ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Соединения с аминными функциональными группами представляют собой важные классы лекарственных веществ (ЛВ) и находят широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью. Многокомпонентность технологических смесей синтеза и лекарственных форм, токсичность многих из них при незначительном нарушении дозировки, а также генетическая детерминированность и индивидуальная вариабельность процессов их биотрансформации в организме человека требуют применения избирательных, чувствительных методов определения этих ксенобиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека.
В последнее десятилетие в анализе лекарственных веществ, наряду с развитием высокоэффективной жидкостной, тонкослойной хроматографии и других физико-химических методов, наблюдается тенденция к использованию таких аналитических систем, как проточно-инжекционный анализ (ПИА) и тест-методы. Этому способствовали такие их преимущества, как простота технического исполнения, высокая производительность, надежность и экономичность определений, возможность получения большого объема аналитической информации. Проточные методы анализа все чаще используются для оценки основных параметров, определяющих качество лекарств -их безопасности и эффективности применения.
Проблемой, ограничивающей применение проточных методов в биофармацевтическом анализе, является избирательность и чувствительность детектирования определяемых соединений. Это связано со сложным составом анализируемых матриц при низких содержаниях аналита, а также со спецификой значительной части ЛВ и их метаболитов, имеющих высокую полярность, слабовыраженные хромофорные, элек-трофорные или флуорофорные свойства. Кроме того, измерение аналитического сигнала в неравновесных условиях, когда физические и химические процессы в потоке не завершены, вызывает необходимость быстрого изменения аналитических свойств ЛВ за время движения определяемого соединения к детектору. Использование большей части реакций дериватизации аминосоединений из-за низкой специфичности взаимодействия и реакционной способности реагентов существенно ограничивает возможности проточного анализа ЛВ.
В то же время существует потребность в применении таких доступных аналитических систем, которые можно использовать в режиме проточного анализа для селективных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ в сложных по составу смесях без их разделения.
В этом плане важна разработка неинвазивных, простых в экспериментальном отношении и высокопроизводительных аналитических методов для исследований полиморфизма генетически детерминированных биохимических процессов, что чрезвычайно необходимо в осуществлении ранней досимптоматической диагностики заболеваний, оценке риска интоксикации, канцерогенеза и индивидуальной химической чувствительности организма человека.
Цель работы заключается в развитии научных основ и систематизации применения проточного анализа в фармацевтической химии для создания комплекса экспрессных, высокочувствительных, избирательных и производительных проточно-инжекционных, хроматографических и тест-методов для контроля качества лекарственных препаратов, фармацевтического производства и биофармацевтических исследований, а также оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации аминосодержащих лекарственных веществ.
Для достижения этой цели были решены следующие задачи:
- обоснование путей повышения избирательности и чувствительности определения лекарственных веществ, содержащих аминные функциональные группы, в равновесных и неравновесных условиях;
- выявление факторов, обеспечивающих чувствительность и избирательность определений ЛВ в проточных системах: проточно-инжекционном анализе, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии, тест-методах, установление взаимосвязи между физико-химическими параметрами проточных систем и аналитическими свойствами ЛВ, изучение влияния компонентов анализируемой матрицы на регистрируемый в потоке сигнал;
- разработка тест-систем и автоматизированных средств для определения в потоке токсичных соединений в технологических смесях, воздушной среде и сточных водах фармацевтических производств, определение критериев выбора используемых при этом хромогенных реакций, условий проведения аналитических определений, изучение метрологических характеристик методик;
8
- создание методических основ количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев в тест-методах для контроля безопасности технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств;
- разработка неинвазивных, избирательных и чувствительных аналитических методов фенотипической оценки генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обоснование их использования для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;
- практическое использование разработанных проточно-инжекцион-ных, хро-матографических, спектрофотометрических методик для контроля качества и производства лекарственных препаратов, а также биофармацевтических исследований ами-носодержащих ЛВ и выработка на этой основе рекомендаций по совершенствованию применения лекарственных средств.
Диссертационная работа выполнялась при поддержке Международного научно-технического центра (ISTC Projects # 498, 1517, 1891), Российского фонда фундаментальных исследований (проект 03-03-96013-р2003а), Академии наук Республики Татарстан (проекты 19-01/2000 (Ф), 07-7.5-86/2001 (Ф), 09-9.7-13/2001 (Ф), 09-9.2-112/2003 (Ф)), ISSHP (1999, 2000, 2001г.).
