СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДК — дисбактериоз кишечника ЖКТ — желудочно-кишечный тракт КОЕ — колониеобразующих единиц KP — колонизационная резистентность НМК — нарушения микробиоценоза кишечника ОМФ — облигатная микрофлора ОКИ — острые кишечные инфекции ТК — толстая кишка
УПМ — условно-патогенные микроорганизмы УПЭ — условно-патогенные энтеробактерии ГОБ — грамотрицательные бактерии БАД — биологически активные добавки ФОС — фруктоолигосахариды
Введение
В настоящее время проблемы микробной экологии человека в норме и различных патологических состояниях, а также при воздействии на организм профессиональных и экологических факторов занимают важное место в решении многих задач биологии и медицины. При этом основное внимание исследователей сосредоточено на разработке методов и средств диагностики, коррекции и профилактики нарушений различных микробиоценозов (Isolauri, 2001; Захаренко, 2001; Черешнев с соавт., 2001; Бондаренко с соавт., 2003 Воробьёв с соавт., 20046). Показано, что под воздействием различных неблагоприятных факторов формируются стойкие дисбиотические нарушения, способные приводить к снижению иммунологической реактивности с последующим развитием воспалительных заболеваний (Баранов с соавт., 2000; Леванова с соавт., 2001 в). Особое значение подобные нарушения имеют для новорожденных и детей раннего возраста, так как именно у них наиболее часто развиваются различные патологические состояния (Блохина, Дорофейчук, 1979; Яцык, Захарова, 1997; Николаева, 2000; Бондаренко, 2005; Урсова, 2005).
В настоящее время для коррекции дисбиотических нарушений применяют пробиотики - препараты, содержащие облигатную микрофлору (ОМФ) или культуры грибов, спорообразующих бактерий, обладающих антагонистической активностью - а также различные антибактериальные препараты, например, нитрофураны (Барановский, Кондрашина, 2000; Камилова с соавт., 2001; Бондаренко с соавт., 2003; Лобзин с соавт., 2003).
Традиционно пробиотики применяют для подавления патогенной, условно-патогенной и восстановления нормальной микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях (ОКИ) и дисбактериозах (Sullivan et al., 2003; Бондаренко, Воробьёв, 2004; Macintyre, Cymet, 2005). Но, как показали исследования последних лет, их клиническая эффективность также обусловлена наличием иммуномодулирующих свойств, а также вовлечением в обменные процессы (Urau et al., 1999; Miraglia del Guidice et al., 2002;
7
Мазанкова, Лыкова, 2004; Парфёнов, 2004; Ткаченко, 2004). Следует отметить, что целесообразность их применения при кишечных инфекциях остаётся спорной (Брудастов с соавт., 1996; Vaughan, Mollet, 1999; Циммерман, 2000; Lebenthal E., Lebenthal Y., 2003), так как известны примеры неудачных попыток коррекции дисбиотических состояний различными бактерийными препаратами (Воробьёв с соавт., 1997; Долгушин с соавт., 1998; Щербаков с соавт., 1998; Ардатская с соавт., 2001; Воеводин с соавт., 2001; Захаренко, 2001; Бухарин с соавт., 2003; Семёнова, 2003). Кроме того, имеются данные о потенциальной опасности бифидо-, лакто- и колисодержащих пробиотиков и препаратов из непатогенных представителей рода Bacillus (Мухина, 1999; Коршунов с соавт., 2000; Попова с соавт, 2001; Осипова с соавт, 2002; Корниенко, 2005).
В доступной литературе отсутствуют данные о масштабных рандомизированных исследованиях, позволяющих достоверно оценить эффективность различных препаратов и схем терапии кишечного дисбактериоза у детей (Cucchiara et al., 2002; Nielsen et al., 2002; Young, Huffman, 2003; Самсыгина, 2003; Meier, Steuerwald, 2005; Szajewska, Mrukowicz, 20056).
Известно, что степень и длительность дисбиотических нарушений связана с биологическими свойствами условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), выступающих в роли этиологического фактора (Леванова с соавт., 2002а; Тюрин, 2003). Дисбактериозы кишечника (ДК), обусловленные ассоциациями УПМ, вызывают более тяжёлые дисфункции кишечника и чаще является причиной бактериемии и сепсиса (Красноголовец, 1989; Коршунов, 1989; Николаева, 2000). Поэтому главным компонентом их коррекции чаще является селективная деконтаминация нитрофуранами и пробиотиками (Захаренко, 2001; Камилова с соавт., 2001).
