ВВЕДЕНИЕ
Байкал является крупнейшим центром видообразования многих организмов, в том числе турбеллярий, занимающих по числу видов четвертое место среди бентосных животных после амфипод, олигохет и моллюсков (Тимошкин, 1995). Настоящая работа является частью комплексных исследований систематики и филогении эндемичной фауны ресничных червей Байкала, проводимых в Лимнологическом институте. Для многих таксономически сложных групп турбеллярий представляется актуальным поиск дополнительных признаков, которые наряду с морфологическими характеристиками могут внести вклад в решение вопросов их систематики, эволюции и филогении. Один из таких признаков - кариотип, нередко являющийся надежным "маркером" вида, все шире применяемый в исследованиях турбеллярий. В последнее время входит в практику описание новых видов ресничных червей с привлечением сведений о кариотипе (Kawakatsu et al., 1984; Kawakatsu, Oki, Tamura, 1986; Curini-Galletti, Puccinelli, 1998). Известно, что изучение кариотипа не только имеет таксономическую значимость, но и дает ценную информацию для анализа проблемы видообразования. Использование кариотипических признаков часто оказывается полезным как для выяснения родственных связей между близкими видами (Лухтанов, Кузнецова, 1989; Gokhman, Timokhov, 2002; Петрова, Чубарева, 2004), так и для решения вопросов филогении таксонов более высокого ранга (Кузнецова, 1985; Petitpierre, 1997; Kuznetsova et al., 2002, 2004). Информация о кариотипах байкальских турбеллярий очень ограничена: единственным опытом изучения их хромосом являются работы H.A. Умылиной (1971, 1973, 1979), в которых представлены мейотические хромосомы 15-ти видов семейства Dendrocoelidae.
Для настоящей работы были отобраны роды Geocentrophora (Lecithoepitheliata, Prorhynchidae) и Bdellocephala (Tricladida, Dendrocoelidae), включающие наряду с байкальскими эндемичными "букетами видов" также
виды с более широким распространением, обнаружившие, согласно нашим предварительным данным, существенную дифференциацию по числу и морфологии хромосом. Байкальские представители Geocentrophora -хорошо изученная в морфологическом отношении группа, включающая 8 видов. Это сравнительно молодая, типично неоэндемичная фауна, сохранившая близкое морфологическое сходство с современными космополитическими видами этого рода. Около трети видов мировой фауны проринхид являются байкальскими эндемиками (Timoshkin, 1994). Систематика рода хорошо разработана (Тимошкин, 1984 а, б; Тимошкин, 1991), что позволило использовать эту группу в качестве модельной для постановки кариологических исследований байкальских турбеллярий и приложения их результатов для решения вопросов эволюции и филогении.
Род Bdellocephala - единственный неэндемичный род планарий, давший начало наиболее интересному очагу видообразования в Байкале (Порфирьева, 1977). Несмотря на то, что история исследования байкальских бделлоцефал начата Герштфельдтом почти полтора века назад (Gerstfeldt, 1858) и продолжена целым рядом замечательных исследователей - зоологов, систематический состав группы изучен недостаточно. Прежде всего, это связано с наличием трудно различимых морфологически близких форм, большим сходством в строении копулятивного аппарата - основного таксономического признака в систематике планарий - у многих бделлоцефал. Существуют и субъективные причины, связанные с тем, что одни авторы основывали свою классификацию на признаках внешней морфологии и окраски, другие совсем не имели живого материала и исследовали только гистологическое строение тех или иных органов. Поэтому кариологические исследования проводились нами параллельно с изучением морфологии, гистологии, а также структуры фрагмента гена 18S рРНК в целях таксономической ревизии и установления филогенетических связей внутри рода. Бделлоцефалы широко распространены в Евразии; многие из них
изучены кариологически (Dahm, 1963; Yagichaschi et al., 1998; Nishitani et al., 1995; Oki et al., 1998). Более половины видов бделлоцефал являются эндемиками Байкала.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось изучение строения хромосомных наборов турбеллярий родов Geocentrophora и Bdellocephala и особенностей эволюции их кариотипов, а также интерпретация полученных результатов для решения проблем систематики и филогении этих групп животных. Цель исследования определила следующие задачи:
1. Изучить и описать кариотипы эндемичных байкальских турбеллярий рода Geocentrophora.
2. Изучить особенности биологии и пролиферативных циклов байкальских геоцентрофор.
3. Изучить кариотипы и особенности экологии планарий рода Bdellocephala из Байкала и с Дальнего Востока, применить полученные данные в целях таксономической ревизии рода.
