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой, недостаточное понижение их экскреции на пробе с дексаметазоном, повышение соотношений кортизол/кортизон в крови и свободный кортизол/свободный кортизон в моче, качественные изменения стероидных профилей в крови и моче.
6. Алгоритмы лабораторной диагностики различных форм вирильного синдрома и случайно обнаруженных опухолей коры надпочечников на основании качественного и количественного определения кортикостероидов в крови и моче методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и информативных показателей, полученных методами иммуноферментного и радиоиммунологического анализа, позволяют дифференцировать стертые формы ВГКН и синдром поликистозных яичников, диагностировать субклинический синдром Иценко-Кушинга до проведения пробы с дексаметазоном, а стертую форму ВГКН с недостаточностью 21-гидроксилазы до проведения пробы с кортикотропином.
Личный вклад автора. Участие автора в исследовании выразилось в определении основной идеи работы, личном участии в проведении лабораторных исследований, выполнении статистической обработки и анализа полученных данных.
Апробация работы.
Результаты исследования были доложены на заседаниях ассоциации эндокринологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (1999, 2001,
14
2004), на Российской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР В.Г. Баранова, «Актуальные вопросы эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2000 г.), 1У Всероссийском конгрессе эндокринологов «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Санкт-Петербург, 2001), 1-ой и 2-ой Международных конференциях «Высокие медицинские технологии XXI века» ( Испания, Бенидорм, 2002 и 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая эндокринология-достижения и перспективы» (Санкт-Петербург, 2003), 111 Международном симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003 г.), на 22-м Всемирном Конгрессе «Патология и лабораторная медицина» (Южная Корея, 2003), 2-ой Международной конференции «Врачи мира пациентам» (Санкт-Петербург, 2003).
Реализация результатов исследования. Результаты проведенного исследования внедрены в лечебно-диагностическую работу клиник ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава, эндокринного отделения больницы Св. Преподобномученицы Елизаветы (СПб), в педагогический и научно-исследовательский процессы кафедры эндокринологии им. акад. В.Г.Баранова ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 работ, в том числе 10 - в центральных журналах, рекомендованных ВАК, в главе монографии «Синдром Иценко-Кушинга». Получены 3 патента на изобретение, 2 приоритета на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 288 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 365 источников, из которых 113 — на русском языке. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 40 таблицами.
15
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Гормоны коры надпочечников, их биосинтез и метаболизм.
Надпочечники - парный орган, состоящий из коркового и мозгового вещества. В коре надпочечников выделяют 3 популяции клеток, синтезирующих из холестерола 3 группы кортикостероидных гормонов в соответствии с преобладающим действием на метаболизм: минералокортикоиды (альдостерон, 11-дезоксикортикостерон,
кортикостерон), глюкокортикоиды (кортизол, кортизон, кортикостерон) и андрогены (дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат, А4-андростендион). Из коры надпочечников выделено около 50 различных стероидов, большинство из которых является промежуточными продуктами синтеза активных гормонов. Регуляция надпочечникового стероидогенеза в разных зонах коры осуществляется по-разному. Секреция альдостерона клубочковой зоной коры надпочечников регулируется системой ренин-ангиотензин-альдостерон, автономно от эффектов АКТГ аденогипофиза. Для пучковой и сетчатой зон, которые являются частью гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, основным секреторным и трофическим стимулятором является АКТГ, выделение которого, в свою очередь, регулируется кортикотропин-рилизинг-гормоном (КРГ) по принципу отрицательной обратной связи [38, 100]. АКТГ стимулирует не только выработку и секрецию стероидных гормонов, но также синтез ДНК, РНК, и белка в коре надпочечников. При избытке АКТГ развивается гипертрофия надпочечников, при дефиците - их атрофия. АКТГ связывается с поверхностными рецепторами клеток коры надпочечников и активирует аденилатциклазу, что влечет за собой повышение содержания в клетке циклического аденозинмонофосфата (ЦАМФ), активацию
фосфопротеинкиназ, катализирующих превращение холестерина в
16
прегненолон и запуск каскада синтеза стероидных гормонов. Одновременно активируются энзимы, при продолжительном действии кортикотропина увеличивается активность ферментов стероидогенеза. Важнейшей особенностью биосинтеза стероидных гормонов является последовательное гидроксилирование. Гидроксилирование стероидного ядра по атомам углерода приводит к образованию разных продуктов - предшественников кортизола и альдостерона [16, 22, 24]. Стадии биосинтеза этих гормонов определяются комплексом ферментов, присутствующих в отдельных стероидогенных клетках мишенях, Все эти реакции имеют общий механизм: для них требуется НАДФН, молекулярный кислород и система донора кислорода, включающая цитохром Р-450. Однако, хотя цитохром Р-450 во всех реакциях гидроксилирования выполняет одну и ту же функцию, его белковая часть специфична для каждого субстрата. Степень активности микросомальнои гидроксилирующеи системы предопределена генетически и подвержена воздействию как эндогенных, в том числе гормональных, так и экзогенных факторов [90].
