5 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. В настоящее время ДНК и ее низкомолекулярные производные являются перспективными лекарственными средствами и биологически активными пищевыми добавками (БАД). Для получения препаратов ДНК используют различные сырьевые источники: бактериальные
* клетки, эритроциты цыплят, тимус телят, селезенка и печень мышей и крыс,
молоки сельди, карпа, осетровых и других видов рыб (Пашук и др., 1995). Препараты ДНК из молок лососевых и осетровых обладают наиболее эффективным фармакологическим действием (Патент РФ № 915446; Каплина, 2000).
а Анализируя известные литературные данные, можно сделать
заключение о том, что область применения ДНК зависит от ее молекулярной массы. Например, ДНК со сравнительно низкой молекулярной массой применяется в кардиологии при лечении ишемической болезни сердца (Патент РФ № 95103961), в онкологии при профилактике и лечении рака (А.С. 1804852 SU), для профилактики инфекционных заболеваний (Патент РФ № 2063228). Олигонуклеотиды, нуклеозиды и производные тимидина могут использоваться при лечении ВИЧ-инфекции (Хаитов, Игнатьева, 1992).
Основным источником получения БАД на основе ДНК являются молоки лососевых и осетровых. Известно несколько способов получения ДНК, которые основаны на солевой экстракции молок и последующем спиртовом осаждении. Однако ДНК, получаемая таким способом и используемая в
6
качестве БАД, характеризуется высокой молекулярной массой и слабой растворимостью в воде, что ограничивает сферу ее применения.
Актуальность проблемы, поставленной в данной работе, определяется необходимостью создания биодоступных препаратов ДНК из распространенных видов сырья. Использование для этой цели ферментативного гидролиза позволит регулировать не только физико-химические свойства (растворимость и вязкость, молекулярный состав) (Mahmoud, 1994), но и, возможно, биологическую активность получаемых БАД.
При ферментативном воздействии на ткань гонад гидробионтов важны определение активности и специфичности ферментов, участвующих в гидролизе нуклеопротеидов (экзогенных, входящих в состав комплексных ферментных препаратов, и эндогенных, содержащихся в молоках).
Известно, что в панкреатической ткани большинства видов животных, в том числе ракообразных, имеется широкий набор ДНКаз (Вакорина и др., 1997). Наиболее полно изученным и широко используемым ферментом этой группы является ДНКаза I (КФ 3.1.4.5), выделенная из панкреаса быка. Основной ее функцией является деградация ДНК. Имеется ряд работ по исследованию ДНКаз, выделенных из гепатопанкреаса краба (Вакорина и др., 1997; Мензорова и др., 1993; Мензорова и др., 1994), криля (Chou and Liao, 1990). ДНКазы панкреатических органов рыб являются мало изученными (Rasskazov et al., 1975).
7 В гонадах гидробионтов обнаружен ряд гидролитических ферментов,
выполняющих различные функции клеточного метаболизма. Например, из молок чавычи (Yamomoto, 1971), скумбрии (Cordonnier and Bernardi, 1968), кеты, минтая (Галкин и др., 1991) выделены кислые ДНКазы, различающиеся между собой по свойствам. Спермин морского ежа S. Intermedius содержат три разные ДНКазы: кислую и две щелочные металлозависимые (Сибирцев и др., 2001). Как полагают многие исследователи, роль этих ферментов -участие в апоптозе - программируемой клеточной гибели. Однако сведений о протеолитических ферментах а также ДНКазах особенно щелочных, содержащихся в гонадах рыб, моллюсков, иглокожих в литературе недостаточно для выявления механизма их действия и роли в процессах деградации ДНК.
Сравнительное изучение ферментов эндогенного и экзогенного происхождения необходимо для обоснования технологии получения препаратов ДНК из данного вида сырья, определения взаимосвязи между свойствами ферментов, составом нуклеиновых кислот и биологической активностью получаемых препаратов.