4. Сопоставить собственные и литературные данные о кариотипах исследованных видов с филогенетическими деревами, построенными на основе морфологических и биохимических признаков.
5. Сравнить пути и механизмы эволюции кариотипов в двух исследованных группах плоских червей.
Научная новизна. На основе полученных данных о кариотипах наряду с данными морфологических, биохимических и экологических исследований проведена таксономическая ревизия рода Bdellocephala. Для фауны Байкала описаны новые эндемичные виды В. roseocula и В. ushkaniensis (Тимошкин, Наумова, Новикова, 2001); виды В. melanocinerea и, В. stellomaculatd) переописаны с восстановлением видового статуса (Тимошкин, Наумова, Новикова, 2001, Novikova et al., 2002). Показана
самостоятельность вида В. agrillosa, ранее сведенного в синонимы В. angarensis. Впервые описаны кариотипы 14 видов и 25 цветовых форм свободноживущих плоских червей. У 6 видов Geocentrophora обнаружено 4 варианта хромосомных чисел: 2п=26, 2п=28, 2п=30 и 2п=32; число плеч хромосом (NF) у изученных видов варьирует от 36 до 60. Показано, что для исследованных видов признаки кариотипа являются видоспецифичными. Показано, что байкальские эндемичные представители Bdellocephala отличаются кариотипически от изученных видов бделлоцефал, населяющих Евразию - первые имеют 2п = 20, 24 и 26, в то время как последние - 2п = 16, 28 и 56.
Разработан экспресс-метод приготовления временных препаратов хромосом, позволивший впервые выявить особенности суточной динамики митотической активности у литоральных турбеллярий-проринхид. Установлена связь динамики пролиферативной активности с фотопериодичностью.
Комплексный подход к изучению двух родов эндемичных байкальских турбеллярий позволил составить представление о путях и механизмах их эволюции и о роли преобразований хромосомных наборов в становлении эндемичных «букетов» видов на примере исследованных групп.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые данные о кариотипах родов Geocentrophora и Bdellocephala, они применены для развитии концепции видообразования байкальской эндемичной фауны свободноживущих ресничных червей. Показана перспективность использования комплекса независимых методов и маркеров для решения вопросов филогении и систематики на примере двух родов турбеллярий. Результаты проведенных кариологических исследований создают базу для цитогенетического мониторинга изученных групп. Разработанные методики приготовления препаратов хромосом с обязательным учетом особенностей суточной динамики пролиферативной активности, необходимость которого
отражена в работе, могут быть рекомендованы для применения на других группах организмов.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на 5 международных и одном Всероссийском совещаниях, конференциях и симпозиумах: на международном совещании "Baikal as a natural laboratory for global changes" (Иркутск, 1994); на второй Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 1995); на VIII международном симпозиуме по биологии турбеллярий (Брисбан, Австралия, 1996); на III Всероссийском совещании по кариосистематике беспозвоночных животных (Москва, 1997); на третьей Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2000); на 43-ей международной конференции по Великим озерам ("Great Lakes, Great Rivers") (Корнвелл, Канада, 2000); на III международном симпозиуме "Speciation in ancient Lakes" (Иркутск, 2002). Результаты работы неоднократно докладывались и обсуждались на научных семинарах и отчетных сессиях Лимнологического института СО РАН в 1995-2004 гг и на заседании Отдела зоологии БПИ ДВО РАН в 2004 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы (191 источник, из них 122 на иностранных языках) и приложения. Работа изложена на 159 страницах, содержит 8 таблиц и 55 рисунков.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научным руководителям доктору биологических наук, профессору Валентине Григорьевне Кузнецовой (Зоологический институт РАН) и кандидату биологических наук Олегу Анатольевичу Тимошкину (Лимнологический институт СО РАН) за неоценимую помощь и внимание. Я глубоко благодарна сотрудникам лаборатории биологии водных организмов -кандидатам биологических наук Татьяне Яковлевне Ситниковой, Валентине Ивановне Провиз, Ольге Тимофеевне Русинек и Зое Васильевне Слугиной за
ценные замечания и постоянную поддержку. Моя искренняя признательность кандидату биологических наук Татьяне Владимировне Наумовой и Алене Александровне Широкой за каждодневную помощь и содействие. Я благодарна сотрудникам Лимнологического института -кандидатам биологических наук Наталье Григорьевне Мельник, Ольге Ивановне Белых и Антонине Валентиновне Натягановой за консультации по теме работы. Пользуюсь случаем выразить благодарность командам научно-исследовательских судов "Титов", "Верещагин" и "Обручев", а также всем замечательным водолазам, без которых был бы невозможен сбор байкальских турбеллярий. Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант N 98-04-49851).