Научная новизна:
- на основании систематического исследования аналитических реакций ЛВ, содержащих аминные функциональные группы, выявлены факторы повышения избирательности и чувствительности определений аналитов в равновесных и неравновесных условиях;
- обоснованы выбор и условия использования проточных методов для избирательных и чувствительных определений аминосодержащих ЛВ различного спектра фармакологического действия в биологических жидкостях, технологических смесях и многокомпонентных лекарственных формах;
- обоснованы и установлены условия аналитических определений в проточно-инжекционном анализе ЛВ, выработаны критерии выбора аналитических реагентов при дериватизации биологически активных аминосоединений различных классов и компонентов их промышленного синтеза;
- выявлен характер влияния состава потока, физико-химических характеристик растворителей и компонентов анализируемых сред на избирательность и чувствительность определений ЛВ в проточных системах на основе использования приема кинетического регулирования;
- показана возможность использования тест-методов и автоматических средств аналитического контроля для оценки безопасности и качества технологических процессов и персонала химико-фармацевтических производств, предложены методические приемы количественных измерений спектральных характеристик селективных слоев тест-средств;
- установлены рабочие условия проточно-инжекционных, хроматографических, линейно-колористических, спектрофотометрических определений аминосодержащих ЛВ и исходных компонентов их синтеза, а также продуктов метаболических превращений в сложных по составу анализируемых матрицах;
- разработаны неинвазивные, избирательные и чувствительные методы оценки скорости генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ по типу ацетилирования, обосновано их использование для оптимизации фармакотерапии, обеспечения безопасности и оценки риска при работе с экотоксикантами;
- изучена фармакокинетика и биотрансформация диуцифона и фосфабензида, получены данные по индукции N-ацетилтрансферазы.
Практическая значимость. Выявлены и обоснованы новые области применения проточных методов анализа в фармацевтической химии для контроля качества, технологических процессов и безопасности фармацевтических производств, биофармацевтических исследований аминосодержащих лекарственных препаратов.
Разработаны экспрессные и чувствительные методики избирательного проточ-но-инжекционного, хроматографического, спектрофотометрического, тест-определения ряда аминосодержащих лекарственных веществ химиотерапевтического, анальгезирующего, антиаритмического, иммуномодулирующего и психотропного действия в реакционных смесях, лекарственных формах, биологических жидкостях человека.
В клинических и производственных условиях апробированы методики определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, замещенных триптамина, производных w-аминобензойной и w-аминосалициловой кислот, диаминодифенилсульфона, арила-
10
минов, гетероциклических аминов как в различных биологических жидкостях, полученных у пациентов в процессе терапевтического мониторинга, так и в готовых лекарственных формах и постадийном контроле производства.
Результаты исследования метаболических превращений диуцифона и фосфа-бензида в организме пациентов и их фармакокинетики использованы для оптимизации безопасного и эффективного клинического использования этих новых лекарственных средств.
Разработан комплекс неинвазивных методов определения типа генетически детерминированных процессов ацетилирования в организме человека при использовании гидразида изоникотиновой кислоты и сульфадимезина в качестве тест-препаратов. Методы рекомендованы и апробированы при оптимизации безопасной дозировки лекарственных веществ, оценки риска интоксикации, побочных явлений при фармакотерапии, а также установления показателей адаптации организма к интенсивной мышечной деятельности.
Результаты работы используются при проведении аналитического контроля (ОАО "Татхимфармпрепараты", ФГУП ФНПЦ ТКНПП им. В.И. Ленина", Казанская академия ветеринарной медицины), в фармакокинетических исследованиях (Казанский государственный медицинский университет), биохимических исследованиях функционального состояния спортсменов, оценке степени их тренированности (Казанский государственный педагогический университет), для обеспечения экологической безопасности личного состава (Министерство обороны РФ) и внедрены в лечебную практику Республиканского клинического противотуберкулезного диспансера (Казань), Республиканской клинической больницы Татарстана, Казанской городской клинической больницы № 6, детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н Сперанского (Москва).
