Введение
Гидры (тип Cnidaria, класс Hydrozoa, отряд Hydrida*, семейство Hydri-dae) - одни из самых известных представителей пресноводной фауны беспозвоночных. О гидре узнают из школьного курса зоологии. Изучение гидр продолжается на биологических факультетах в ВУЗах, а удобство содержания культуры гидр позволяет студентам познакомиться с живым объектом. Наконец, гидра - один из лучших модельных объектов, используемых при изучении клеточных структур и тканей, регенерационных процессов. Гидра широко используется в биохимических и молекулярных исследованиях, в разработке некоторых вопросов генной инженерии... Гидре посвящены тысячи научных публикаций. Некоторые особенности физиологии, биохимии и органологии гидры изучены очень подробно. Несмотря на все это, гидры, как ни странно, очень плохо изучены в таксономическом аспекте.
В мировой фауне насчитывается около 27 видов гидр. В России известно 6 видов, однако видовой состав гидр России и сопредельных территорий изучен недостаточно. Последние оригинальные фаунистические данные получены в 20-х годах XX века (Рылов, 1921; Исаев, 1923; Сварчевский, 1923), но к ним следует относиться критически, так как ранние описания не соответствуют современному пониманию различий между видами гидр. Изучение фаунис-тического разнообразия гидр России во второй половине XX века практически не проводилось.
До последнего времени не был решен вопрос о количестве родов гидр. Место гидрид в системе Hydrozoa также не определено окончательно: таксономические публикации, в которых идет речь о гидридах (Наумов, 1960; Bouillon, 1985; Holstein, 1995 и другие), не дают четких ответов на эти вопросы, а сделанные предположения о родственных отношениях гидр с другими группами Hydrozoa, кажутся нам недостаточно обоснованными. Вместе с тем, попытка выявления родственных связей гидрид с другими
Необходимость придания гидридам статуса отряда Hydrida обоснована в главе 5
4
группами Hydrozoa могла бы способствовать правильному пониманию происхождения гидрид.
Особый интерес представляет изучение такого нетрадиционного для систематики Hydrozoa признака как кариотип. В мировой литературе карио-типам Hydrozoa посвящено всего около трех десятков публикаций, а семейству Hydridae - около десяти (табл. 6). За всю историю изучения Hydrozoa были предприняты только две попытки использовать особенности кариотипа в качестве таксономического признака (Kubota, 1992; Ованесян, Кузнецова, 1995).
Основная цель настоящей работы заключалась в ревизии Hydrida на основе анализа морфологических и кариотипических признаков, в выяснении состава и таксономического статуса гидрид, выявлении их родственных связей с другими группами класса Hydrozoa.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Сбор живого материала в возможно большем количестве водоемов от Северо-Западной части до Дальнего Востока России и в водоемах некоторых приграничных с Россией территорий.
2. Разработка методов содержания гидр и представителей других групп Hydrozoa в лабораторных условиях.
3. Сравнение морфологических особенностей представителей гидрид с таковыми других групп Hydrozoa.
4. Адаптация существующих методов приготовления хромосомных препаратов и окрашивания хромосом, в том числе методов анализа их тонкого строения, для цитогенетического изучения гидрид и других представителей Hydrozoa.
5. Изучение в сравнительном аспекте особенностей кариотипов Hydrida и близких групп и оценка значимости особенностей кариотипа как таксономического признака гидрозоев.
6. Описание видового состава гидр России и прилегающих территорий.
7. Изучение некоторых особенностей экологии гидр.
5 Научная новизна.
Проведено более глубокое, по сравнению с предшествующими исследованиями, изучение фауны гидр России и прилежащих регионов. В результате длительных прижизненных наблюдений за гидрами, изучения коллекционного материала, кариологических исследований и анализа литературных данных, определен видовой состав группы, даны подробные описания выявленных видов и диагнозы родов, рассмотрены и дополнены сложившиеся представления о таксономическом статусе и положении Hydrida в системе Hydrozoa.
Впервые проведено сравнительно-кариологическое исследование гидр и ряда видов из других групп Hydrozoa. Установлено число хромосом у этих видов. Впервые изучение хромосомных наборов производилось не только в митозе, но и на разных стадиях сперматогониального мейоза. Разработаны и усовершенствованы методы предобработки, фиксации и изготовления препаратов хромосом морских, солоноватоводных и пресноводных Cnidaria, усовершенствованы и, впервые для Cnidaria в целом, применены методы дифференциального окрашивания хромосом: С-бэндинг, AgNOR-бэндинг, окрашивание хромосом ДНК-специфичными флюорохромами DAPI и СМАз- В результате, впервые для гидрозоев изучены распределение и молекулярный состав структурного (конститутивного) гетерохроматина, определены морфологические особенности хромосом, локализованы ядрышкоообразующие районы (ЯОР) и выявлен их молекулярный состав. Для четырех видов гидр впервые получены данные о размере геномов.