Мало изучена проблема неслучайных ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов и их элиминации у детей разных возрастных групп с ДК. Недостаточно сведений о сравнительной эффективности препаратов в
8
отношении отдельных УПМ и их ассоциаций, а также отдельных представителей облигатной микрофлоры. Невелик объём информации о появлении УПМ в диагностически значимых количествах как побочного эффекта коррекции ДК у детей. Выяснение поставленных вопросов, на наш взгляд, позволит разработать эффективные схемы коррекции ДК у детей раннего возраста.
Цель исследования.
Определение сравнительной эффективности пробиотиков и нитрофуранов в коррекции дисбактериозов кишечника у детей раннего возраста.
Задачи исследования;
1. Изучить характер изменений в составе микробиоценоза кишечника у детей разных возрастных групп с ДК.
2. Определить эффективность корригирующего действия пробиотиков (самоэлиминирующихся антагонистов) и нитрофуранов на микробиоценоз кишечника у детей разных возрастных групп с ДК.
3. Определить эффективность корригирующего влияния препаратов, содержащих облигатную микрофлору, на микробиоценоз кишечника у детей разных возрастных групп с ДК.
Научная новизна.
Впервые определена неслучайная склонность к совместному существованию УПМ в одном биоценозе толстого кишечника (ТК), исходя из этого, выявлены конкретные ассоциации у детей первого года жизни и в возрасте от 1 до 3 лет. Наиболее часто у детей раннего возраста обнаруживали ассоциацию гемолитической Escherichia coli и Staphylococcus aureus .
Впервые проведена сравнительная оценка влияния препаратов пробиотиков - самоэлиминирующихся антагонистов («Бактисубтил» и
9
«Энтерол») и нитрофуранов («Фуразолидон» и «Эрсефурил») на ассоциации микроорганизмов при ДК. Показано, что нитрофураны достоверно чаще, чем пробиотики нарушали ассоциацию S. aureus и бактерий рода Proteus с полной элиминацией одного из ассоциантов у детей первого года жизни.
Впервые выявлено, что пробиотик «Энтерол» более активно, по сравнению с «Бактисубтилом», снижает содержание S. aureus в кишечнике детей первого года жизни при коррекции ДК.
Впервые установлено, что препарат «Фуразолидон» более эффективен в элиминации бактерий рода Klebsieila, по сравнению с препаратом «Эрсефурил», у детей первого года жизни при коррекции ДК.
Впервые показано, что в процессе коррекции нарушений микробиоценоза кишечника (НМК) у детей наряду с вытеснением УПМ, обусловливающих ДК, проявлялся достоверный эффект появления других УПМ в диагностически значимых разведениях.
Практическая значимость работы.
Результаты проведённых исследований позволяют оптимизировать схемы коррекции микробиоценозов кишечника у детей с дисбактериозами.
Исследования микробных сообществ кишечника у детей с дисбактериозами выявили высокую частоту встречаемости УПМ и их ассоциаций у детей раннего возраста, что обосновывает применение пробиотиков — самоэлиминирующихся антагонистов и нитофуранов.
Результаты сравнительной оценки эффективности пробиотиков -самоэлиминирующихся антагонистов и нитрофуранов в элиминации ассоциаций УПМ и их диссоциации обосновывают предпочтительное применение нитрофуранов при коррекции ассоциативных ДК у детей раннего возраста.
Высокая частота дефицита бифидобактерий и молочно-кислых стрептококков при ДК у детей раннего возраста, обосновывает применение препаратов, содержащих ОМФ.
10
Сравнительная оценка эффективности различных препаратов, содержащих ОМФ, показала, что в коррекции ДК у детей раннего возраста предпочтительно примененять синбиотики и поликомпонентные пробиотики, содержащие бифидо- и лактобактерии.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на 7-й научно-практической конференции молодых учёных КГМУ (Казань, 2002), Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры детских инфекционных болезней КГМУ, «Микроэкология матери и ребенка, принципы диагностики и лечения» (Казань, 2002), 10-й, 12-й, 13-й научно-практических конференциях Поволжского региона «Окружающая среда и здоровье населения» (Казань, 2002, 2004, 2005), научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), научно-практической конференции молодых учёных КГМА, посвященной 85-летию основания КГМА (Казань, 2005).
