СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ГПА - Глюкозо-пептонный агар
2. ДТ - Дизельное топливо
3. ИБ - Институт биологии
4. КГА - Картофельно-глюкозный агар
5. КЖ - Культуральная жидкость
6. КОЕ - Колониеобразующие единицы
7. МПА - Мясо-пептонный агар
8. р. - Род
9. РБ - Республика Башкортостан
10.СХП - Сухая препаративная форма
11 .УНЦ РАН - Уфимский научный центр Российской Академии Наук
12. А. — Azotobacter
13.Р. - Pseudomonas
{*.
(* ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Современное развитие биотехнологии способствовало появлению нового поколения высокоэффективных многофункциональных биопрепаратов, применяющихся в различных отраслях сельскохозяйственного и промышленного производства. Использование для создания таких препаратов природных штаммов микроорганизмов обеспечивает им высокую экологическую безопасность. Прогресс в производстве и применении биопрепаратов, во многом, связан с разработкой высокотехнологичных, сохраняющих долгое время их исходные свойства препаративных форм. Одним из наиболее удачных решений этой проблемы является производство биопрепаратов в порошкообразном виде, удобном для хранения, транспортировки и применения.
Разработка технологий производства сухих препаративных форм биопрепаратов, способных длительно сохранять жизнеспособность и функциональную активность клеток микроорганизмов различных системных групп является актуальной задачей современной биотехнологии.
Цель исследования. Разработка сухих препаративных форм микробиологических препаратов Ленойл (консорциум бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5), Елена (на основе Pseudomonas aureofaciens ИБ 51), Азолен (Azotobacter vinelandii ИБ 4).
Задачи исследования.
1. Разработать способ концентрирования биомассы микроорганизмов из культуральной жидкости, позволяющий сохранять на исходном уровне активность бактерий-антагонистов по отношению к грибным фитопатогенам.
2. Разработать технологию концентрирования биомассы микроорганизмов, составляющих основу биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен.
3. Исследовать в лабораторных условиях жизнеспособность и активность клеток бактерий, составляющих основу биопрепаратов, иммобилизованных на твердых носителях.
4. Разработать технологию получения сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен.
5. Оценить эффективность применения сухих препаративных форм биопрепаратов Елена, Азолен в полевых условиях для защиты пшеницы от болезней и повышения ее урожайности.
Научная новизна. Впервые предложен новый способ выделения
биомассы бактерий рода Pseudomonas, предусматривающий использование в
I* качестве флокулянта реагента Гивпан, обеспечивающий сохранение
антагонистической активности бактерий по отношению к грибным
фитопатогенам (Пат. РФ №2245916).
Изучены процессы концентрирования биомассы бактерий pp. Pseudomonas и Azotobacter при использовании реагента Гивпан, консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies ИБ ДТ-5 с применением флокулянта Каустамин-15.
Изучено влияние процесса иммобилизации клеток на жизнеспособность и функциональную активность бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, Azotobacter vinelandii ИБ 4, Bacillus brevis и Arthrobacter
. , spesies ИБ ДТ-5.
"г*
Практическая значимость. Разработана технология производства сухих препаративных форм биопрепаратов Ленойл, Елена, Азолен, в течение длительного времени сохраняющих жизнеспособность и функциональную активность микроорганизмов, составляющих их основу.
Совместно с предприятием-производителем ГУП "Опытный завод АН РБ" разработаны, согласованы с контролирующими организациями и утверждены технические условия на сухую препаративную форму биопрепарата Ленойл (ТУ 9291-020-22357427-2004).
Апробация работы. Основные результаты исследований были
ш
представлены на II Российской научно-практической конференции
"Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов " (Москва, 2003), семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003" (Пущино, 2003), II Всероссийской научной Internet-конференции "Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем" (Уфа, 2003), XVII Международной научно-технической конференции "Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2004), Международной (, научно-практической конференции "Биологическая защита растений - основа
стабилизации агроэкосистем" (Краснодар, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано И научных работ, в том числе 2 патента Российской Федерации.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Техногенная нагрузка на почву в последнее время интенсивно возрастает, снижая ее плодородие. Основными причинами этой ситуации являются широкое использование химических средств защиты растений и загрязнение почвы различными ксенобиотиками, в том числе нефтью и продуктами ее переработки.