Установлено, что географически разобщенные популяции одного и того же вида гидр могут быть представлены либо только разнополыми, либо только гермафродитными особями. В результате показано, что гермафродитизм и раздельнополость у гидр не являются надежными видовыми критериями.
В результате экологических наблюдений впервые получены данные о численности гидр в водоемах Северо-запада России.
Теоретическая и практическая ценность.
На основе оригинальных данных, полученных в результате применения новых подходов и методов, в том числе методов хромосомного анализа,
6
существенно дополнены представления о фауне, таксономии, эволюции и родственных связях гидрид. Полученные данные могут быть использованы при проведении учебных занятий в школах с углубленным изучением биологии, ВУЗах и других образовательных учреждениях в рамках курсов зоологии беспозвоночных, цитологии, генетики. Проведена ревизия гидрид и составлен идентификационный ключ родов и видов, позволяющий точно определять виды. Материалы, полученные в ходе подготовки настоящей диссертации, использованы в научно-популярной монографии "Гидра: от Абраама Трамбле до наших дней" (Степаньянц, Кузнецова, Анохин, 2003), адресованной студентам естественных специальностей ВУЗов, преподавателям, школьникам, экологам. Полученные данные о численности гидр и их влиянии на продукцию зоопланктона могут быть использованы в работах гидробиологического направления.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены в виде тезисов, устных сообщений и стендовых докладов на: семинарах лаборатории морских исследований ЗИН РАН; отчетных сессиях ЗИН РАН в 1998, 2000, 2002, 2003 годах; международной конференции "Экологические исследования беломорских организмов", Санкт-Петербург (1997); четвертом международном рабочем совещании гидрозойного общества (США, Калифорния, 1998); международной юбилейной конференции "Состояние, изучение и сохранение природных комплексов Астраханского биосферного заповедника в условиях повышения уровня каспийского моря и усиливающейся антропогенной нагрузки", Астрахань (1999); конференции Памяти H.H. Воронцова, Москва (2000); третьем международном симпозиуме "Ancient lakes: speciation, development in time and space, natural history" (Иркутск, 2002); международном совещании "Hydra and the Evolution of Signalling Pathways" (Тутцинг, Германия, 2003).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 20 работ, 4 работы находятся в печати.
Автор глубоко признателен своим учителям I Ксении Мироновне Суха-
новой], Софии Давидовне Степаньянц и Валентине Григорьевне Кузнецовой.
Я благодарен доценту лаборатории генетики университета г. Турку (Финляндия) С. Ноккале (Dr. S. Nokkala) и профессору Зоологического института г. Киля (Германия) Т. Бошу (Prof. Thomas G.C. Bosch) за помощь при выполнении цитогенетической части работы; O.A. Тимошкину, Т.А. Ситниковой и другим сотрудникам Лимнологического института СОР АН, сотрудникам Белорусского Государственного Университета, Института Биологии Моря ДВО РАН за помощь в сборе материала. Автор пользуется случаем выразить искреннюю благодарность всем сотрудникам Зоологического института РАН, особенно сотрудникам лаборатории морских исследований и отделения кариосистематики насекомых, оказавшим помощь в ходе выполнения настоящей работы.
Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты № 97-04-50100, 00-04-48747, 00-04-63069, 01-04-06385 и 02-04-06899); Centre of International Mobility (грант HAI 186/5.2.2002); персонального гранта Администрации Санкт-Петербурга, Министерства образования РФ, Российской Академии наук (2003 г.).
Л'
Глава 1. История изучения гидр. Краткий обзор литературы.
Гидры (Cnidaria, Hydrozoa, Hydrida, Hydridae) были открыты в 1702 А. Левенгуком, нашедшим их на водных растениях искусственных каналов возле города Дельфта (Голландия). О своей находке Левенгук сообщил в Письме, опубликованном в "Трудах Королевского общества" в Лондоне (Leeuwenhoek, 1704), назвав обнаруженных им существ «анималькулами». Это i открытие осталось практически незамеченным.
