5 ВВЕДЕНИЕ
Особую проблему в технологии получения продуктов пчеловодства вызывает увеличение количества неблагополучных пасек по различным заболеваниям в зонах повышенной антропогенной экологической нагрузки.
Существенным препятствием развития пчеловодства являются заразные болезни пчел, и в первую очередь, варроатоз, гнильцовые болезни, получившие в последние десятилетия широкое распространение на пасеках многих стран, в том числе и в республике Башкортостан.
Болезни различной этиологии сводят на нет усилия пчеловодов по использованию современных технологических приемов пчеловодства, обусловливают снижение продуктивности семей пчел, вызывают массовую гибель расплода и взрослых особей, задерживают рост и развитие семей.
Технологические и зоотехнические параметры здоровья семьи определяются равновесием гомеостаза, то есть количеством расплода, силой семьи, запасами корма, работой матки и условиями окружающей среды.
Рассматривая вопросы технологии производства продуктов пчеловодства, а также физиологических показателей семей пчел необходимо учитывать любое вредное воздействие, напряжение или состояние, делающее организм более восприимчивым к болезням (Смирнов A.M., 1993,1997).
Когда пчелиная семья теряет способность к эффективным предохранительным инстинктам: изгнанию больных особей, поведенческим реакциям, санитарной очистки сотов от травмированных личинок, пчелы становятся более восприимчивыми к различным болезням и признаки заболевания проявляются тут же.
Клещ Varroa jacobsoni Oudemans (1904) наносит вред взрослым особям пчелиной семьи в течении всего года, а в активный - и расплоду. В процессе паразитирования на медоносной пчеле (Apis mellifera mellifera) создает благоприятные условия для проникновения в ее организм патогенной микрофлоры — возбудителей бактериальных болезней.
6
Ассоциативное течение инфекции и инвазии обостряет патогенный процесс, наносит существенный экономический ущерб и, как правило, семьи погибают.
Отечественной и зарубежной наукой и практикой накоплен большой опыт по организации зоотехнических, лечебных, профилактических мероприятий в пчеловодстве. Несмотря на наличие разнообразных акарицидных средств, антибиотиков, изучение и использование нового поколения препаратов остается весьма актуальной задачей, ввиду повышения устойчивости возбудителей заболеваний пчел к имеющимся лекарственным средствам. Некоторые технологические вопросы остались нерешенными, требуют доработки и углубленного изучения.
Целью работы явилось изучение влияния отдельных поллютанов на жизнедеятельность пчелиных семей и разработка технологии оздоровления пасек от европейского гнильца на фоне варроатозной инвазии.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
- изучить влияние отдельных поллютантов на зимовку, весенне-летнее развитие и продуктивные показатели семей пчел и экстерь-ерные показатели рабочих пчел и трутней;
- выявить влияние препаратов на биологические и хозяйственно-полезные признаки пчел при европейском гнильце на фоне варроатозной инвазии;
- разработать технологии оздоровления пасек при ассоциативном течении болезней пчел;
- определить экономическую эффективность использования новых технологических подходов внедрения комплекса зоотехнических и лечебных мероприятий на пасеках.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые изучено влияние отдельных поллютантов на жизнедеятельность пчелиных семей. Для профилактики и лечения пчелиных семей от европейского гнильца предложен новый высокоэффективный бактерицидный препарат на основе фторированных хи-
7
нолонов, обладающий широким спектром антибактериального действия и проведена зоотехническая оценка. Разработаны новые технологические подходы снижения численности клеща варроа, позволяющие вести борьбу с вар-роатозом в весенний период и активно воздействовать на развитие пчелиных семей, продолжительность жизни рабочих пчел, выращивание расплода, медо-собирательную, гнездостроительную деятельность и качество зимовки пчелиных семей.
Научная новизна разработок защищена Патентом Российской Федерации на изобретение №2121789 от 20.11.98 года.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты в значительной степени дополняют имеющиеся данные об экологическом состоянии местности нахождения пасеки, могут использоваться в нормативно-технических документациях, при оценке зоотехнических хозяйственно-полезных признаков, характеризующих устойчивость к соответствующим условиям внешней среды, при разработке системы мероприятий по оздоровлению пасек, неблагополучных одновременно по варроатозу и европейскому гнильцу
В практическом отношении использование профилактических и лечебных комплексных методов позволяет оздоровить пасеку от европейского гнильца в условиях варроатознои инвазии, ускоренно наращивать силу пчелиных семей и максимально использовать пчел на главном медосборе.