Положения, выносимые на защиту:
• Нарушения в микробиоценозе кишечника у детей раннего возраста в большинстве случаев обусловлены одновременным снижением количества ОМФ и наличием УПМ и их ассоциаций. Наиболее часто в неслучайных ассоциациях с другими УПМ обнаруживаются S.aureus, гемолитическая E.coli, бактерии родов Klebsieila и Proteus.
• Пробиотки — самоэлиминирующиеся антагонисты («Бактисубтил» и «Энтерол») эффективно вытесняют УПМ из микробиоценоза кишечника, однако «Энтерол» активнее элиминирует S.aureus.
• Нитрофураны («Фуразолидон» и «Эрсефурил»), обладающие сходным спектром действия, имеют некоторые особенности. «Фуразолидон» достоверно лучше, чем «Эрсефурил» снижает содержание бактерий рода Klebsieila в микробиоценозе кишечника у детей раннего возраста.
11
• Нитрофураны обладают более широким спектром антагонистической активности в отношении УПМ, чем пробиотики. Однако нитрофураны достоверно способствуют появлению новых УПМ, ранее не выявлявшихся в составе микрофлоры кишечника.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них - 8 статей (2 в центральной печати).
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Микрофлора желудочно-кишечного тракта человека в норме и
патологии
1.1.1. Состав, роль и становление нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей
С современных позиций нормальная микрофлора рассматривается как качественное и количественное соотношение популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающих биохимическое, метаболическое и иммунное равновесие организма хозяина, необходимое для сохранения здоровья человека (Бондаренко с соавт., 2003; Бондаренко, Воробьёв, 2004). Микрофлора человека составляет основу его микроэкологии и включает более 500 видов бактерий, а так же вирусы, простейшие, грибы. Наиболее сложный по составу микробиоценоз — это микрофлора толстой кишки (ТК). Вся микрофлора кишечника подразделяется на облигатную (более 90% всех микробов), факультативную (около 10% от общего числа микробов) и транзиторную (менее 1% от общего числа микроорганизмов) (Бондаренко с соавт., 2003). Нормальная микрофлора выполняет ряд важных функций: обеспечение колонизационной резистентности, детоксикационная, синтетическая, пищеварительная (Бондаренко, Воробьёв, 2004). Колонизационная резистентность (KP) - совокупность механизмов, придающих индивидуальную и анатомическую стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения хозяина посторонними микроорганизмами (Шендеров, 1987; Покровский с соавт., 1994).
Человек и животные рождаются стерильными. Однако уже с первых мгновений появления на свет их кожа и слизистые обсеменяются микроорганизмами, число и разнообразие которых определяется здоровьем матери, механизмами родов, санитарным состоянием среды, в которой они
13
происходили, а затем и типом вскармливания (Козлова с соавт., 1977; Шендеров, 1998а; Dai, Walker, 1999; Постникова с соавт., 20046) и диеты (Коршунов с соавт, 20016), гестационным возрастом новорожденного и характером сопутствующей перинатальной патологии (Акоев с соавт., 2000). В течение 2-4 дней происходит начальное микробное заселение в зависимости от внешних экологических факторов, характера питания и времени прикладывания к груди. В фекалиях новорожденных обнаруживаются бактерии из родовых путей, кожи и кишечника матери: лактобактерии, эшерихии, стрептококки, энтерококки, стафилококки и др. (Шендеров, 1998а; Нисевич с соавт., 1999; Дубровская с соавт., 2003; Корниенко, 2005). В период стабилизации микробной флоры (до 1 месяца) преобладают бифидобактерии, бактероиды, появляются эшерихии и лактобациллы. Симбиоз бифидобактерии и лактобактерии имеет важное значение для формирования нормального микробиоценоза у ребенка (Трачук, Шраер, 1990; Самсыгина, 2003). Инфицирование новорожденных из окружающей среды в период формирования микрофлоры носит вторичный характер (Шендеров, 1998а). У здоровых детей первого года жизни преобладают неспороносные анаэробы (бифидобактерии, эубактерии, пептококки), а доминирующими микроорганизмами в толстой кишке являются бифидобактерии. Уже в этом периоде микрофлора содержит практически все зачатки будущего микробиоценоза (Козлова, 1978; Гончарова, 1982; Маянский, 1999; Постникова с соавт., 20046). У здоровых детей на протяжении первого года жизни «идеальный», т.е нормальный, биоценоз кишечника встречается редко, у половины здоровых грудных детей встречается ДК первой-второй степени и у 1/5-1/4 детей — третьей-четвертой степени (Самсыгина, 2003).