В 1740 году А. Трамбле обнаружил гидр в прудах окрестностей Гааги (Голландия), первоначально приняв их за растения. Посоветовавшись с известным естествоиспытателем Р.А.Ф. Реомюром, Трамбле понял, что имел дело с животными, которым дал название «полипы с руками в форме рогов». В исследовании Трамбле (Trembley, 1744) содержалось всестороннее описание внешнего вида, движений, питания полипов, мест их обитания и экспериментов по изучению способности гидр к регенерации. Его труды стали широко известны и дали толчок к дальнейшему исследованию полипов, позже названных гидрами.
Основы классификации гидр были заложены Трамбле (Trembley, 1744) и Розелом фон Розенгофом (Rosel, 1755), которые отметили, что встреченные ими полипы различны.
Биноминальная классификация гидр началась в 1758 году, когда К. Линней ввел для трех видов гидр одно название - Hydra polypus, и развивалась последующими исследователями* (Pallas, 1766; Linne, 1767; Schulze, 1914, 1917; Ewer, 1948 и др.).
До середины XX века исследователи оперировали ограниченным числом признаков у гидр, без учета их большой изменчивости, при этом они чаще всего работали с фиксированным материалом (Schulze, 1914; 1927). Это
Детальнее вопросы классификации рассмотрены в главе S
9
привело к многочисленным переописаниям старых видов под новыми именами. Многие из накопившихся ошибок не исправлены до сих пор.
Таксономисты отводили семейству Hydridae Dana 1846 различное место в системе Hydrozoa (прил. 1), помещая его в отряд со сходными названиями -Hydrina, Hydrida, или Hydroida (Kramp, 1935; Hyman, 1940; Наумов, 1960; Беклемишев, 1964), в отряд Athecata (Ewer, 1948; Tardent, 1978) либо в надсемейство Moerisioidea отряда Capitata (Bouillon,1985; Petersen, 1990).
Таким образом, до настоящего времени исследователи не пришли к единому мнению относительно места гидрид в системе Hydrozoa, а таксономический статус гидрид остается предметом дискуссий .
Изучение морфологии и анатомии* гидр нашло отражение в ряде работ. В каждой из работ, как правило, рассматривался один из аспектов строения гидр: гистология (Leydig, 1854; Downing, 1905; Hess, 1961; Wood, 1961), особенности возникновения щупалец (Mereschkowsky, 1878), строение нервной системы (Hadzi, 1909), развитие (Korotneff, 1883; Айзенштадт, 1974, 1980; Бабицкий, Говор, 1991; Martin et al., 1997), общая морфология (Kleinenberg, 1872; Федоров, 1864; Schulze, 1922; Канаев, 1952; Tardent, 1988; Holstein, 1995).
Хотя еще Трамбле (Trembley, 1744) заметил, что стенка тела гидр состоит из двух слоев, настоящее гистологическое изучение гидр развернулось в XIX веке с развитием микроскопической техники и гистологических методик. Одним из первых исследователей, который верно интерпретировал результаты своих наблюдений, был Лейдиг (Leydig, 1854, цит. по Канаеву, 1952). Он открыл, что тело гидры имеет клеточное строение, описал два клеточных слоя и опорную пластинку между ними. Другие исследователи показали, что в состав эпидермы и гастродермы входит несколько типов клеток: эпителиально-мускульные, интерстициальные, нервные, чувствительные железистые и стрекательные; определили особенности их строения, и функционирования (Corda, 1836; Ehrenberg, 1838; Doyere, 1842; Kleinenberg, 1872; Коротнев, 1876,
' Более подробно место гидр в системе Hydrozoa рассмотрено в главе 5; особенности строения и физиологии - в главе 3 т
10
1880; McConnell, 1933a,b,c; Канаев, 1952; Chapman, 1961; Kline, 1961; Campell, 1977; Tardent, 1988; Aerne et al., 1991 и др.).
Уже в первых публикациях о гидрах отмечаются особенности бесполого размножения полипов - почкования (Leeuwenhoek, 1704; Trembley, 1744). В дальнейшем это явление было описано детально (Ehrenberg, 1838; Mereschkowsky, 1878; Zoja, 1890; Hertwig, 1906; Krapfenbauer, 1908, по Канаеву, 1952; Schulze 1917; Gross, 1925; Chang, 1950; Chang, Woo, 1951; Канаев, 1952; Бабицкий и Говор, 1991).