10
Глава 1. Кариотипы турбеллярий и использование признаков
КАРИОТИПА В ЦЕЛЯХ ТАКСОНОМИИ И ФИЛОГЕНИИ
1.1. Кариотип как таксономический признак.
Каждый вид растений или животных имеет свой кариотип, то есть хромосомный набор клетки, характеризующийся определенным числом хромосом, определенной их морфологией и размером. Соматическая клетка содержит диплоидный зиготический набор, состоящий из пар гомологичных хромосом. Половым клеткам свойственен гаплоидный набор хромосом, гаметический, который представлен одним гомологом каждой пары хромосом.
Таксономическими называют признаки, по которым отличаются любые группы организмов, имеющие определенный ранг в иерархической классификации (Алиханян, 1985).
Основные задачи систематики точно определил A.A. Любищев (1971):
1) дискриминация - четкое разграничение соседних таксонов,
2) идентификация - надежное определение любого экземпляра на любой стадии развития, 3) систематизация - приведение всех таксонов в естественную систему. Решение этих задач зачастую бывает затруднено, например, тем, что применение морфометрического анализа не всегда дает возможность дискриминировать сходные формы, которые по биологическим признакам ведут себя как «хорошие» виды (Стегний, 1993).
Современная систематика характеризуется тем, что, с одной стороны, совершенствует традиционные подходы (морфометрические методы, статистическая обработка), а с другой стороны, привлекает новые методы. Привлечение гибридологического, хромосомного, биохимического методов зачастую в этих случаях способствует четкому разграничению видов. Однако, эти таксономические признаки отнюдь не универсальны и каждый из них имеет такие же (если не большие) ограничения, как и морфометрический.
11
То, что признаки кариотипа могут быть таксономическими признаками, стало ясно уже после первых работ по сравнительной кариологии и, в сущности, никогда не оспаривалось. Кариотип, несмотря на случаи хромосомного полиморфизма - один из наименее изменчивых таксономических признаков. В отличие от прочих соматических признаков организма, особенности хромосом, в основном, одинаковы во всех составляющих его клетках; они консервативны и не дифференцируются в ходе онтогенеза. В этом — надежность кариотипа как видового признака (White, 1973).
Основные черты хромосом, проявляющиеся в том или ином кариотипе, устойчиво передаются в ряду поколений при каждом митозе. Поэтому всякое изменение их структуры или числа будет сохраняться. Хромосомные перестройки появляются в гетерозиготном состоянии, а в потомстве гетерозиготных особей, в ряду поколений в результате встречи двух одинаковых гамет могут возникнуть уже гомозиготные по данному признаку формы. Если те или иные хромосомные изменения окажутся полезными для популяции, они будут поддержаны естественным отбором, что может дать начало новым расам, а в дальнейшем - видам. В ходе эволюции различные хромосомные изменения и изменения числа хромосом приводят к различиям между видами, т.е. служат факторами видообразования.
Во многих случаях, хотя и не всегда, кариотип может представлять собой видовой признак и, реже, признак таксонов надвидового или подвидового ранга.
Но кариотип, как и любой другой признак, не может претендовать на роль универсального видового признака - известно немало случаев межпопуляционных хромосомных различий (Curini-Galetti, Puccinelli, 1990; Tamura, Oki, Kawakatsu, 1988). С другой стороны, поскольку хромосомные различия имеют непосредственное отношение к видовым изолирующим механизмам (нарушение мейоза у гибридов и, вследствии этого, их бесплодие), то они часто оказываются полезными в тех таксономических
12
ситуациях, когда возникает вопрос, следует ли выделять какой-то таксон в самостоятельный вид. Существует 4 уровня работы систематика с таксонами:
1. Распознание подвидов
2. Различение близкородственных видов и видов — двойников
3. Группировка родственных видов в роды
4. Установление взаимоотношений высших таксонов (Мейер, 1971).
По отношению к этой классификации, кариологические данные находят применение прежде всего на втором и первом уровнях. В настоящее время, с накоплением объема кариологических данных и совершенствованием методов все большее значение они приобретают и для третьего и четвертого уровней.
Универсального хромосомного признака, имеющего таксономическое значение, вероятно, не существует. В одних случаях наблюдаются межвидовые различия в числе и морфологии митотических или мейотических хромосом (Лухтанов, 1993; Подгорнова, Дмитриева, Чиненков, 1979), в других отмечается высокий консерватизм этих параметров (Сиделева, Природина, Ханаев, 1995), иногда оба эти варианта можно наблюдать в одной группе видов. Тем не менее, крупные таксономические группы (подроды, роды, семейства) обычно существенно различаются по числу и морфологии хромосом.
