6 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Липолитические ферменты всегда вызывали интерес ученых в связи со своими уникальными свойствами. Это действие на поверхности раздела фаз, разнообразие субстратной специфичности, способность катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции в микроводных условиях.
Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать моно- и диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Исследования в области ферментативного катализа, реакций этерификации открыли новые возможности использования липаз.
Таким образом, липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (олеохимической, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты.
Однако, внедрение липаз в производство сдерживалось в связи с их высокой стоимостью. Возможность иммобилизации ферментов в большей части решило эту проблему. Поэтому в последнее десятилетие исследования липаз развернулись в большем масштабе.
Несмотря на множество работ, посвященных липазам, трудно назвать такие, в которых они охарактеризованы достаточно полно с точек зрения свойств и структуры белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии ВГТА, соответствующих пла-ну госбюджетной НИР на 2001-2005 гг. (№ гос. регистрации 01930004491) по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств». Данная проблема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».
Цели и задачи исследования. Цель работы - получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403, иммобилизация фермента, исследование физико-ф химических свойств нативной и иммобилизованной липазы, изучение некото-
рых аспектов практического использования липазы в хлебопечении..Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
S разработка технологии получения ферментных препаратов липазы с различной степенью очистки;
S установление фракционного состава липолитического комплекса продуцента; S исследование некоторых свойств изоферментов липазы; S изучение каталитических свойств Липазы I: * ¦ идентификация функциональных групп активного центра;
¦ определение кинетических характеристик гидролиза три-глицеридов;
¦ изучение специфичности действия.
S иммобилизация липазы химическим и физическим способами;
S исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза трибутирина иммобилизованными липазами;
S проведение непрерывного гидролиза растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазами;
•S изучение роли гидролизованного масла в технологии хлебопечения (влияние на жизнедеятельность дрожжей, клейковину пшеничного теста и пшеничный крахмал).
Научная новизна. Установлено, что липолитический комплекс гриба Rhizopus oryzae 1403 состоит из двух изоформ.
На основе анализа кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I при различных значениях рН, а также в присутствии специфических ингибиторов, установлено, что в акте катализа принимает участие гистидин и она относится к сериновым ферментам. В поддержании активной конформации фермента определенную роль играют SH-группы.
Выявлено, что Липаза I обладает 1,3-позиционной специфичностью; селективно гидролизует связи, образованные жирными кислотами со средней длиной цепи и содержащими не более двух двойных связей.
Исследованы некоторые свойства и установлены кинетические параметры гидролиза трибутирина липазой, иммобилизованной различными способами.
Практическая значимость работы. Разработаны технологические стадии производства препаратов липазы различной степени чистоты, предложена схема получения изоферментов липазы. Осуществлена иммобилизация ацетоноса-жденного препарата липазы на гидрофобном сорбенте и анионите АВ-17-2П. Показана возможность непрерывного гидролиза растительного масла в установке с иммобилизованной липазой. Доказана целесообразность использования гидролизованного растительного масла в хлебопечении на основании того, что оно интенсифицирует процесс потребления углеводов дрожжевыми клетками, улучшает свойства клейковины и пшеничного крахмала.
Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001); «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001); 6-ой Международной научной конференции памяти В.М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002); 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002); 7-ой Пущин-ской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пу-
щино, 2003); Международном форуме «Аналитики и аналитика» (Воронеж, 2003); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); ежегодных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии 1999-2002 г.г. и др.
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, 1 патенте и 6 тезисах докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 14 таблиц. Список литературы включает 281 наименование, в том числе 165 на иностранных языках.
Автор выражает глубокую благодарность кандидату технических наук, доценту кафедры микробиологии и биохимии Воронеэ/сской государственной технологической академии СВЕТЛАНЕ АЛЕКСЕЕВНЕ ШЕЛАМОВОЙ, при непосредственном консультировании которой была выполнена настоящая диссертационная работа.
Работа выполнялась на базе кафедры микробиологии и биохимии Воронежской Государственной Технологической Академии. Автор искренне благодарит научного руководителя доктора технических наук, профессора Григорова В. С. за оказанную помощь в выполнении данной диссертационной работы, а также выражает признательность коллективу кафедры за доброжелательное отношение при выполнении работы и содействие при её оформлении.
10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Синтез липолитических ферментов микроорганизмами
Согласно современным представлениям липазы (триацилглицеролазы, К. Ф. 3. 1. 1.3) — это ферменты, способные гидролизовать длинноцепочечные триацилглицерины [239].