Впервые вылупление гидры из яйца наблюдал Паллас (Pallas, 1766). Первым, кто описал оплодотворение у гидр и выяснил роль семенников, распознал яйцо гидры, был Эренберг (Ehrenberg, 1838). Позже были опубликованы исследования сперматогенеза, оогенеза и эмбрионального развития гидр (Kleinenberg, 1872; Коротнев, 1880; Downing, 1905; Wager, 1909; Brien, 1951; Tardent, 1966; Айзенштадт, 1974, 1978, 1980; Martin et al., 1997).
Симбиотические отношения гидры с водорослями заинтересовали исследователей давно, став постоянным предметом их пристального внимания. Данные о том, что в клетках зеленой гидры Chlorohydra viridissima (Pallas, 1766) обитают зеленые водоросли, появились еще в конце XIX века (Brandt, 1883; Entz, 1881-1882, цит. по Канаеву, 1952 и др.), однако более глубоко симбиоз Ch. viridissima с Chlorella vulgaris и другими водорослями был исследован в XX веке (Cook, 1972; Thorington, Margulis, 1981; Dunn, 1988; Campbell, 1990 и др.).
Первые данные по цитогенетике гидр были опубликованы в конце XIX века: в 1983 году Коротнев (Korotneff, 1883) привел схематические рисунки митозов в бластомерах гидр. Позже хромосомы гидр наблюдали многие исследователи (Brauer, 1891; Downing, 1905; Wager, 1909; Gelei, 1924; Mattes, 1925; Wermel, 1926, цит. по Makino, 1951; McConnell, 1933a,b), однако долгое время никому не удавалось точно определить число хромосом изучаемых видов: нередко для одного и того же вида разные авторы сообщали разные хромосомные числа. Эта ситуация была вызвана тем, что изучение кариотипов
11
проводилось на гистологических срезах, а при реконструкции метафазных пластинок по срезам всегда велика вероятность ошибок в подсчете числа хромосом. Только после разработки в середине XX века методик давленых и воздушно-высушенных препаратов появилась возможность точно установить число хромосом для каждого вида. Несмотря на это, до последнего времени информация о кариотипах гидр была исключительно скудна и ограничивалась преимущественно сообщением хромосомных чисел (Brauer, 1891; Downing, 1905; Wermel, 1926;McConnell, 1933a,b; Rahatet al., 1985).
Вопрос о происхождении гидрид поднимался разными авторами, начиная
с начала XX века. Иногда высказывались лишь самые общие предположения о
,м происхождении гид!: гидры произошли от каких-то морских гидроидов,
I утративших медузоидное поколение (Канаев, 1952; Stechow, 1919).
Другие исследователи называли конкретную группу, от которой могли произойти гидры: от личинки Myriothela (отр. Athecata, сем. Myriothelidae) (Сварчевский, 1923), от лимномедуз (отр. Limnomedusae) (Наумов, 1960), от форм, близких к Moerisia (Athecata, Moerisiidae) (Тихий, 1916; Holstein, 1995).
Таким образом, и общепринятой теории происхождения гидрид не существует.
Сведения о видовом разнообразии гидр накапливались медленно. Во всех работах, где описаны новые виды гидр, и в ранних натуралистических сообщениях, где идет речь о полипах, имеется информация о местах нахождения гидр. Однако к таким данным надо относиться с осторожностью из-за того, что видовые определения авторов XIX - начала XX могли быть не верны ввиду использования недостаточного числа признаков.
Ю. Симашко (1861) и М. Федорову (1864) принадлежат первые сообщения о гидрах России, а Н. Куделину (1915) - первый обзор фауны гидр России. В дальнейшем информация о фауне гидр была расширена незначительно, и за редким исключением (Сварчевский, 1923; Schulze, 1927), касалась европейской части России (Рылов, 1921; Исаев, 1923). Более поздние работы, в которых
12
содержится фаунистическая информация по фауне гидр России, носят компилятивный характер (Канаев, 1952; Наумов, 1960; Степаньянц, 1994).
Обзоры мировой фауны гидр даны Юером (Ewer, 1948) и Грейсон (Grayson, 1971). Имеется также ряд региональных фаунистических сводок гидр (Annandale, 1908, 1911; Hyman, 1931b; Kramp, 1938a; Adshead, 1963; Forrest, 1963; Grayson, 1971; Holstein, 1995). Назвать точное количестве видов гидр мировой фауны в настоящее время невозможно, однако, предположительно, в трёх родах гидр может насчитываться от двух до трех десятков видов (подробнее см. гл. 6).