Реализация результатов. По результатам исследований разработаны и утверждены: » 1. Технические условия на изготовление препарата апифлоцид
ТУ 9310-032-00008064-98, одобрено Ветфармбиосоветом РФ, протокол № 3 от 18.06.98 года;
2. Временное наставление по применению препарата апифлоцид при бактериальных болезнях пчел, утверждено Департаментом Ветеринарии МСХиПРФ, 17.07.98 года
8
Результаты исследований используются при чтении лекций и проведения лабораторно-практических занятий по пчеловодству и зоологии в Башкирском государственном аграрном университете.
Апробация работы. Основные теоретические и практические положения работы доложены и получили положительную оценку на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Башкирского ГАУ (1994-2003), Ученых советах ВНИИВСГЭ (г.Москва), расширенном заседании кафедры пчеловодства и зоологии Башкирского ГАУ, научно-практической конференции «Пчеловодство Башкортостана: «Состояние и проблемы», Уфа, 1997; научно-практической конференции «Актуальные проблемы животноводства Республики Башкортостан», Уфа,2000; Республиканских конкурсах пчеловодства, 2001, 2002; международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса регионов России.», Уфа,2002; международной научно-практической конференции «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО, XIII международной специализированной выставке «АГРО-2003», Уфа,2003; научно-практической конференции «Передовые технологии в пчеловодстве, Рыбное, 2003.
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы изложены в 8 статьях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических предложений. Список литературы включает 227 работ, в том числе 86 иностранных. Диссертация написана на 134 страницах, иллюстрирована 38 таблицами, 4 графиками.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Современные методы и средства борьбы при гнильцовых
болезнях пчел.
В последние годы вновь получили широкое распространение заболевания, под общим названием, гнильцовые болезни пчел. Гнильцовые болезни пчел вызывают гибель пчелиного и трутневого расплода, вызывая тем самым ослабление и гибель семей пчел.
В поисках средств борьбы с гнильцовыми болезнями пчел в различных странах испытывались различные химические и биологические препараты. Среди них имеются препараты, обладающие высокой бактерицидной активностью в отношении возбудителей этих болезней пчел. В последние годы с этой целью широко используются различные антибиотики, которые часто скармливаются пчелам с профилактической целью в виде, так называемых, стимулирующих подкормок для повышения продуктивности семей пчел. Бесконтрольное применение антибиотиков способствует загрязнению меда и других продуктов пчеловодства остаточными количествами препаратов, так как часть получаемого пчелами лечебного сиропа перерабатывется в мед (Аксенов В.И. и др., 1977; Головнев В.И., 1981; Горинова Л.П., 1976; Серра и др., 1983; Тис-се К. и др., 1976; Шакарян Г.А., Акопян З.М., 1973; Gilliemen М., 1975; Glinski Z., 1980; GonnetM., 1960; Rousseau M, 1962).
В России впервые применили антибиотики для лечения бактериальных болезней пчел в 1952 году. Использовали пенициллин при европейском гнильце в качестве лечебного средства в смеси с сахарным сиропом (Зябкин А.С., Полтев В.И., 1952).
Первые данные по определению чувствительности возбудителей европейского гнильца к антибиотикам из группы тетрациклина-окситетрациклина (террамецина) в пчеловодстве были опубликованы в 1952 году (Katznelson H., 1952; Gubler H.U. et. al., 1952; Gochnauer T.A.,1953). До настоящего времени
10
окситетрациклин является одним из основных антибиотиков для лечения бактериозов пчел (Гробов О.Ф. и др., 1987; Клочко Р.Т., 1990; Таши Ж. и др., 1975; Eckert F.A., 1961; Glinski Z. et. al.., 1979; Rousseau M., 1962). Успешно применяли для лечения европейского гнильца стрептомицин (Беспалько И.Г., 1955) и окситетрациклин (Katznelson Н., 1952; Gubler H.U., 1952; Moffet J., 1953; Wilson W.T., 1974).
Были испытаны лечебные действия эритромицина (Moffet J., 1953; Wilson W.T., 1974). Положительные результаты при американском гнильце были получены при применении стрептомицина, хлортетрациклина и синтомицина. В 1974 году положительные результаты показали испытания эффективности канамицина и бициллина-3 для лечения европейского гнильца пчел (Шакарян Г.А., 1981).