Цель исследований заключалась в разработке технологии БАД из гонад гидробионтов на основе воздействия ферментов эндогенного и экзогенного происхождения, а также в исследовании состава, свойств и биологической активности полученных БАД.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:
- провести скрининг объектов по содержанию ДНК, активности эндогенных протеаз и нуклеаз в гонадах гидробионтов;
- осуществить подбор рациональных параметров ферментативного гидролиза нуклеопротеидов гонад рыб и беспозвоночных;
- исследовать состав и физико-химические свойства препаратов, полученных в результате ферментативного гидролиза из гонад различных видов гидробионтов;
- разработать способ получения БАД из гонад гидробионтов;
- разработать НД на БАД из гонад гидробионтов;
- провести оценку безопасности, исследовать биологическую активность, провести клинические испытания полученных препаратов.
Научная новизна: Разработана и научно обоснована технология получения БАД из гонад гидробионтов.
Впервые проведено сравнительное исследование протео- и нуклеолитических ферментов в мужских гонадах 13 видов гидробионтов.
Проведены сравнительные кинетические исследования микробиальных, а также содержащихся в панкреатической ткани рыб, крабов ДНКаз.
Исследован состав нуклеиновых компонентов препаратов из гонад гидробионтов, полученных разными способами: ферментативным («Нуклеатин» и низкомолекулярная ДНК) и методом спиртового осаждения
(нуклеопротеидный комплекс).
Показано, что эндогенные ферменты являются инициаторами ферментативной деструкции нуклеиновых кислот, влияющими на конечный состав препаратов. Установлено, что при отсутствии или следовой активности ферментов эндогенного происхождения степень гидролиза нуклеопротеидов с участием экзогенных ферментов низка.
Практическая значимость. Разработан эффективный способ получения БАД, в основу которого положен ферментативный гидролиз гонад гидробионтов и фракционирование олигонуклеотидов с помощью ультрафильтрации.
Способ получения ферментативного гидролизата из молок рыб защищен патентом №2171066 от 22.03.2000: «Продукт, обогащенный аминокислотами и способ его получения».
По результатам экспертной оценки и санитарно-химических исследований в федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Нуклеатин» соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01, МУК 2.3.2.- 21-98 и зарегистрирован как БАД (Per. удостоверение № 77.99.02.928.Б.000258.08.03).
Разработана и утверждена нормативная документация на БАД «Нуклеатин» ТУ № 9283-026-00038155-02 , ТИ№ 36-215-02.
Выпущена опытно-промышленная партия «Нуклеатина».
Проведены медико-биологические испытания «Нуклеатина» и показано,
10 что он может быть использован в качестве БАД в кардиологии,
офтальмологии, при лечении острых вирусных заболеваний, а также в качестве радиопротекторного средства.
Апробация работы: основные положения были представлены и доложены на научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Дальнего Востока. Новые медицинские технологии с использованием биоресурсов» (Владивосток, 1999); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2000); межрегиональной научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика. Проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000); Международной научно-практической конференции «Прибрежное рыболовство - XXI век» (г. Южно-Сахалинск, 2001); Всероссийской конференции молодых ученых «Рыбохозяйственная наука на пути в XXI век» (Владивосток, 2001); Международной конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Москва, Голицино, 2002), Всероссийской конференции молодых ученых (Мурманск, 2002). Положения, выносимые на защиту:
сравнительная характеристика субстратной специфичности ферментов панкреатических органов лососевых рыб, млекопитающих, беспозвоночных, а также микроорганизмов;
11
влияние эндогенных ферментов (протеаз и нуклеаз) гонад гидробионтов, являющихся инициаторами гидролиза нуклеопротеидов, на молекулярный состав олигонуклеотидов; способ получения олигонуклеотидов из гонад гидробионтов включающий ферментативный гидролиз и разделение компонентов по молекулярным массам;
состав препаратов, получаемых методом ферментативного гидролиза из гонад гидробионтов, характеристика биологической активности.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 18 работ. Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор
литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список
литературы, содержащий 100 источников (в том числе 41 зарубежный).
Работа изложена на 160 страницах, содержит 11 таблиц, 15 рисунков и 8
приложений.
Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность
научному руководителю Т.Н. Пивненко, оффициальным оппонентам Л.В.