Экспериментальные результаты и выводы на их основе использованы в учебном процессе Казанского государственного технологического университета в дисциплинах "Контроль качества лекарственных препаратов", "Экологический мониторинг" и Казанского государственного медицинского университета в последипломном образовании провизоров.
11
На защиту выносится:
• Результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения аналитических определений аминосодержащих лекарственных веществ в проточных системах (проточно-инжекционный анализ, тест-методы, высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматография).
• Обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях аминосодержащих лекарственных веществ в виде их производных в равновесных и неравновесных условиях.
• Результаты изучения влияния состава потока и его гидродинамических параметров, рН, свойств используемого реагента и определяемого вещества на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования ЛВ и компонентов их синтеза в системе проточно-инжекционного анализа, высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии.
• Методики проточно-инжекционного, хроматографического и спектрофотометри-ческого определения гидразидов кислот, сульфаниламидов, производных п-аминобензойной и w-аминосалициловой кислот, замещенных триптамина, диами-нодифенилсульфона, w-аминофенола, о-фениленди-амина, гетероциклических аминов в промышленных и модельных смесях, лекарственных формах и биологических жидкостях.
• Способы определения фенотипа ацетилирования при изучении фармакокинетики тест-препаратов сульфадимезина и изониазида в слюне и моче пациентов и результаты их применения в клинических условиях, а также в режиме профессиональной спортивной деятельности.
• Данные по индукции N-ацетилтрансферазы при клиническом использовании ряда лекарственных препаратов.
• Данные по фармакокинетике и метаболизму диуцифона и фосфабензида в организме человека.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на III - V Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1996, 1997, 1998), I Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), Международной конференции "Neurochcmistry and Pharmacology of Drug Addiction and Alcoholism" (С.-Петербург, 1996), Всероссийской конференции "Экоаналитика-96"
12
(Краснодар, 1996), Всероссийской конференции "Мутагены и канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагенеза" (Казань, 1996), II конгрессе "Традиционная медицина. Теоретические и практические аспекты" (Чебоксары, 1996), Российском научно-практическом семинаре "Современное состояние теории и практического применения метода ТСХ" (Москва, 1996), Межвузовской конференции "Актуальные проблемы современной фармакотерапии" (Саратов, 1996), Международной конференции "Современные пути развития гомеопатии и проблемы создания рациональных лекарственных форм" (Пятигорск, 1996), II Международном конгрессе "Huropean Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics" (Берлин, 1997), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С.-Петербург, 1998), III Всероссийской конференции "Экоаналитика - 98" (Краснодар, 1998), V Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Ярославль, 1998), II Всероссийском симпозиуме «Проточный химический анализ» (Москва, 1999), V Всероссийской конференции "Электрохимические методы анализа" (Москва, 1999), Поволжской региональной конференции (Казань, 1999), Региональной конференции "Методы аналитического контроля материалов и объектов окружающей среды" (Пермь, 2001), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Всероссийском симпозиуме "Тест-методы химического анализа" (Москва, 2001), Научно-практической конференции "Окружающая среда и здоровье" (С.-Петербург, 2001), 28 Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), V Всероссийской конференции "Экоаналитика-2003" (С.-Петербург, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), итоговых научных конференциях КГТУ (Казань, 1994 - 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 31 статья, 6 учебных пособий и методических указаний, 35 тезисов докладов и получен 1 патент РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав экспериментальной части, в которых описана аппаратура, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения и списка использованной литературы. В приложении представлены акты использования разработанных аналитических методик.
Диссертация изложена на 264 страницах, содержит 50 рисунков, 53 таблицы, список использованной литературы включает 425 источников.
13
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1 Проточно-инжекционный анализ лекарственных веществ
Одной из важнейших задач фармацевтической химии является создание высокопроизводительных систем автоматического контроля, позволяющих проводить чувствительные и избирательные определения лекарственных веществ в различных объектах. Весьма перспективно использование для этих целей систем проточно-инжекционного анализа (ПИА), открывающего широкие возможности для изучения процессов биотрансформации лекарственных препаратов в организме человека, контроля качества фармацевтических продуктов и регулирования процессов на всех стадиях производства лекарственных веществ (ЛВ), терапевтического и токсикологического мониторинга ксенобиотиков в биологических средах [1-6]. Этому способствуют такие преимущества ПИА, как простота принципов и исполнения, высокая производительность и экономичность определений, возможность получения большого объема аналитической информации.