В настоящее время липазы активно исследуются во всем мире. По последним статистическим данным они составляют 25 % всех ферментов, используемых в биотехнологии. Это связано не только с их биологической ролью в метаболизме липидов, но и использованием в качестве биокатализаторов для решения широкого спектра практических задач. Все возрастающие потребности народного хозяйства в липолитических препаратах с высокой активностью и низкой себестоимостью делают наиболее перспективным их производство с помощью микробного синтеза. Преимущество такого способа заключается в том, что на доступных питательных средах за короткие сроки можно получить препараты с высокой активностью и разнообразными свойствами [31].
Как показывают исследования, липазы способны синтезировать многие микроорганизмы, выделяемые из самых различных источников — окаменевшых смол, почвы, водных бассейнов, плодов растений, пищевых продуктов [227, 271, 220]. Как правило, липолитические ферменты являются внеклеточными, что во многом упрощает технологию получения препаратов.
Можно выделить наиболее ценные для биотехнологии продуценты липаз. Это Rhizomncor miehei [158], Rhizopus niveus [185], Rh. oiyzae [129], Rh. arvhizus [256], Rh. delemar [256], Geotrichum candidum [208], Humicola lanuginosa [146], Penicillium roqueforti [202], P. camambertii [276], Candida rugosa [130, 131], C. antarctica [231].
Эти ферменты глубоко изучены, промышленностью выпускаются соответствующие препараты в растворимом и иммобилизованном виде: Novozyme 435 {Candida antarctica) [232], Amano Enzyme Ltd {Candida rugosa) [238],
II
Lipozyme IM 20 (Rhizomucor rniehei) [144]. Они используются преимущественно в масло-жировой промышленности.
Интерес к липазам из Geotrichum candidum [163], Penicillium roqueforti [202], P. camambertii [276], P. expansum [250], P. candidum [136, 237], P. cyclopium [137], P. simphlissimum [253], P. citrinum [188] связан с их уникальной способностью гидролизовать жир в молочных продуктах, отщепляя определенные жирные кислоты. Таким образом создается специфический вкус и аромат сыра, масла.
Активно синтезируют липазы дрожжи. Самыми известными в этом отношении являются Candida nigosa [130], С. antarctica [273], С. parapsilosis [133], щ Yarrowia lipolytica [190]. Изучена структура этих ферментов, субстратная спе-
цифичность [159, 209, 279]. Препараты липазы из С. antarctica широко используются для синтеза самых разнообразных эфиров [273].
Изучение липолитических ферментов бактерий диктуется разносторонними проблемами, с которыми сталкивается человек. У некоторых видов -Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermis [245], S. aureus [215, 246], S. simulam [240], Pseudomonas aeruginosa [234] липазная активность в сочетании с другими ферментами является фактором патогенности. Эти липазы изучаются с ? точки зрения биологической эволюции. Многие из них клонированы и экспрес-
сированы в клетках других бактерий, изучена их первичная и третичная структура. Но и в практической деятельности человека бактериальные липазы занимают далеко не последнее место. Хорошо известен продуцент липазы Chromatobacterium viscosum [251], выделенный из почвы. Важной особенностью этого фермента является способность гидролизовать липиды с высокой температурой плавления [257].
В последние годы появились работы, посвященные экстремальным видам микроорганизмов, липазы которых активны в щелочной зоне рН 9-10, при низ-ких (от минус 2 °С до +10 °С) и высоких температурах (50-60 °С). Это бактерии из родов Alcaligenes, Acinetobacter, Fusarium, Pseudomonas [222, 225, 254]. Из Bacillus stearothermophilus выделена липаза, проявляющая высокую активность
12
при 60-75 °С [183]. Обнаружен высокий уровень биосинтеза липазы психро-фильным грибом — Typhula ishikariensis с оптимумами температуры 15 °С и рН 8,0-9,0 [164]. Видом Monascus faluginosus образуется липаза с температурой действия 50 °С [197].
Такие липазы необходимы для переработки жирового сырья с высокой температурой плавления, для очистки сточных вод. Они дают возможность полной замены синтетических детергентов, создающих экологические проблемы.
Изучены липазы других продуцентов: грибов рода Fusarium [201, 225], бактерий Coiynebacterium [226], Acinetobacter [207], Bacillus [150], актиномице-тов Newospora [ 194], Streptomyces [116].
С целью повышения активности и целенаправленной специфичности ли-политических ферментов в настоящее время широко используют методы генной инженерии. Проведено клонирование и экспрессия генов липаз видов Rhizopus, Geotrichum candidum, Thermomyces lanuginosa в дрожжах Pichia pastoris, а липаз рода Staphilococcus — в бактериях Е. coli. Специфическая активность при этом возрастает в десятки раз [217, 241, 246].
Наряду с этим проводится поиск новых продуцентов. Например, появились сообщения о Mucor hiemalis f. hiemalis, выделенного из плодов пальмы [160], Trichosporumfermentans [139], Bacillus thermoleovorans [192].