Шульгиной, Э.Н. Киму, а также всем коллегам, оказавшим помощь в
подготовке диссертационной работы.
12 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Характеристика состава и свойств нуклеопротеидов, входящих в
состав гонад гидробионтов Нуклеиновые кислоты
ДНК представляет собой полимер, мономерными единицами которого являются дезоксирибонуклеозидмонофосфаты. В большинстве случаев ДНК имеет высокую молекулярную массу в пределах 106 - 109 Да и даже выше. В природе ДНК находится в клеточном ядре в виде дезоксирибонуклеопротеида. Для ее выделения необходимо сначала экстрагировать дезоксирибонуклеопротеид и затем отделить ДНК от связанного с ней белка. Выбор того или иного метода в каждом конкретном случае определяется природой использованного биологического материала. Как уже было сказано выше, наиболее перспективным источником получения нуклеиновых кислот являются молоки рыб (Пашук, 1995).
Технология выделения высокомолекулярной ДНК многостадийна, трудоемка и требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Исследования показали, что для получения биологически активного продукта пригодна и низкомолекулярная ДНК (молекулярная масса 2 х 105 - 5 х 105 Да). Она значительно дешевле и доступнее из-за упрощенного технологического процесса выделения (Патент РФ № 915446), разрешена к применению в качестве биологически активной пищевой добавки для профилактики ряда заболеваний и для повышения умственной и физической работоспособности.
13 Данный препарат получают из молок лососевых рыб. Способ получения
включает две стадии - экстракцию водным раствором NaCl и осаждение в этиловом спирте. Содержание нуклеиновых кислот в препарате при этом достигает 70 - 80 %, молекулярная масса ДНК - 270 - 500 кДа.
В препаратах ДНК из молок различных видов рыб, полученных
¦ указанным способом, проводилось исследование зависимости растворимости
от рН и температуры (Касьяненко и др., 1999). Показано, что при рН 6,5 и 7,0 даже через 16 и 18 мин соответственно суспензия ДНК в воде из молок лосося и сельди остается устойчивой и только при рН 8,0 - 8,5 достигается полная прозрачность. В то же время ДНК минтая при заданном диапазоне рН (5,5 -
^ 9,0) не растворяется даже в течение часа. Те же тенденции распространяются
и на зависимость растворимости препаратов от температуры. При нагревании растворов до 60 °С при рН 8,0 препарат ДНК лосося полностью растворяется в течение 2 мин, сельди - в течение 4,5 мин. ДНК минтая даже при нагревании в течение 80 мин остается нерастворимой.
Другой способ получения натриевой соли ДНК («Деринат») (Патент РФ
ф № 2005724) включает гомогенизацию ткани молок осетровых рыб в водном
растворе хлорида натрия и цитрата натрия, промывание материала, смешивание с детергентом, отделение и обогащение жидкой фракции, отмывание в пермеате, выделение очищенного биологически активного материала и деполимеризацию ультразвуком. Препарат содержит не менее 80 % натриевой соли ДНК с молекулярной массой 270 - 500 к Да. Молекула
14 «Дерината» ДНК-Na - состоит из двух полинуклеотидных цепей, которые
образуют двойную спираль. Направление цепочек взаимно противоположное. Сахарофосфатный остов располагается по периферии двойной спирали, а азотистые основания находятся внутри, и их плоскости перпендикулярны оси спирали (Каплина, 2000).
Существует еще один способ получения натриевой соли ДНК (Патент РФ № 2072855) из молок рыб. Он отличается от вышеописанных тем, что после гомогенизации молок в водном растворе хлорида натрия производят удаление белков из комплекса ДНК с помощью обработки протеолитическим ферментным препаратом с последующим выделением чистой натриевой соли ДНК на колонке с анионитом.
Таким образом, в настоящее время существует несколько модификаций по сути одного и того же способа получения ДНК из молок различных видов рыб. Получаемые препараты отличаются либо слабой растворимостью в воде, либо требуют многостадийное™ процесса получения. Как альтернативу данному методу можно предложить ферментативный способ обработки исходного материала мультиферментными препаратами, включающими нуклеолитические ферменты. Кроме нуклеиновых кислот продукт будет содержать пептиды и свободные аминокислоты, что обеспечит ему новые биологические свойства и расширит область применения препарата.