1.1. Микробиологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов и повышения урожайности
Химико-техногенная интенсификация растениеводства обеспечивает высокие урожаи сельскохозяйственной продукции, но связана с опережающим ростом затрат материальных ресурсов и невозобновляемой энергии на единицу продукции, а широкое применение пестицидов вызывает загрязнение продуктов питания и окружающей среды вредными для живых организмов соединениями. Интенсивная антропогенная нагрузка нарушила природные сбалансированные процессы растительно-микробного взаимодействия в агрофитоценозах и привела к снижению плодородия и упрощению микробоценозов почвы. В сложившихся условиях для получения биологически полноценной продукции и сохранения плодородия почв необходимо создание и применение в растениеводстве микробиологических препаратов, улучшающих корневое питание растений, стимулирующих их рост, защищающих от болезней и вредителей.
На сегодняшний день, использование биопрепаратов вместо химических средств защиты или наряду с ними, зачастую еще не нашло массового применения, и многие примеры пока имеют отношение только к научным изысканиям ученых.
9
Развитие микробиологического метода защиты растений началось в 4 нашей стране с середины 70-х годов прошлого века. Тогда это направление
считалось очень перспективным, объемы применения биопрепаратов планировались весьма высокие. Так, в 70-80-е годы на заводах Бердском и "Прогресс" выпускали до 10 тыс. т микробиологических средств защиты растений. Эти препараты широко применялись в сельском и личных подсобных хозяйствах, лесном ведомстве, однако начиная с 1995 г. в связи с общей разрухой, и в сельском хозяйстве в частности, объем использования биопрепаратов стал значительно снижаться. Так, доля биометода в общем объеме защитных работ снизилась за 1994-2002 гг. с 20 до 4%. На этом фоне у. идет усиленная пропаганда химических препаратов, соответственно, растет
их импорт, тогда как в развитых странах отмечается противоположная тенденция (Ткачева, 2004).
Результаты анализа свидетельствуют о снижении объемов продаж пестицидов и затрат на разработку новых действующих веществ ведущими химическими концернами - в среднем с 9,4% (1998 г.) до 8,2% (2002 г.) от объема продаж в стоимостной оценке. Одновременно затраты на биотехнологические, селекционные и биологические исследования увеличились за этот период с 17,4 до 24,9%. Так, в 2002 г. крупнейшая на рынке средств защиты растений фирма "Байер" продала пестицидов на сумму 6001 млн долл., семян и биотехнологических продуктов, соответственно, - на 175 и 75 млн долл., затратила на проведение научных изысканий 665 млн долл., в том числе на исследования в области биологии — 166 млн долл. (The newsletter of Phillips McDouglall-AgriService, 2003)
Еще в 1994 г. коллегией Министерства сельского хозяйства России было принято "Постановление о мерах по расширению производства и применения биологических средств защиты растений", где отмечено, что биологическую защиту следует считать приоритетным направлением в интегрированной борьбе с вредителями и болезнями.
10
На сегодняшний день Госхимкомиссией разрешены к применению на территории Российской Федерации следующие биофунгициды и биоудобрения: Фитоспорин-М, Бактофит, Бинорам, Вермикулен, Псевдобактерин-2, Агат-25К, Планриз, Фитолавин-300, Триходермин, Азотовит, Бактофосфин, Байкал ЭМ-1, биоудобрение "Возрождение", Ризоторфин, Экстрасол, Ургаса, ФИТО Плюс (Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2001).
Бактерии p.Pseudomonas относятся к числу наиболее перспективных агентов биологического контроля заболеваний сельскохозяйственных ,* растений. Среди представителей этой группы микроорганизмов встречаются
не только антагонисты почвенных фитопатогенов (Osburn et al.,1989; Zaspel, 1989; Elsherif M, 1991), многие штаммы псевдомонад активно способствуют улучшению роста и развития растений (Пат. № 20511586 РФ; Pietr, 1987; Renato de Freitas, 1991). По данным ряда исследований известно, что, являясь типичными представителями ризосферы растений и обладая высокой скоростью роста, интродуцированные псевдомонады успешно колонизируют ризосферу растения-хозяина, вытесняя оттуда фитопатогенов (Caponlgro, 1986).
Возможность применения в сельском хозяйстве биологических средств _., защиты растений, в том числе и на основе бактерий p.Pseudomonas,
исследуется на протяжении десятков лет. Но только в последние годы, когда был накоплен колоссальный исследовательский материал по успешному применению бактерий-антагонистов в сельскохозяйственной практике, начались действительно широкомасштабные разработки технологий получения биопрепаратов различного назначения на основе микроорганизмов (Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы, 1997; Кузнецова, Филиппов, 1995; Сидоренко, 1996; Назарова, 2002).