Такая работа необходима в биотехнологии, так как любая отрасль применения липолитических ферментов имеет свои особенности, что требует широкого выбора препаратов.
13
1. 2. Характеристика свойств микробных липаз
1. 2. 1. Выделение и очистка препаратов липазы
Для глубокого изучения характеристик ферментных препаратов необходимо получать их в чистом виде. Степень чистоты диктуется объемами производства и назначением препарата, поэтому очистку проводят на 3-х различных уровнях: биотехнологическом, физико-химическом и тонком химическом [2].
Получение ферментных препаратов из глубинной культуры продуцента проводится на основе фильтратов культуральной жидкости. Сначала они стабилизируются солями и концентрируются вымораживанием, вакуум-выпариванием, диализом, ультрафильтрацией. Затем их осаждают органическими растворителями (ацетон, изопропанол, этанол) и нейтральными солями (чаще всего, сульфатом аммония) [24].
В промышленности для концентрирования ферментных растворов используется вакуумное выпаривание. Как показывает практика, при оптимальных условиях оно позволяет получить раствор фермента, содержащий не менее 90 % первоначальной активности [90]. Например, при вакуум-выпаривании нейтральной протеиназы Bacillus subtilis потери активности не превышали 10 %. Этого удалось достичь за счет поддержания температуры кипения ферментного раствора на уровне оптимальной (20-25 °С) [65].
Для ферментного раствора пектингидролазы Aspergillus alliaceus оптимальная температура выпаривания составила 30 °С, а повышение её до 40 °С увеличивало потери активности на 5 % [90].
В процессе вакуум-выпаривания происходит очистка ферментов от некоторых балластных веществ за счет выпадения их в осадок.
Однако большинство ферментов очень чувствительны к воздействию повышенных температур выпаривания и поэтому в настоящее время имеется тенденция к применению способов, исключающих тепловую денатурацию белков.
14
Широкое распространение получили методы мембранного разделения, в частности, обратный осмос, ультра- и микрофильтрация, тонкая фильтрация. Признанным считается метод ультрафильтрации. Ни одно современное производство ферментов не может обойтись без ультрафильтрационной установки. Данный метод технологичен и эффективен, позволяет получать ферментные концентраты при одновременном освобождении от балластных веществ (пигментов, азотистых и других низкомолекулярных соединений). Потери ферментативной активности минимальны, так как контакт фермента с агрессивными средами и денатурирующими агентами исключен. Преимуществами также является экономичность и дешевизна процесса, что обусловлено простотой установок и их малой энергоемкостью [115].
Известны исследования ультрафильтрации супернатантов культуральной жидкости липазы из Seiratia marcescens через полые волокна с пределом пропускания пор 15 кДа. Большая часть сопутствующих белков при этом поступала в фильтрат. При 10-кратном (по объему) концентрировании культуральной жидкости тестировалось около 70—75 % липазной активности с одновременной очисткой липазы в 4-5 раз [37].
Предварительно сконцентрированные и очищенные растворы ферментов высушивают сублимацией или распылением для получения технических препаратов. Традиционно применяемая в промышленности распылительная сушка при повышенных температурах теплоносителя приводит к потерям ферментативной активности до 10-15 %. Решение этой проблемы видится в применении вакуум- сублимационного метода высушивания, который позволяет избегать значительной инактивации ферментов и полностью сохранять их нативные свойства [115].
Однако чаще всего выделение ферментов проводят осаждением с использованием органических растворителей или высаливанием сульфатом аммония [24].
15
Высокоочищенные ферментные препараты получают в результате сочетания методов колоночной хроматографии, включая гелевую, ионообменную, гидрофобную или аффинную. При этом выбор способов фракционирования является индивидуальным для каждого фермента и определяется экспериментально.
Способы фракционирования белков основаны на различиях молекулярной массы, заряда, связующем сродстве к сорбентам. Эффективность процесса разделения определяется выбором сорбентов и их сочетанием. В настоящее время для разделения белков используются как уже ставшие традиционными гели (сефадексы), ионообменные смолы (DEAE-Cellulosa, CM-Cellulosa), гидрофобные (Sepharosa, Sephacryl), так и новые полимеры.
Для каждого фермента разрабатывается уникальная схема очистки.
На первых этапах получения высокоочищенных ферментных препаратов липаз обычно используют ультрафильтрацию (иногда в два этапа), фракционирование сульфатом аммония, осаждение органическими растворителями. Липазы из Penicillium roqueforti осаждали этанолом [202], из Pseudomonas pseudoalcaligenes — ацетоном [195].