В пчеловодстве в дальнейшем для лечения гнильцовых болезней пчел находили применение и новые антибиотики - мономицин, неомицин, пасоми-цин, экмоновоциллин и другие (Куликов Н.С., 1961; Люцканов Д., 1971; «Методические указания по применению антибиотиков в ветеринарии», 1974; Руссо М., 1965; Саркисов А.Х., 1968; Тришкина Е.Т., 1983; Чанышев З.Г., 1961; Brizard A., 1961 и др.).
Полусинтетические антибиотики из группы тетрациклина испытыва-лись, начиная с 1981 года. Определена чувствительность возбудителей европейского гнильца пчел к метациклину (Шакарян Г.А., 1981), но в дальнейшем этот антибиотик не применялся для лечения пчел.
Анализ доступной нам литературы показал, что в настоящее время во многих странах мира, в том числе и в России для лечения болезней расплода пчел наиболее эффективными и чаще всего применяемыми являются антибиотики из группы тетрациклина - тетрациклин, хлортетрациклин, окситетрациклин. В Японии допольнительно используют полу синтетические производные окситетрациклина метациклин, доксициклин, диметилхлортетрациклин и ми-ноциклин (Oka H., et al.,1987).
11
Тетрациклины - антибиотики широкого спектра действия, обладающие высокой активностью in vitro в отношении большого числа грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий, микоплазм, спирохет, лептоспир, риккет-сий, хламидий. Группа тетрациклинов состоит из нескольких близких по химическому строению и биологическим свойствам антибиотиков. Основой молекулы тетрациклинов является полуфункциональное гидронафтаценовое соединение с родовым названием тетрациклин. Механизм действия заключается в угнетении белкового синтеза у микроорганизмов. Связываясь с субьедини-цей бактериальной рибосомы, тетрациклин подавляет энзимы, катализирующие присоединение аминоацил-т РНК к рибосомальным акцепторам (Тетрациклины, 1985).
Тетрациклины представляют собой желтые кристаллические вещества, обладающие амфотерными свойствами. На этом основана их способность образовывать соли с органическими и неорганическими кислотами, щелочными и щелочноземельными металлами. Они хорошо растворимы в этиленгликоле, пиридине, кислотах и щелочах, хуже в органических растворителях и воде. В сухом виде стабильны. Устойчивость в растворах зависит от рН среды - антибиотики наиболее устойчивы в кислой среде, в щелочной - их активность быстро снижается (Доксициллина гидрохлорид, 1987; Тетрациклины, 1985).
Устойчивость микроорганизмов к тетрациклинам in vitro развивается медленно по сравнению с другими антибиотиками (Талной Б., 1979).
В последние годы в мире отмечается выраженная тенденция к сокращению применения природных тетрациклинов и росту потребления их полусинтетических производных, так как процесс получения последних менее трудоемок и экономически выгоден. Из полусинтетических производных ок-ситетрациклина в нашей стране выпускаются метациклин и доксициклин (Тетрациклины, 1985). По своему строению они являются структурными аналогами окситетрациклина. Сохраняя спектр, тип и механизм действия, характерный для тетрациклинов, метациклин и доксициклин отличаются рядом преимуществ, основными из которых являются быстрое всасывание при
12
приеме внутрь, достижение высоких и длительно сохраняющихся концентраций в крови и органах, активность в отношении ряда штаммов некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, устойчивых к действию других тетрациклинов (Невашин СМ., Фомина И.П., 1982; Докси-циллина гидрохлорид, 1987; Zavarne J. et. al., 1984). Обладая рядом преимуществ, новые полусинтетические антибиотики нашли широкое применение в медицине. В ветеринарии, и в частности, в пчеловодстве, для лечения гниль-цовых болезней пчел они не применялись.
Несмотря на наличие разнообразных антибиотиков, изучение и разработка новых препаратов остается весьма актуальной задачей, ввиду постоянно возрастающей устойчивости возбудителей инфекционных болезней пчел к существующим лекарственным средствам.
Исходя из анализа вышеизложенных литературных данных по использованию лекарственных препаратов для борьбы с гнильцовыми болезнями пчел, следует отметить, что в пчеловодстве не используются антибактериальные химиотерапевтические средства на основе фторированных хинолонов. В современном арсенале синтетических бактерицидов нового поколения важное место принадлежит высокоэффективным препаратам хинолонового ряда, обладающих значительно более широким спектром активности (Смирнов A.M., 1998; Туктаров В.Р., 2000).