11
На данный момент в России зарегистрировано всего три биопрепарата 4 на основе живых клеток штаммов бактерий p. Pseudomonas, используемых в
качестве средств биологической защиты растений (Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2001) : Планриз (на основе штамма Pseudomonas fluorescens АР-33), Псевдобактерин-2 (на основе штамма Pseudomonas aureofaciens BS 1393) и Бинорам (на основе группы штаммов Pseudomonas fluorescens 7Г, 7Г2К, 17-
2).
Одним из наиболее удачных отечественных препаратов на основе псевдомонад является Планриз (Ризоплан). Хотя механизм действия ризоплана авторами до конца не изучен, по литературным данным (Кузнецова, Филиппов, 1995), его влияние на растения, проявляющееся в улучшении прорастания семян, усилении роста и развития растений и, в конечном счете, повышении урожайности объясняется продуцированием сидерофоров, антибиотиков (типа феназина), регуляторов роста растений и способностью переводить фосфор в доступное состояние.
Спектр применения Ризоплана достаточно широк. По данным ВИЗР, БелНИИземледелия, Калининградской, Ульяновской, Тюменской, Томской, Карельской и многих других областных и республиканских станций защиты растений, Ризоплан подавляет развитие возбудителей твердой головни, бурой и стеблевой ржавчины, гельминтоспориозной, фузариозной, офиоболезной корневых гнилей зерновых, фитофтороза, парши, ризоктониоза, бактериозов, мокрой и сухих гнилей картофеля, бактериозов капусты, церкоспороза (Кузнецова, Филиппов, 1995; Назарова с соавт., 1995; Титаренко с соавт., 1995). В Краснодарском НИИ овощного и картофельного хозяйства хорошие результаты получены при использовании Ризоплана для предпосевной обработки семян репчатого лука, столовой свеклы, томатов (Сторожук с соавт., 1995). Недостатком этого препарата является жидкая препаративная
12
форма, не позволяющая сохранять функциональные свойства препарата в течении длительного времени.
В ИБФМ РАН (Пущино) были выделены перспективные штаммы микроорганизмов P. aureofaciens BS1393 (биопрепарат на его основе Псевдобактерин-2 (ПС-2)) и P. putida BS 1398 (биопрепарат на его основе Псевдобактерин-3 (ПС-3)). Использование смеси бактериальных препаратов ПС-2 и ПС-3 в Северо-Восточной части Украины в 1996 г. было эффективным против септориоза, бурой ржавчины, твердой головни пшеницы. Против мучнистой росы лучшие результаты получены при применении ПС-2, чем ПС-3 или их смеси (Долгова с соавт., 1997).
В 1993-1995 гг. биопрепарат Псевдобактерин-2 успешно использовали в тепличных хозяйствах для защиты огурцов и томатов от корневых и стеблевых гнилей; в Краснодарском крае получен положительный эффект от применения препарата для защиты яблонь от парши, а также при предпосевной обработке семян озимой пшеницы (Кочетков с соавт., 1997).
В тепличном хозяйстве КСХП «Россия» в 1996 г. проведены испытания комбинированного препарата на основе Псевдобактерина-2 с целью замены дорогостоящей термической стерилизации почвы. Комбинированный препарат содержал живые клетки трех штаммов бактерий p. Pseudomonas и двух - бактерий p.Azotobacter. Показано, что обработка почвы не уступает по эффективности пропариванию, но по стоимости в 5 раз дешевле (Кочетков с соавт., 1997).
Л.Н. Назарова (2002) в своей статье сообщает, что в Саратовской области на яровой пшенице Л-503 биологическая эффективность протравливания семян Агатом-25К в 1996 г. была 66%, 1997 г. - 70%, в 2000 г. - 71% при уровне развития пыльной головни соответственно 2,3%; 0,7%; 3,2 %, прибавка урожая составила 3,3-4,6 ц/га.
В Новосибирском аграрном университете разработана сухая форма препарата РИЦ на основе P. fluorescens (штамм В661). Согласно данным
13
испытаний, предпосевная обработка семян овса и томатов снижала степень поражения корневой системы овса Fusarium oxysporum и на 40-76% количество пораженных растений томатов. Эффективность против черной ножки составляла до 95%, против сухой гнили 67-93%, фитофторы - 64-72%. РИЦ полностью защищал картофель от мокрой гнили при исходной зараженности клубней фитофторой до 20% (Ермакова, Штершнис, 1994).