Схемы очистки микробных липаз отличаются последовательностью стадий, способами элюции. При получении высокоочищенных препаратов липаз Yarrowia, Penicillium, Fusarium сначала использовали ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl 650M, CM-Toyopearl 650M; а затем - гидрофобную на Phenil-Toyopearl 650M, Butyl-Toyopearl 650M [137, 190]. Липаза из Fusarium sp. YM-30 была очищена в 2770 раз с выходом 37 % [201].
Липазы из Bacillus thermoleovorans [192] и Pseudomonas fluorescens [254] очищены ионообменной хроматографией па первой ступени и фильтрацией через Sephacryl S-200 и Octyl-Sepharosa CL-4B - на второй. Степень очистки составила 223 и 3390 раз соответственно.
Для липаз из Pseudomonas pseudoalcaligenes [195] и Mucor hiemalis [160] использовалась только фильтрация через различные носители. Первая липаза была очищена до гомогенного состояния с помощью Sephadex G-100 и Fractegel
16
phenil 650M. Очистка липазы Mucor hiemalis проводилась в 3 этапа. После гельфильтрации через Sephadex G-75 была достигнута очень высокая степень очистки - 55 раз, а дальнейшая фильтрация через Q-Sepharose и Sephacril S-200 позволила получить фермент с очисткой в 2200 раз и выходом 18,1 % [160].
Коммерческий препарат липазы Rhizomucor miehei был очищен до гомогенного сотояния с помощью Phenil-Sepharose 6 Fast Flow и DEAE-Sepharose Fast Flow с кратностью 42 и выходом 32 % [264].
Различные изоформы липаз А и В вида Rhizomucor miehei получены двумя различными способами. Форма А выделена сочетанием ионообменной хроматографии на DEAE-Cellulose 52 элюцией в градиенте рН 7,0-3,5; аффинной хроматографией на ConA-Sepharose и гидрофобной хроматографией на TSK-Phenil-5W. Для выделения формы В использованы ионообменная (DEAE-Sepharose) и гидрофобная (Phenil-Sepharose) хроматография и гель-фильтрация через TSKG 3000 SW [274].
Липазы Rhizopus niveus фракционировали с помощью различных ионообмен-ников. На DEAE-Toypearl они не сорбировались, и гомогенности также не достигалось. Разделения двух форм I и II удалось добиться хроматографией на СМ-Toypearl в 2 стадии: элюцией различными концентрациями NaCl (0,15 М и 0,27 М) и далее в градиенте рН 6,0-7,0 для липазы I и 0-0,3 М NaCl для липазы II. Форма I липазы была очищена в 54,4 раза с выходом 31,1 %; форма II -67,9 и 3,1 % соответственно [185].
Некоторые трудности возникают при очистке липаз, имеющих гидрофобный характер молекулы. Например, при получении высокоочищенпой липазы из Penicillium candidum [237] с помощью Octyl-Sepharose CL-4B и DEAE-Sepharose А-50 в элюирующий раствор необходимо было добавить детергент. В результате получен гомогенный препарат со степенью очистки 36,7 %, с выходом 0,1 %.
В заключение можно отметить, что для каждого продуцента фермента необходимы исследования по выделению его в высокоочищенном или гомогенном состоянии с сохранением нативных свойств.
17
1. 2. 2. Физико-химические свойства и особенности строения нативных липаз
Индивидуальные характеристики липаз во многом зависят от особенностей продуцента. Физико-химические свойства липаз могут значительно варьировать даже у микроорганизмов одного рода, что связано с видовыми, а иногда и штаммовыми различиями.
Основные физико-химические показатели наиболее изученных микробных липаз проведены в табл. 1.1. Большинство из них имеют рН-оптимум в слабокислой, нейтральной или слабощелочной зонах; температуру действия — в пределах 32-45 °С. Некоторые обладают устойчивостью к щелочным значениям рН 9-12 [124, 227] и стабильностью к высоким температурам [124, 192]. Небольшая группа ферментов проявляет активность при низких температурах от 2 до 15 °С [164, 222, 279]. Это явление необычное, но объяснимое, так как реакции могут протекать с большой скоростью благодаря различным фазовым переходам в твердое состояние участвующих в реакции компонентов [24].
Молекулярная масса многих липаз микробного происхождения колеблется в интервале 25-72 кДа, хотя встречаются и высокомолекулярные - 120-160 кДа, что является результатом ассоциации низкомолекулярных форм белковых молекул [168, 180, 196, 254]. Удельная активность липаз может составлять сотни и десятки тысяч (см. табл. 1.1).
Значения pi свидетельствуют, что они могут быть как кислыми, так и нейтральными белками. Многие липазы активируются ионами Са2+, Mg2+, Ba2+, и ингибируются ЭДТА, но общим правилом это не является. Соли желчных кислот могут также выступить как активаторами, так иингибиторами. В отличие от многих липаз Rhizomucor miehei активируется органическим растворителями, что необходимо в процессах синтеза.
|