Основные области приложения ПИА в анализе лекарственных веществ связаны с контролем качества различных фармацевтических продуктов (субстанций, лекарственных форм); с определением токсичных компонентов реакционных смесей в процессе синтеза лекарственных веществ; с исследованием процессов, протекающих при хранении готовых лекарственных форм, и установлением их безопасности; с оценкой процессов распадаемости лекарственных форм и определением биодоступности лекарств; проведением мониторинга физиологически активных веществ в биологических средах.
Особенность ПИ определений ЛВ связана с тем, что их необходимо проводить в сложных по составу анализируемых матрицах при низких содержаниях определяемых веществ (например, до нескольких нанограммов на 1 мл при анализе биологических жидкостей) [5]. В связи с этим одной из проблем, ограничивающей применение ПИА в фармацевтическом анализе, является возможность избирательного и чувствительного детектирования определяемых соединений.
14
Избирательность ПИ определений лекарственных веществ. Возможности расширения круга анализируемых соединений. Большинство ЛВ по своей структуре являются органическими соединениями различной химической природы. Специфика значительной части ЛВ и их метаболитов, связанная с высокой полярностью, слабо выраженными хромофорными, электрофорными или флуорофорными свойствами, зачастую накладывает ограничения на возможности избирательного детектирования при проведении ПИ определений. Кроме того, измерение аналитического сигнала в неравновесных условиях, когда физические и химические процессы в реакторе не завершены, вызывают необходимость быстрого изменения аналитических свойств ЛВ (использования "быстрых" реакций) за время движения определяемого соединения к детектору.
Применение высокоселективных вариантов детектирования в отдельных случаях позволяет проводить определения ЛВ без проведения реакций получения производных в системе ПИА. Такие варианты реализованы при ПИ определениях ряда лекарственных веществ (амитриптилин, кломипрамин, имипрамин, карбамазепин, флу-феназин) с УФ-детектированием (180 проб/час) [7]. ПИ определение следовых количеств нуклеиновых кислот основано на окислении гуаниновой составляющей на угольном пастовом электроде и также не требует предварительного получения производных [8]. При ПИ определении ЛВ описано использование инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (определение парацетамола в лекарственных формах [9], атомно-абсорбционной спектрометрии (определение ртути в моче при изучении метаболизма ртутьорганических ЛВ) [10], масс-спектрометрии с индукционной связанной плазмой (определение цинка, меди и селена в лекарственных препаратах) [11]. В большинстве случаев, однако, из-за низкой селективности детектора ПИ определения ЛВ возможны лишь в чистых растворах лекарственных препаратов.
Для повышения избирательности и чувствительности ПИ определений, расширения возможностей метода используются различные приемы. Дериватизация (получение производных определяемых веществ) пока является приоритетным подходом улучшения аналитических свойств определяемых ЛВ в системе ПИА. Целью ее проведения в ПИА ЛВ служит получение новых соединений, обладающих улучшенными детекционными характеристиками по сравнению с исходными ЛВ. Для получения
15
производных применяют химические, фотохимические и энзиматические реакции. При этом реакции могут происходить во время движения реакционной зоны до детектора или непосредственно в детекторе во время измерения. Во втором случае дерива-тизацию определяемых ЛВ в целях достижения более высоких аналитических характеристик можно рассматривать как частный случай более общего подхода в химической модификации гетерогенных и гомогенных составляющих аналитической системы при создании высокоселективных способов детектирования в потоке. Модификация поверхности электродов различными химическими реагентами или ферментами приводит к созданию высокоспецифичных и чувствительных сенсоров, широко применяющихся для детектирования в ПИА. Этот прием позволяет в итоге повысить как избирательность, так и чувствительность аналитического отклика. При дериватизации также достигается улучшение экстракционных характеристик определяемых соединений, повышается устойчивость их в процессе анализа, упрощается и облегчается процесс пробоподготовки, уменьшается предел обнаружения (ПрО) ЛВ.