Точных данных о том, в каком возрасте микрофлора здорового ребенка по своему качественному и количественному составу начинает соответствовать таковой взрослых людей до настоящего времени нет. В литературе существуют противоречивые сведения о сроках становления
14
микрофлоры. По данным Т.Ю. Трачук и О.Т. Шраер (1990) окончательное становление бифидо- и лактофлоры у здоровых детей происходит к концу первого месяца жизни. Л.А. Леванова с соавт. (2001 в) считают, что формирование бифидофлоры, появление типичных эшерихий у детей происходит к шестому месяцу жизни, а становление лактофлоры, в отличие от бифидофлоры, происходит медленнее, и даже к концу первого года жизни у 10% детей лактобактерии не обнаруживаются. В ряде работ указывается, что к 12 месяцам у большей части детей состав и количество анаэробных микроорганизмов в ТК приближается к таковому у взрослых (Stark, Lee, 1982; Orrhage, Nord, 1999; Mackie et al., 1999). B.M. Коршунов с соавт. (2001a) приводят сведения, что процесс становления нормальной микрофлоры кишечника у новорожденных при грудном вскармливании завершается к 20-30-му дням жизни, в последующем на шестом-седьмом месяце жизни при введении в рацион продуктов питания животного и растительного происхождения происходит определенная перестройка параметров микрофлоры кишечника, и в возрасте полтора года она становится идентичной микрофлоре родителей. По мнению Б.А. Шендерова (1998а) даже в возрасте двух лет микрофлора детей по своей физиолого-биохимической активности еще заметно отличается от таковой взрослых. Выявлены отличия в скорости становления нормальной микрофлоры у детей, получающих грудное и исскуственное вскармливание. Более высокая степень колонизации бифидобактериями и лактобактериями, энтерококками и более низкая степень колонизации кишечной палочкой, бактероидами, различными УПМ, наблюдаемые у здоровых новорожденных при грудном вскармливании, становятся статистически значимыми к концу первой недели жизни и сохраняются в течение всего периода естественного вскармливания (Дэвис, Готерфос, 1987; Соколова с соавт., 1991; Vollard, Clasner, 1994; Rinne et al., 2005).
В последние годы отмечаются существенные сдвиги в формировании кишечной микроэкологии у новорожденных — позднее
15
становление бифидофлоры и частая патологическая контаминация S.aureus, грамотрицательными бактериями (ГОБ) (Бочков с соавт., 1991; Леванова с соавт., 2001 в). У детей первого года в значительных количествах присутствуют сульфатредуцирующие клостридии, условно-патогенные энтеробактерии (УПЭ), особенно рода Klebsieila и Proteus, Е. coli с изменёнными биологическими свойствами, S.aureus, дрожжеподобные грибы рода Candida (Нисевич с соавт., 1999; Леванова с соавт., 20016; Постникова с соавт., 20046). Значительные изменения в составе микрофлоры наблюдалисьу детей в первые шесть месяцев жизни, причём у мальчиков нарушения проявлялись значительнее, чем у девочек (Леванова Л.А. с соавт., 20016). Заселение ТК у детей раннего возраста различными микроорганизмами происходило не только монокультурами, но и ассоциациями из двух-трёх представителей УПМ, наиболее часто выделялись S.aureus — Klebsiella spp., S.aureus — Proteus spp., S.aureus — другие УПЭ (чаще Citrobacter, Enterobacter), Proteus spp. -Klebsiella spp., a также Proteus spp. совместно с Klebsiella spp. и S.aureus, что связано с замедленным формированием бифидо- и лактофлоры у новорожденных детей, а следовательно и с формированием иммунобиологического статуса ребёнка (Леванова с соавт., 2001 в). К концу первого года жизни происходит частичная или полная элиминация УПМ (Нисевич с соавт., 1999; Постникова с соавт., 20046), стабилизации количества бифидобактерий на нормальном уровне 10—10 КОЕ/1г испражнений. У детей в возрасте старше одного года возрастает численность бактероидов до 108 и несколько уменьшается содержание лактобактерии до 106 (Нисевич с соавт., 1999). У детей младше трёх лет состав кишечной флоры заметно колеблется. Различные факторы, такие как прорезывание зубов, острые респираторные заболевания, переход на новый рацион, проживание в экологически неблагополучном регионе могут вызвать изменение состава кишечной микрофлоры, самостоятельно исчезающие при устранении причины, их вызвавшей (например, коррекция питания ребенка и др.)