Возможность использования тех или иных признаков в таксономических исследованиях во многом зависит от того, в какой мере они подвержены адаптивному действию отбора. Любые различия кариотипов в конечном счете обусловлены определенным числом хромосомных мутаций. Адаптационное значение хромосомных перестроек изучалось в основном на двукрылых и прямокрылых, в популяциях которых часто встречаются инверсии. Еще в 40-ых годах исследованиями Н. П. Дубинина, Г.Г. Тинякова и Т. Добржанского было установлено, что инверсии у дрозофил имеют определенное приспособительное значение и подвергаются действию
13
естественного отбора. Обнаружены географические, высотные и сезонные изменения инверсий у разных видов Drosophila (Дубинин, 1976).
Иное дело, если вопрос ставится об адаптивном значении не отдельных мутаций, но таких особенностей кариотипа, как число хромосом, соотношение числа двуплечих и одноплечих хромосом и т. д. Если адаптивное значение отдельных мутаций вполне вероятно, то их суммарный результат, то есть данный кариотип, совершенно не обязательно должен иметь какой-либо определенный смысл (Майр, 1974).
Выяснение филогенетических связей всегда сопряжено со многими проблемами - возможность полифилетического происхождения сравниваемых таксонов, параллельное или конвергентное развитие сравниваемых признаков. Степень риска при выборе признаков, используемых в целях таксономии и филогении, зависит от их видоспецифичности. У видов, которые лишены иных удобных морфологических признаков, кариотип часто остается единственным или наиболее достоверным диагностическим признаком.
Очевидно, что универсальных видоспецифичных признаков не существует. Только комплексный методический подход, принимающий во внимание некую совокупность биологических показателей, может повысить надежность филогенетических построений.
1.2. История изучения и основные результаты исследования хромосом турбеллярий.
Как показывает анализ мировой литературы, использование характеристик кариотипа в качестве таксономических признаков перспективно при таксономических, эколого-генетических, эволюционных исследованиях низших Metazoa вообще и ресничных червей в частности. Число хромсом турбеллярий не является консервативным признаком и варьирует в гаплоидном наборе от 2-3 у Gyratrix hermaphroditus Ehrenberg, 1831 (L'Hardy, 1986) до 19 у Phagocata fawsetti (Ball, Gourbalt, 1975). Если
14
имеет место полиплоидия, количество хромосом может достигать 96, как у гексаплоидных Phagocata velata ^Stringer, 1909) (Ball, Gourbault, 1975). ¦/ Имеются случаи появления дополнительных, или В - хромосом в кариотипах плоских червей, особенно многочисленные у планарии родов Dugesia и Microplana (Kawakatsu et al; 1988 a, Tamura et al, 1988; Deri et al, 1999; Batistoni et al, 2001). У многих видов турбеллярий описан соматический мозаицизм по числу хромосом. Планарии Microplana terrestris (Muller, 1774), у эудиплоидный кариотип которых состоит из трех пар хромосом (2п=2х=6), обнаружили широкую вариабельность в числе хромосом как внутри, так и между особями, которая интерпретируется исследователями как явление миксоплоидной гипердиплоидии (Ball, de Vries, 1983). У 17 планарии этого вида, подвергнутых кариологическому анализу, обнаружено 9 вариантов хромосомных наборов. Небольшое число хромосом основного кариотипа и проведенный кариометрический анализ позволили авторам установить, какие именно хромосомы продублированы на различных пластинках более чем в двух копиях и трактовать эти вариации как случаи трисомической анеуплоидии (рис. 1В, С), двойной трисомической анеуплоидии (рис. ID), тетрасомической анеуплоидии (рис. IE), тройной трисомической анеуплоидии и пентасомической анеуплоидии (рис. IF). Значение этих вариаций неизвестно.
Интересно, что другой вид планарии Polycelis auriculata Ijima et Kaburaki 1916 из Японии, базикариотип которого состоит из 3 пар хромосом, тоже обнаруживает высокую степень хромосомного полиморфизма в различных популяциях. Для этого вида описано 17 вариантов кариотипов, в это число входят варианты ди-, три-, тетра- и гексаплоидных наборов хромосом, некоторые образуются за счет делеций отдельных хромосом или одного-двух центрических слияний. У некоторых особей клетки разных тканей имеют одинаковый кариотип, у других обнаружены различные миксоплоидные мозаики внутри одной особи (Teshirogi, 1991).
15
в *
Рис. 1. Microplana terrestris. Рисунки 6 метафазных пластинок с различными наборами хромосом (Ball, de Vries, 1983).