Механизм действия хинолонов принципиально отличается от механизмов действия используемых в настоящее время групп антибактериальных препаратов - пенициллинов, тетрациклинов, цефалоспоринов, аминогликози-дов, повреждающих микробную стенку или нарушающих синтез белка, что особенно важно для лечения инфекционных заболеваний, вызванных резистентными к этим препаратам штаммами.
Хинолоны проникают через клеточные мембраны и влияют на процессы размножения бактерий путем ингибирования бактериальной топоизомера-зы II (ДНК-гиразы) - фермента, отвечающего за разрыв и восстановление двойной спирали ДНК (Mitscher A., 1991). Согласно принятым представлени-
13
ям, в молекуле фторхинолонов можно выделить несколько доменов, ответственных за связывания с ДНК-гиразой, а также за проникновение в клетку. Молекулы хинолона связываются с ДНК, образуя сложный комплекс, в котором участвуют четыре молекулы хинолона, двойная спираль ДНК и ДНК-гираза. Образование такого комплекса препятствует восстановлению и раскрутке свернутой двойной спирали ДНК перед ее репликацией. Таким образом данный механизм принципиально отличается от механизмов действия других групп антибактериальных препаратов (Мокрушина Г.А., 1995; Фадеева Н.И., 1993).
СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ 6-ФТОРХИНОЛОН КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ. В современном арсенале антибактериальных химиотерапевтиче-ских средств важное место занимают антибиотики хинолонового ряда. Так, при лечении заболеваний, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, еще в 60-е годы широкое применение нашли налидиксовая кислота и ее аналоги (оксолиниевая, пиромидиевая кислоты). Однако эти соединения проявляли слабую активность в отношении псевдомонад, грамположительных штаммов бактерий и при лечении системных инфекций. Указанных недостатков лишены фторированные аналоги налидиксовой кислоты (Мокрушина Г.А. и др., 1991; Bouzardd et al., 1990). Высокая антибактериальная активность, широкий спектр действия этих соединений привлекли внимание ведущих фармацевтических фирм мира. В настоящее время создан ряд высокоэффективных хинолоновых антибиотиков третьего поколения: норфлоксацин ("Ке-рин" и "Мерк", 1983 г), пефлоксацин ("Рон Пуленк", 1985 г), ципрофлоксацин ("Байер", 1986 г), офлоксацин ("Дайичи", 1985 г и "Хехст", 1986 г) и многие другие. Структура клинически наиболее важных фторхинолонов приведена на странице 14.
14
соон
Фармакотропные группы в структуре фторхинолонов:
А - фрагмент, обеспечивающий проникновение фторхинолона в клетки, а
также связывание с ДНК-гиразой;
В - фрагмент, ответственный за самоассоциацию молекул фторхинолона; С - фрагмент, ответственный за образование водородных связей.
Клинически важные фторхинолоны общей формулы:
о
ХХУ
N
к-
соединение препарат X R1
1 Норфлоксацин сн с2н5
2 Пефлоксацин сн с2н5
3 Ирлоксацин сн с2н5
4 Эноксацин N с2н5
5 Амифлоксацин СН NHCH3
6 Флероксацин CF (CH2)2F
7 Ципрофлоксацин СН Ц-С3Н5
8 Энрофлоксацин СН Ц-С3Н3
9 Дифлоксацин СН 4-FC6H4
R7
Пиперазинил-1 4-Метилпиперазинил-1 Пирролил-1 Пиперазинил-1 4-Метилпиперазинил-1 4-Метилпиперазинил-1 Пиперазинил-1 4-Этилпиперазинил-1 4-Этилпиперазинил-1
15
Необходимость сохранения фрагмента 4-оксопиридин-З-карбоновой кислоты, а также атома фтора у С-6 хинолоновой системы определяет направление поиска новых фторхинолонов, который включает модификацию заместителей у атомов N-1 и С-2 в пиридиновом цикле, а также у С-5, С-7 и С-8 в бензольном кольце.
Механизм действия хинолонов заключается в проникновении через клеточные мембраны и влиянии на процессы размножения бактерий путем инги-бирования бактериальной ДНК-гиразы - фермента, отвечающего за разрыв и восстановление двойной спирали ДНК. В молекуле фторхинолонов можно выделить несколько структурных элементов, ответственных за связывание с ДНК-гиразой, а также за проникновение в клетку (Глушков Р.Г. и др., 1984; Мокрушина Г.А. и др., 1995).