В 1993-1995 гг. проведены исследования по эффективности применения на картофеле биопрепарата на основе флуоресцирующих псевдомонад (P. fluorescens ssp., P. putida ssp. T-89) (препарат ПП) и различных видов азотобактера в смеси с бациллами и псевдомонадами (препарат СП). Биопрепараты способствовали повышению урожая картофеля. Эффективность их действия во многом определялась сортовыми особенностями картофеля и метеорологическими условиями года (Сидоренко с соавт., 1996).
Штамм Pseudomonas sp. B-6798 продемонстрировал свою эффективность в качестве основы биопрепарата для увеличения урожая льна и повышения его устойчивости к фузариозу (Гущина, Евдокимов, 2001).
С целью ограничения развития фузариозной корневой гнили семена пшеницы сортов Мироновская 808 и Артемовка обрабатывали штаммами бактерий P. aurantia 387, P. aureofaciens 2117, P. aeruginosa 1901, Pseudomonas sp. 19, Bacillus mesentericus 1701, Bacillus polumyxa 636 и полученными из них препаратами. Показано, что обработка семян пшеницы суспензиями бактерий и полученными из них препаратами повышала энергию прорастания и всхожесть семян, ограничивала развитие болезни в условиях вегетационных и полевых опытов, способствовала повышению продуктивности растений. Эти препараты были эффективнее, чем ТМТД или не уступали ему (Пидопличко, Гарагуля, 1986).
Изучение свойств бактерии рода Azotobacter, как PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) микроорганизмов, для создания биологических
^
14
препаратов на их основе показало, что они являются одними из эффективных стимуляторов для разных видов растений (Дегтярева с соавт., 2001; Sindhu et al, 1994; Антипчук с соавт.., 1985), что объясняется: их способностью фиксировать молекулярный азот, синтезировать витамины и гормоны роста (Олюнина с соавт. 1999; Gonzalez-Lopez et al, 1986; Lee et al, 1970); проявлять биоконтролирующую активность фитопатогенов, за счет продуцирования антибиотиков (Придачина с соавт. 1982; Kumari Lakshmi et al, 1972), а также ослаблять действие на семена неблагоприятных факторов (Лихолат с соавт., 2000).
Бактерии рода Azotobacter могут служить основой для производства бактериальных удобрений под различные сельскохозяйственные культуры -огурцы (Пат. РФ 2074157), томаты (А.с. СССР 1359272), зеленные культуры (Пат. РФ 2074159), амарант (Пат. РФ 2074158), ячмень (А.с. СССР 1316189). Кроме того, бактерии этого рода входят в состав биопрепаратов для повышения почвенного плодородия и урожайности сельскохозяйственных культур (Пат. РФ 2177466), получения регуляторов роста растений (Пат. РФ 2161884).
Так, положительное влияние азотобактера на прорастание и устойчивость к заболеваниям семян огурца было отмечено на уровне высокого инфекционного фона в условиях закрытого грунта (Антипчук с соавт., 1985). Инокуляция смешанной культурой, состоящей из штаммов псевдомонад и азотобактера, повысила урожай огурца на 44% (Егоров с соавт., 1994).
Ряд авторов указывает на стимуляцию развития и увеличение урожая томатов при обработке чистыми культурами азотобактера, а также на сокращение сроков созревания плодов. Причем бактеризация азотобактером совместно с известкованием и добавлением перегноя существенно повышала урожай по сравнению с контролем (Сергеева, 1960; Rosario, 1975; Aguilar et al., 1998 Aguilar et al., 1998;). При выращивании томатов на светло-серой
15
лесной почве с низким содержанием гумуса, фосфора и калия также отмечали улучшение качества урожая томатов, которое характеризовалось увеличением сухого вещества, общего сахара, витамина С, каротина. Была отмечена высокая устойчивость к фитофторозу и поражению бактериальной гнилью при обработке рассады азотобактером (Плетнева с соавт., 1998). Опыт по инокуляции посадочного материала томатов бактериями А. chroococcum показал, что по всем элементам структуры урожая, в частности, по количеству плодов и высоте растений, обработанные томаты превосходили контрольный вариант, кроме того, на обработанных растениях раньше появились плоды (Dibut et al., 1997).