Важным способом расширения круга ЛВ, которые можно избирательно определять в системе ПИА, служит применение различных систем детектирования. Для этого используют оптические, электрохимические и другие детекторы. Выбор системы детектирования во многом определяется типом химической реакции, используемой для дериватизации ЛВ и физико-химическими свойствами образующихся производных. Особенно перспективно применение в системе ПИА комбинированных систем детектирования, когда последовательно регистрируется аналитический отклик определяемого вещества с использованием различающихся по физическому принципу устройств.
Другим важным фактором расширения возможностей ПИА стали традиционные аналитические технологии разделения и концентрирования определяемых соединений, такие как экстракция и диализ (микродиализ). Кроме того, в последние годы сформировалась тенденция к совершенствованию идеологии ПИА за счет использования последовательного инжекционного анализа.
Химические реакции. Дериватизация является основным химическим приемом расширения аналитических возможностей ПИА ЛВ. Для этой цели чаще применяются химические реакции ЛВ, в ходе которых образуются соединения с новым со-
16
ставом, структурой и отличными от исходного вещества физико-химическими свойствами. Широко используются различные реакции с участием ЛВ: окислительно-восстановительные, комплексообразования, осаждения, образования ионных пар и аддуктов и др.
Приведенные в табл. 1.1 данные по использованию различных типов реагентов для дериватизации свидетельствуют о большом разнообразии применяемых реакций получения производных ЛВ и методов их детектирования в ПИА. Они, кроме того, демонстрируют высокую эффективность использования приема дериватизации определяемых веществ в повышении чувствительности методов детектирования ЛВ.
При проведении реакций дериватизации, однако, необходимо учитывать ряд специфических особенностей, связанных со сложностью протекания органических реакций [12]. Реакции, используемые для получения производных ЛВ, во многих случаях протекают с невысокими скоростями, характеризуются сложным механизмом, зависимостью от состава среды, рН и других факторов. Часто незначительные изменения условий проведения реакций могут вызвать радикальные изменения результатов определения.
При выборе реакции для получения производных определяемых соединений нужно учитывать малую специфичность многих из них, что может приводить к образованию продуктов с однотипными аналитическими свойствами как для интересующих ЛВ, так и для других компонентов смеси. Примером такой реакции может служить определение в системе ПИА сульфаниламидов в виде диазотированных производных с N-(1-нафтил)- этилендиамином, в которой участвуют, кроме аминов, фенолы и другие соединения, содержащие активную метиленовую группу [13]
\~ + НС|
N = N—Ar /| |\
Все эти особенности реакций получения производных ЛВ, тем не менее, не устраняют возможности получения удовлетворительных по метрологическим характеристикам и чувствительности результатов определения при правильном выборе реагента, соблюдении условий проведения реакции дериватизации, строгом контроле времени пребывания пробы в системе ПИА и степени ее разбавления в потоке.
17
Таблица 1.1
Основные типы химических реакций и реагентов, используемых в
проточно-инжекционном анализе лекарственных веществ
(детализация представлена в табл. 1.2-1.3 и в тексте обзора)
Основные
Типы реакций Основные реагенты Классы определяемых способы
получения лекарственных веществ детекти-
производных рования
Образование Нитрит натрия, ами- Сульфан иламиды СФД
азосоединений ны
Конденсация с о-Фталевый Сульфаниламиды, амины, ФЛД
карбонильными альдегид и 2- алкалоиды
соединениями меркаптоэтанол, п-
диметиламинобен- 7
зальдегид и др.
Окисление - Ионы металлов, Фенотиазины, катехол- СФД,
восстановление анионы-окислители, амины, антибиотики, ФЛД,
пероксид водорода, аминокислоты, мочевины, эхд
оксидазы, редуктазы стероиды, витамины,
и др. органические кислоты
Комплексообра- Ионы металлов Антибиотики, органические СФД,
зование кислоты, амины ФЛД
Нуклеофильное Замещенные бенз- Ариламины, гидразиды, СФД,
замещение 2,1,3-оксадиазола, аминофенолы, сульфа- ФЛД,
1-фтор-2,4- ниламиды, гетероцикли- эхд
динитробензол и др. ческие амины, производ-
ные фенолов, катехоламины
Образование Органические Фенотиазины, органические СФД
солей красители, соли соли, амины

 Часть из работы     Получить работу