В связи с частыми случаями вариабельности хромосомных наборов плоских червей как у разных особей одного вида или популяции, так и в тканях одной особи, становится ясна необходимость точного первичного описания эудиплоидного кариотипа с привлечением достаточно обширного материала. Данные о числе и морфологии хромосом помогают решить многие вопросы в таксономии турбеллярий. Наряду с другими признаками характеристики кариотипа используются при филогенетических реконструкциях, служат критерием правильности филогенетических схем, построенных, как правило, на основе морфологических данных (Kawakatsu et al, 1988 b, 1989).
16
В соответствии с появлением и совершенствованием методов исследования хромосом в истории изучения кариотипов турбеллярий можно выделить несколько особенных дат и этапов. Первые исследования в этой области были предприняты Арнольдом и Маттиесоном (Arnold, Mattieson, 1909) на Dendrocoelum lacteum ((Muller 1774)'.
В течение первого этапа, несмотря на его продолжительность (1909-1952 гг.), исследования хромосом оставались единичными, определение их количества — часто неточным; качество кариологических препаратов было низким. И все же в это время началось накопление данных о кариотипах и приобретение опыта кариологических исследований ресничных червей. В значительной мере это заслуга таких авторов, как Пеннипакер (Pennypacker, 1938, 1949) иБеназзи (Benazzi 1948, 1951).
Второй этап был коротким и длился от 1952 до 1958 года. В это время происходит значительный прогресс в развитии общей методики кариологических исследований. В становление современных методов приготовления препаратов хромосом значительный вклад внесли такие усовершенствования, как получение суспензии клеток и обработка их в гипотоническом растворе (Hsu, 1952), применение в качестве фиксатора спирт-уксусной смеси (Sachs, 1953), предварительное колхицинирование ткани (Ford, Hamerton, 1956) и воздушное высушивание препаратов (Rothfels, Siminowich, 1958). Усовершенствование методов позволило получать гораздо более качественные препараты хромосом.
Третий этап длился с 1958 по 1975 год. Благодаря достижениям предыдущего этапа становится возможным детальное описание кариотипа (размеров и морфологии всех хромосом). Это был период значительного прогресса в кариосистематике турбеллярий. Быстро увеличивалось количество изученных в отношении кариотипа видов, цитологические методы активно применялись для таксономической работы учеными разных стран и школ: итальянцами М. Беназзи и И. Пучинелли (Benazzi, Puccinelli, 1963, 1973); шведским зоологом А. Дамом и его учениками (Dahm, 1960,
17
1963; Dutrilleux, Lenicque, 1971) и другими. Для работы с хромосомами турбеллярий исследователи создают собственные модификации общепринятых методик приготовления кариологических препаратов (Sharma, Sharma, 1965; Ball, Gourbault, 1975; Oki et al, 1980, 1991).
На четвертом этапе (1975 - ) характеристики кариотипа используются как критерии общности происхождения морфологически близких видов /(kawakatsu, Sugino, Oki et al, 1984; Kawakatsu, Takai, Oki et al, 1986; Умылина, 1971); при осуществлении меж- и внутрипопуляционных исследованиий (Oki et al, 1980; De Vries, 1986; Curini-Galletti, Puccinelli, 1987); при филогенетических реконструкциях (Kawakatsu, Oki, Tamura et al, 1988; Kawakatsu, Mitchell, Oki et al, 1989; Martens, Curini-Galletti, Puccinelli, 1989; Curini-Galletti, Martens, 1990; Kuznedelov, Ishida, Nishitani, 2000). Почти каждое описание нового вида планарий сопровождается информацией о его кариотипе.
Несмотря на то, что история исследований хромосом ресничных червей насчитывает уже более 90 лет, эту группу в целом нельзя считать хорошо изученной в кариологическом и особенно в кариосистематическом отношении. По некоторым группам (сем. Planariidae, сем. Dugesiidae, сем. Bipaliidae и др.) сведения о кариотипах довольно обширны, другие же таксоны остаются абсолютно неизученными. Исследования хромосом турбеллярий относятся, в основном, к двум первым уровням кариологии по классификации М. Дж. Уайта (White, 1978). Согласно этой классификации, существует 6 уровней кариологических исследований. Под альфа-кариологией он понимает определение лишь числа и относительных размеров хромосом. Бета-кариология подразумевает изучение относительной длины плеч хромосом и локализации центромер. Гамма-кариология использует методы дифференциальной окраски хромосом и картирует в последних специфические участки. Дельта, эпсилон и дзета - уровни связаны с применением методов молекулярной биологии.
|