В зависимости от стадий дальнейшей очистки препарат может быть выделен в нескольких вариантах:
15
1) водорастворимые олигонуклеотиды
2) водорастворимые олигонуклеотиды + свободные аминокислоты
3) водорастворимые олигонуклеотиды + свободные аминокислоты + пептиды
Протамины
* В клетках ДНК находится в комплексе с основными белками -
протаминами и гистонами.
Протамины- это небольшие белки с молекулярной массой около 4200 Да.
Из-за наличия большого числа аргининовых остатков они проявляют высокую основность и очень прочно связываются с ДНК и РНК. В аминокислотной последовательности протаминов аргинины собраны в кластеры длиной от четырех до шести остатков; при этом пролиновые остатки располагаются в таких положениях, что разбивают последовательность на почти правильные интервалы. Это позволяет предположить, что вторичная структура протаминов состоит из четырех а-спиралей, соединенных fc подвижными шарнирами. Согласно данным рентгеноструктурного анализа
полипептид протамина располагается в минорном желобке ДНК в растянутом виде и, чтобы нейтрализовать отрицательный заряд фосфатных групп сразу обеих цепей, направляет свои боковые группы то в одну, то в другую сторону (Зенгер, 1987).
16
Во многих протаминах N-концевые положения заняты одной и той же
аминокислотой (табл.1).
Таблица 1
N-концевые аминокислоты некоторых протаминов (Felix et. al., 1956)
Протамины Источник протамина N-концевая аминокислота
Клупеин Сельдь Clupea pallasi Пролин
Иридин Форель Salmo irideus Пролин
Труттин Кумжа Salmo irutta Пролин
Салмин Лосось Salmo salar Пролин
Стурин Осетр Acipenser sturio Алании, глутаминовая кислота
Фактически у всех моно- и дипротаминов N-концевой аминокислотой является пролин. Из всех приведенных в табл. 1 данных только в стурине роль N-концевой аминокислоты выполняют аланин и (или) глутаминовая кислота. Идентификация С-концевых аминокислот в протаминах показала, что в клупеине, иридине, салмине и стурине в качестве С-концевой аминокислоты находится аргинин (Буш, 1967).
Биологическая роль протаминов сводится к приданию ДНК стабильной, компактной формы и обеспечению ее транспортабельности. Имеются данные об ингибирующем влиянии протаминов в биологических системах. Так, по данным Мак-Ильвейна (Mcllwain, 1963), протамины, как и другие поликатионные соединения, угнетают возбудимость срезов коры полушарий головного мозга, при добавлении же в систему кислотных соединений
17 действие это снимается. Известно также, что сравнительно высокие дозы
протаминов подавляют рост некоторых опухолей у мышей (Muggleton, 1964). Имеются работы по антимикробному действию протаминсульфата, выделенного из молок рыб (Исаева и др., 1989). Высокая антимикробная активность протаминов объясняется большим содержанием аргинина. * Протамины используются в медицине как вещества, пролонгирующие
действие различных лекарственных препаратов, и как антикоагулянты крови (Рыбин и др., 1997).
Протамины синтезируются в молоках не всех, а лишь некоторых родов и семейств рыб, например, лососевых, сельдевых, осетровых и др. (Ling et al., 1979). Встречаемость и распространенность протаминов ограничены семенниками и спермиями рыб, но у отдельных их семейств заменены гистонами (например, у тресковых (Felix et al., 1956)). Опыты по изучению возникновения протамина в организме лосося показывают, что некоторые специфические белки (гистоны) в процессе сперматогенеза превращаются в протамины. Поэтому протамины присутствуют лишь в зрелых гонадах самцов (Заленский и др., 1980).
Гистоны
Гистоны имеют более сложное строение, чем протамины, молекулы их отличаются крупными размерами. Гистоны отличаются от протаминов рядом особенностей - в частности, они гидролизуются пепсином с образованием полипептидов с высоким молекулярным весом. Кроме того, гистоны содержат |