Первые наблюдения по экологии гидр опубликовал Трамбле (Trembley, 1744).
Дальнейшие исследования экологических особенностей гидр отражены во многих работах и касаются влияния на гидр света (Haug, 1933; Schlunsen, 1935; Ewer, 1947; Holstein, 1995), температуры (Gross, 1925; Haase-Eichler, 1931; Brien, 1951, 1963; Дрегольская, 1963; Tardent, 1978), кислородного режима (Haug, 1933; Канаев, 1952; Бабицкий, Островский, 1989), химического состава воды (Loomis, Lenhoff, 1956).
Значительно меньше публикаций посвящено влиянию гидр на биотический баланс водоемов и численности гидр (Cuker, Mozley, 1981; Бабицкий, Островский, 1989), влиянию концентрации пищи на индивидуальное развитие гидр (Бабицкий, Говор, 1991). Первое и единственное всестороннее экологическое исследование гидр проведено Бриденом (Bryden, 1952), который изучил вертикальное, горизонтальное и сезонное распределение популяции P. oligactis, её динамику, включая особенности роста, размножения, продуктивность.
Гидры - хороший модельный объект, на котором выполнены многие исследования, например, по клеточной дифференциации (Полтева, 1983, 1996; Technau et al., 2000), физиологии и биохимии нематоцист (Robson, 1973; Holstein, Tardent, 1984; Weber et al., 1988; Klug, 1986) и многие другие (Gierer, 1999).
13
Молекулярные исследования гидр ведутся по разным направлениям. Гидра, устроена значительно проще, чем любое билатерально-симметричное животное, и отлично подходит для расшифровки генетических программ развития, в частности, системы позиционной информации (Weinziger et al., 1994; Yan et al., 1995, Kumpfmuller et al., 1999; Technau, Bode, 1999; Leontovich et al., 2000, Lohmann, Bosch, 2000; Bosch, Khalturin, 2002.).
Методы молекулярной биологии позволяют также решить вопросы самоорганизации гидр - особенностей формирования слоев, головного конца, регенерации и т.д. (Technau at al., 2000; Koizumi, 2002 и др.); понять какие химические соединения, когда, где и под контролем каких генов возникают, как работают, каковы особенности сигнальных молекул и т.д. (Hoffmeister-Ullerich et al., 2002). Некоторые из этих направлений имеют общебиологическое значение (Galliot, Schmid, 2002).
Значительная часть информации, известная о гидрах, суммирована также в ряде монографий и сборников: "Гидра" (Канаев, 1952), "The Biology of Hydra and of some other Coelenterates" (1961, eds. Lenhoff, Loomis), "Hydra and the birth of experimental biology - 1774: Abraham Trembley's memoires concerning the polyps" (Lenhoff S.G, Lenhoff H.M., 1986), "Hydra" (Tardent, 1988) и некоторых других.
14
Глава 2. Материал и методики
2.1. Материал: сбор, фиксация, анализ и определение
Большая часть материала, использованного в работе, собрана автором на территории России, Белоруссии и Финляндии. Экспедиционные поездки проходили в летний и осенний сезоны с 1997 по 2001 гг. на территории Ленинградской обл. и С.-Петербурга; в 1997 г. в Белоруссии и Белгородской обл.; в 1997, 1999 и 2001 гг. в Карелии (ББС ЗИН РАН); в 2000 г. на Байкале и в Приморском крае; в 2001 г. в Ростовской обл. и Краснодарском крае
(Азовское море), в 2002 г. в окрестностях г. Турку (Финляндия). Часть иссле-
•"i дований проведена на коллекционном материале ЗИН РАН и на материале,
собранном в Японии (сборщик O.A. Тимошкин). Более подробно места и даты сборов указаны в таблице 1.
Сбор материала осуществлялся с лодки или с берега вручную. Гидры были встречены на водных растениях, корягах, камнях и других предметах.
Количественная оценка плотности поселения гидр производилась на участках водоема 1 х 1 м и 0.5 м в глубину. С этого объема собирались все растения и подсчитывалось количество экземпляров гидр на них.
Гидры и Pachycordyle культивировались в чашках Петри, кристаллизаторах и аквариумах в отстоянной водопроводной воде, a Cordylophora и Protohydra — в морской воде. Все животные кроме Protohydra содержались при комнатной температуре. Полипы Protohydra содержались при 4 - 10°С. Смена воды производилась дважды в месяц. Животных кормили один - два раза в неделю дафниями, циклопами, или свежевылупившимися науплиусами Artemia salina.