1.2. Основные методы контроля антибиотиков, поллютантов в продуктах пчеловодства.
Обострение экологической обстановки в России - результат накопленных за многие десятилетия структурных деформаций народного хозяйства, доминирования ресурсоемких технологий, а также недостаточного внимания к работе по предотвращению вредного воздействия хозяйственной деятельности на человека и окружающую среду. Если положиться на волю стихии, наступающий экологический кризис приведет к таким необратимым изменениям природной среды, при которых человек, животные, в том числе и пчелы, и растительный мир не смогут нормапьно развиваться и существовать.
Этот вывод имеет первостепенную важность и для Башкортостана. Республика является одним из самых промышленно развитых регионов Российской Федерации. Концентрация промышленного производства существенно превышает общероссийские показатели, особенно в части размещения
16
предприятий нефтепереработки и химии. Десятилетиями, начиная с середины 30-х годов, на сравнительно небольшом участке территории строились крупнейшие в Европе нефтеперерабатывающие, нефтехимические предприятия, которые обусловили не только рост экономической мощи республики, но и создали ряд серьезных экологических проблем.
В Республике Башкортостан насчитывается более 3000 промышленных предприятий. Так, в 1995 году валовые выбросы загрязняющих веществ в атмосферу составили более 1,4 млн. тонн в год. Общий объем сбрасываемых сточных вод составил 702 млн. м3, в том числе загрязненных - 525 млн. м3. Выбросы Мелеузовского завода минеральных удобрений достигают уникального природного комплекса Бурзянского района и единственного в мире Заповедника диких бортевых пчел «Шульган-Таш». Отвалы горнодобывающих предприятий юга Башкортостана загрязняют тяжелыми металлами и ртутью почвы и воду Зауралья.
В настоящее время на Южном Урале, в частности в Республике Башкортостан остро стоит вопрос анализа и надежного контроля за экологическим состоянием продуктов пчеловодства.
Методы определения остаточных количеств пестицидов, антибиотиков, солей тяжелых металлов в различных субстратах и продуктах пчеловодства занимают важное место в комплексе мероприятий по охране окружающей среды, биомониторингу и защите пчел от отравлений.
Определение остаточных количеств препаратов незаменимо при подборе оптимальных схем, доз и способов внесения акарицидных и других препаратов в гнездо семей пчел, установлении ветеринарно-санитарной оценки товарной продукции пчеловодства, что имеет важное значение в профилактике вредного влияния ядохимикатов, антибиотиков на организм человека.
Особая роль в охране здоровья человека отведена методам определения пестицидов в связи с использованием их для обработок пчел при различных заболеваниях (варроатоз, акарапидоз, браулез и др.). При правильном применении отрицательное влияние препаратов на пчелиную семью, как пра-
17
вило, не наблюдается. Основную опасность для человека в данном случае представляет использование загрязненной акарицидами товарной продукции пчеловодства.
Обнаружение пестицидов в пробах меда, воска, перги требует их немедленного удаления из семьи с целью предотвращения дальнейшей гибели пчел. Такие продукты пчеловодства не допускаются в пищу человеку, а также для использования в медицине и косметике (Котова Г.Н., 1980; «Правила ве-теринарно-санитарной экспертизы меда», 1979).
На первом этапе для определения пестицидов в пчелах и продуктах пчеловодства были предложены биологические и колориметрические методы (Назаров С.С., 1967; Островский Н.И., 1954; Соловьева Л.Ф., 1970; Чистов В.Д., 1954 и др.).
Принцип биологического метода заключается в воздействии экстрактов из исследуемых объектов на чувствительных насекомых, рачков, белых мышей. Гибель этих животных указывает на присутствие в пчелах или продуктах пчеловодства ядовитых веществ. Преимуществом биологического метода является его чувствительность и универсальность. Однако универсальность является и основным недостатком этого метода, так как не позволяет установить природу ядовитого вещества.
Колориметрические методы основаны на образовании цветных комплексов, образующихся при воздействии определенных реактивов с одним или группой пестицидов. Недостатком колориметрических методов является их низкая чувствительность.
В последние годы широкое распространение получили хроматографи-ческие методы. Хроматография представляет собой процесс распределения составных компонентов разделяемой смеси между двумя несмешивающимися фазами - подвижной и неподвижной.
Метод хроматографии впервые предложен в 1903 году русским ученым Цветовым М.С.(1945), который использовал его для разделения растительных пигментов. |