16
(Нисевич с соавт., 1999; Гриценко, Бухарин, 2000; Леванова с соавт., 20026; Лобзин с соавт., 2002; Guarner, 2002).
1.1.2. Микробиологические аспекты дисбактериоза
ДК - это клинико-лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, который характеризуется изменением качественного и/или количественного состава нормофлоры определенного биотопа, а также транслокацией различных её представителей в несвойственные биотопы с последующими метаболическими и иммунными нарушениями часто с развитием желудочно-кишечных расстройств (Бондаренко, Воробьёв, 2004).
ДК не рассматривается как нозологическая единица в Международной классификации болезней (МКБ-10), так как с современной точки зрения любой дисбактериоз считается не самостоятельным заболеванием, а проявлением множества патологических состояний, при которых нарушается видовой состав микрофлоры в том или ином биотопе человеческого организма (Василенко, 2000; Урсова с соавт., 2005). В зарубежной гастроэнтерологии термин «дисбактериоз кишечника» не используется, в англоязычной литературе можно встретить «синдром избыточного роста кишечной микрофлоры» (Bacterial Overgrowth Syndrome), в немецкой -«ошибочное заселение бактерий» (bakterielle Fehlbesiedlung). Основное отличие этих понятий от принятого в отечественной литературе термина «дисбактериоз» состоит в том, что в них речь идет только об изменении состава микрофлоры тонкой кишки, тогда как «дисбактериоз» указывает на нарушения состава бактериальной флоры (как качественного, так и количественного) в ТК (Шептулин, 1999; Циммерман 2000).
При превышении некоторой пороговой величины отрицательно воздействующих на организм токсических факторов микробиоценозы выходят из состояния равновесия, что вызывает микроэкологические и иммунные
17
нарушения. Это приводит к доминированию в микробиоценозе УПМ, усилению генетического обмена и возможному формированию клонов, несущих гены лекарственной устойчивости и генетические детерминанты «островов» патогенности, ассоциированные с адгезивными, цитотоксическими и энтеротоксическими свойствами бактерий (Бондаренко, Воробьёв, 2004).
УПМ являются микроорганизмы, которые могут выступать в качестве этиологических факторов заболеваний, характеризующихся отсутствием нозологической специфичности в случае снижения антиинфекционной резистентности макроорганизма (Барановский, Кондрашина, 2000; Савицкая с соавт., 2002). У микроорганизмов стабильно определяется широкий спектр персистентных признаков - антикомплементарная, антилизоцимная, антииммуноглобулиновая, антиинтерфероновая активность, что обусловлено, видимо, секрецией факторов, инактивирующих защитные системы организма человека. Наибольшая распространенность этих свойств, т.е наиболее высокая потенция к колонизации, выявлена у бактрий родов Klebsieila spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., играющих заметную этиологическую роль в возникновении дисбиотических состояний (Николаева, 2000; Леванова с соавт., 2001а; Закиров, Сорокин, 2002; Лобзин с соавт., 2003). Среди изучаемых факторов патогенности, определяющих вирулентность УПМ, протеолитическим ферментам принадлежит основная роль в процессах колонизации и инвазии (Senior et al., 1987; Kerr et al., 1995; Wassif et al., 1995; Qin et al., 2000; Арутюнян с соавт., 2001). Обнаружена корреляционная связь между частотой экспрессии энтеробактериями факторов персистенции и глубиной НМК (Валышев с соавт., 1996). Манифестные формы дисбактериоза кишечника у детей (субкомпенсированная и декомпенсированная) в основном связаны с активацией УПМ и проявляются клиникой оппортунистических инфекций различных органов и систем: энтероколитами, колитами, бактериемией, пневмонией, сепсисом (Гончарова с соавт., 1989; Дорофейчук с соавт., 1991). Как правило, Klebsieila spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia marcescens, Pseudomonas spp. вызывают |