Описано по крайней мере четыре механизма регуляции функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы: циркадный ритм, стресс, подавление кортизолом по принципу обратной связи, стимуляция цитокинами. Циркадная ритмичность деятельности гипофизарно-адреналовой системы может проявляться на уровне надпочечников, гипофиза, гипоталамуса и является достаточно устойчивой и остается неизменной в течение всей жизни человека [35]. В обычных условиях гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система функционирует в суточном режиме. Возрастание частоты импульсов секреции АКТГ наблюдается в утренние часы, низкие цифры регистрируются ближе к полуночи, суточный ритм секреции АКТГ и кортизола может быть нарушен под влиянием стресса физического или психологического — стимулы из высших центров головного мозга и симпатической нервной системы увеличивают секрецию кортикотропин-рилизинг — гормона. Как и в
большинстве физиологических систем обратной связи, конечный продукт, в данном случае кортизол, является мощным фактором, подавляющим работу системы. Кортизол, если присутствует в адекватных количествах, снижает или полностью устраняет суточную и стрессовую стимуляцию АКТГ [36].
Воспалительные цитокины, фактор некроза опухолей и интерлейкины усиливают секрецию КРГ и с последующим возрастанием секреции АКТГ и концентрации кортизола. Кортизол подавляет воспалительную реакцию и реакцию высвобождения цитокинов. Эти недавно полученные сведения т позволяют предположить существование дополнительной петли обратной
связи, участвующей в регуляции секреции кортизола [61].
Биосинтез кортикостероидов осуществляется 2 путями: один приводит к образованию 17-оксикортикостероидов (главный конечный продукт - кортизол), другой - к образованию 17-дезоксикортикостероидов (главные конечные продукты - кортикостерон и альдостерон). Установлено, что надпочечники секретируют в кровь и кортизон (вещество Е). Его продукция находится в постоянном соотношении с секрецией кортизола. Кортикостерон (вещество В) продуцируется в количестве 1/5 - 1/10 от секреции кортизола. Надпочечники выделяют в кровь небольшое количество предшественника кортизола в биосинтезе - 11-дезоксикортизол (соединение S). Образование альдостерона, как и кортизола, носит эпизодический характер. 11-дезоксикортикостерон (ДОК, кортексон), являющийся важным промежуточным продуктом в биосинтезе кортикостерона и альдостерона, оказывает выраженное влияние на обмен электролитов. Он может синтезироваться во всех 3 зонах, но наибольшее его количество вырабатывается в пучковой зоне [ 99, 105].
Среди продуктов секреции пучковой и сетчатой зон имеются стероиды, обладающие андрогенной активностью: дегидроэпиандростерон (ДЭА), дегидроэпиандростерон-сульфат (ДЭА-С), андростедион и тестостерон. Все они образуются из 17-гидроксипрегненолона. В количественном отношении главными андрогенами надпочечников |