Ряд исследователей отмечали прибавку урожая пшеницы при ее инокуляции азотобактером, связанную как с азотфиксацией, так и с действием ростстимулирующих веществ, продуцируемых микроорганизмами (Терехов с соавт., 1997; Нурмухаметов с соавт., 1998; Sindhu et al., 1994; Shanshoury, 1995; Rabie et al., 1995; Konde et al., 1996). В Индии проведены полевые испытания по изучению влияния минеральных, бактериальных и микоризных удобрений на элементы структуры урожая пшеницы. Среди биоудобрений наибольший прирост урожайности наблюдался при инокуляции азотобактером (30,6%), что сопоставимо с применением минеральных удобрений (29,7%). Наибольшая экономическая эффективность получена при применении комбинации минеральных удобрений и бактерий p. Azotobacter (Tomar et al., 1998). При использовании штамма азотобактера, мобилизирующего фосфор неорганических фосфатов, было отмечено значительное увеличение всхожести пшеницы (Kumar et al., 1999; Narala et al., 2000). Сообщается о стимуляции всхожести пшеницы культурой Azotobacter chroococcum, выделенной из ризосферы пшеницы, за счет способности данного штамма к растворению неорганических соединений фосфора (Kumar et al, 1999). Эффективность от предпосевной инокуляции пшеницы штаммом Azotobacter chroococcum 16, была сопоставима с
16
внесением 60 кг/га минерального азота на двух использованных сортах (Govedarica et al., 1997).
Значительный положительный эффект, проявляющийся в повышении всхожести, урожайности и качества корнеплодов, был отмечен при инокуляции семян свеклы культурами азотобактера. Сообщается, что внесение азотобактера с семенами сахарной свеклы способствовало повышению урожая и значительному накоплению общего и гидролизуемого азота. Прибавка общего азота в ризосферной почве достигала 200 мг на 1 кг почвы (Доросинский, 1965). Было выявлено положительное влияние бактеризации семян штаммом Azotobacter chroococcum на урожайность, сахаристость корнеплодов и выход сахара. Установлено, что применение бактериальных удобрений снижало содержание натрия и азота в корнеплодах, что способствовало повышению качества сахарной свеклы (Mrkovacki et al, 2001).
Другими исследователями было установлено, что эффективность бактеризации семян сахарной свеклы зависит от вида и штамма азотфиксирующих бактерий и сортовых особенностей сахарной свеклы. Так, прибавка урожая сорта Дана при обработке штаммами азотобактера составила 130-200 ц/га, также значительно увеличился выход сахара под действием Azotobacter chroococcum 201 и Azospirillum lipoferum 4 на 17,7 и 26,8 ц/га соответственно. Также было определено, что бактеризация диазотрофами снизила содержание натрия и аминного азота в корнеплодах, что способствовало улучшению качества продукции (Govedrica et al, 1999; Govedrica et al, 1997). Отмечается, что бактеризация семян азотобактером способствует повышению урожайности корнеплодов до 590 ц/га и выхода сахара - до 100 ц/га (Mrkovacki et al, 2002). Бактеризация семян сахарной свеклы штаммами A. chroococcum шт. 20, 77 и A. vinelandii 56 способствовала повышению азотфиксации в ризосфере, содержанию витаминов группы В, значительному увеличению урожая и снижению
17
развития грибных инфекций, причем обработка штаммом A. vinelandii имела лучшие результаты по всем показателям (Антипчук с соавт., 1997; Дегтярева с соавт., 2001).
В настоящее время в сельскохозяйственной области начинается использование микробиологических препаратов на основе микроорганизмов регулирующих рост растений. Известны микроорганизмы, обитающие в ризосфере, способные синтезировать цитокинины, представляющие собой наиболее активные среди открытых рострегулирующих веществ. Эти микроорганизмы могут быть основой ростстимулирующих препаратов используемых в области растениеводства. К таким микроорганизмам относятся представители родов Azotobacter (Barea, Brown, 1974; Azcon, Barea, 1975; Arshad, Frankenberger, 1991), Arthrobacter (Blondeau, 1974, 1985), Bacillus (Пат. РФ 2178970), Pseudomonas (Мишке, 1988), Streptomyces (Copolla, Giannattasio, 1968). Использование фитогормонов микробного происхождения в растениеводстве может быть перспективно при наличии штамма продуцента, обеспечивающего достаточно высокий уровень секреции внеклеточных цитокининов. Сотрудниками Института биологии УНЦ РАН из образца сточных вод биологических очистных сооружений "Орскнефтеоргсинтез", был выделен штамм Pseudomonas aureofaciens ИБ 6, отличающийся высокой продуктивностью секретирования цитокининов. В связи с этим этот штамм псевдомонад является весьма перспективным для создания на его основе биопрепарата, проявляющего ростстимулирующую активность по отношению к растениям.
В Институте Биологии УНЦ РАН также были разработаны биопрепараты комплексного действия Елена (на основе штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51) и Азолен (на основе штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4).
Использование биопрепарата Елена на пшенице, показало его высокую эффективность против гельминтоспориозной, альтернариозной, |