Для коллекций материал фиксировался в 70% этаноле или 4% формалине.
Зафиксированные особи хранятся в коллекции Отделения губок и кишечнополостных Лаборатории морских исследований Зоологического ин-та РАН (каталожные номера см. в табл.1).
15
Изучение внешнего строения и структуры нематоцист проводилось преимущественно на живом материале. Лишь в редких случаях приходилось ограничиваться фиксированными пробами из коллекций Зоологического
I
института РАН, собранными в недоступны^ для нас районах.
Определение живого и фиксированного материала, измерение линейных размеров проводились с помощью микроскопов "Amplival 30-G 048с", "Jenaval" при увеличении от х 32 до х 1000 и бинокулярной лупы МБС-9 при увеличении от х4.8 до х 56. При определении учитывалось максимально возможное количество признаков внешней морфологии, а также обязательно особенности строения нематоцист. Для исследования нематоцист живая или фиксированная гидра целиком, или одно щупальце полипа, помещались в каплю воды на предметное стекло, накрывались покровным стеклом и придавливались до распадения тканей на отдельные клетки. Препарат анализировался при увеличении объектива in 100.
Для приготовления хромосомных препаратов использовали только свежий материал. Кариотипы изучены у 6 видов и одной гибридной формы гидр и 6 видов других групп Hydrozoa . Приготовлено около 1200 микроскопических препаратов, из них более 250 переведены в постоянные и хранятся в Отделении кариосистематики Зоологического института РАН. Хромосомы изучали преимущественно в митозе и метафазе первого и второго делений (MI и МП) сперматогониального мейоза.
2.2. Методики хромосомного анализа'
Приготовление препаратов хромосом
Для кариологических исследований была использована методика приготовления воздушно-высушенных хромосомных препаратов. В соответ-
I
ствии с методикой объект помещался на 10-40 мин. в гипотонический раствор 0.4% цитрата Na (C6H5Na3O72H2O), затем в течение 12 - 30 мин. фиксировался
Исследовались либо наиболее доступные виды (Cordylophora lacustris, Pachycordyle kubotcti, Craspedacusta sowerbii, Clava sp), либо представители групп, с которыми сближали гидрид (Moerisia maeotica, Protohydra leuckarti)
16
в свежеприготовленной смеси этанола (96%) и ледяной уксусной кислоты (3:1), после чего переносился в каплю 70% уксусной кислоты на предметном стекле
I
и тщательно измельчался препаровальными иглами до получения однородной клеточной суспензии. Препарат высушивался горячей струей воздуха, направленного на противоположную препарату сторону предметного стекла, одновременно капля клеточной суспензии распределялась по его поверхности.
Окрашивание хромосом
Использованные методики окрашивания хромосом можно разделить на два типа - рутинные и дифференциальные. К первым относится окрашивание красителем Гимза. К дифференциальным методам окрашивания относятся окрашивание нитратом серебра (Ag-метод), метод С-бэндинга и окрашивание ДНК-специфичными флюорохромами. Дифференциальные методы избирательно действуют на структуру хромосом, что позволяет контрастировать определённые структуры (гетерохроматические районы, кислые белки, последовательности пар оснований), а значит получить такую информацию о хромосомах, которая не доступна при использовании рутинных методов, обычно равномерно окрашивающих хромосомы.
Окрашивание красителем Гимза. Препараты в течение 0.5 - 2 часов окрашивались 6 - 12% раствором красителя Гимзы (Giemsa) приготовленном на буфере Соренсена (Макгрегор, Варли, 1986), pH 6.8, после чего стекла промывались в проточной, или в дважды сменяемой дистиллированной воде и высушивались при комнатной температуре.
Окрашивание нитратом серебра (Ag-метод) проводилось в соответствие с методикой, разработанной Ховелом и Блэком (Howell, Black, 1980). Этот метод служит для выявления районов ядрышкового организатора (ЯОР, или NOR) в ядрышкообразующих хромосомах. Ag-метод позволяет выявить в составе ЯОР кислые белки, содержание которых отражает функциональную (транскрипционную) активность данного района в предшествующей интерфазе.
В соответствии с методикой, на неокрашенный препарат наносились 2 капли проявляющего раствора (0.1 г желатина, растворённого в 0.5 мл дистиллированной воды и 0.05 мл. муравьиной кислоты (СНзСООН)) и
|
