Введение.
Актуальность проблемы. Современный уровень развития науки и техники ставит ряд задач по созданию нового поколения полимерных веществ и материалов. В настоящее время не достаточно придать полимерам те или иные химические или физико-механические свойства, такие как механическая прочность, эластичность, устойчивость к действию агрессивных сред и т. д., а во многих случаях требуется создать полимеры, направленно изменяющие свои свойства в процессе эксплуатации. К таким полимерам, получившим название «умные», относятся материалы и системы, способные изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды, например, температуры, рН, освещенности, появление в окружающей среде какого-либо химически или биологически активного соединения в определенной концентрации и т.д.
Одной из наиболее перспективных областей применения таких материалов является химия медико-биологических полимеров. Это, прежде всего, открывает большие возможности в плане создания материалов, способных моделировать отдельные функции некоторых органов и тканей живого организма, то есть активно функционировать в такой сложной, многокомпонентной среде, как живой организм. Активное функционирование подразумевает способность воспринимать информацию, поступающую извне, и изменять свои свойства в соответствии с ней. Очевидно, что эта способность, характерная, в основном, для «живой» материи, может быть придана синтетическим полимерам путем связывания их с соответствующими биологически активными соединениями (БАС). Использование такого подхода позволяет уже на современном уровне развития науки создавать полимерные композиции, моделирующие мышцы, изменяющие свои размеры под
6
действием внешних условий, кожу, способную к самообновлению, модели почек, избирательно выводящие токсичные соединения из организма и др.
Иммобилизация БАС на полимерном носителе позволяет вплотную подойти и к решению еще одной актуальной задачи современной химии медико-биологических полимеров - контролируемому выделению лекарственных препаратов (ЛП) из специально созданных «депо» по мере возникновения в них потребности, а также к повышению избирательности действия лекарственных веществ на ключевую стадию поражения.
Применение макромолекулярных носителей может позволить использовать альтернативные пути введения известных лекарственных препаратов, более физиологичные и комфортные для человека. Последнее особенно важно для белковых и полипептидных препаратов, которые невозможно вводить в организм через пищеварительную систему, где они подвергаются ферментативному гидролизу и расщепляются до составляющих их аминокислот.
Актуальность работы определяется также задачами возможного применения в клинической практике изделий на основе синтезированных материалов, включая системы для контролируемого выделения лекарств и их направленного транспорта, в том числе, основанные на механизме обратной связи, новые лекарственные формы для защиты лекарств от агрессивной среды живого организма, биологически активные покрытия на раны и ожоги и т.д.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось:
- разработка подходов к созданию биологически активных полимерных систем, целенаправленно изменяющих свои характеристики при изменении параметров окружающей среды и активно воздействующих на эти параметры по механизму обратной связи;
- разработка методов синтеза полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, и
7
создание на их основе универсальных систем для направленного транспорта БАС;
- разработка приемов и методов получения полимерных матриц, обеспечивающих не только направленный транспорт иммобилизованных в их объеме БАС, но и защищающих эти соединения от денатурирующего воздействия окружающей среды.
Решение конкретных биомедицинских задач потребовало провести ряд фундаментальных исследований в области химии высокомолекулярных соединений и биохимии, в частности, изучить процессы, происходящие при иммобилизации БАС, и определить основные параметры взаимодействия иммобилизованных БАС с их физиологическими субстратами; выяснить влияние химической природы и молекулярных характеристик полимера-носителя и состава окружающей среды на эти параметры; исследовать конформационное поведение синтетических полимеров и иммобилизованных на них БАС при различных условиях их функционирования; разработать научные основы создания полимерных носителей, способных избирательно концентрироваться в определенном участке организма, а также носителей, обеспечивающих одновременно защиту содержащихся в них белковых препаратов от ферментативного гидролиза и их направленный транспорт.
В связи с поставленными задачами основное внимание в работе было уделено следующим объектам исследования:
1) синтетическим полимерам, макромолекулы которых могут изменять конформацию в требуемом направлении, т.е. выполнять «умную» функцию;
2) природным полимерам, биоспецифические свойства которых определяются способностью их макромолекул взаимодействовать с определенными физиологическими субстратами;
8
3) полимерным матрицам, в которых БАС не связано с полимером, а самой матрице изначально приданы биоспецифические свойства или эти свойства возникают в процессе эксплуатации.
Научная новизна и практическая ценность работы. Решение поставленных задач позволило сформулировать и экспериментально проверить на широком круге объектов системный подход к созданию нового поколения полимерных материалов, способных воспринимать поступающую извне информацию и изменять свои свойства по механизму обратной связи в ответ на изменения определенных параметров окружающей среды.
В работе впервые:
1) изучено поведение полимерных производных белков, обладающих нижней критической температурой смешения (НКТС), вблизи точки фазового перехода и показано, что фазовому расслоению предшествует изменение конформации макромолекул, которое приводит к их ассоциации и образованию нерастворимой фазы;
2) обнаружена зависимость НКТС и биологической активности полимерных производных белков не только от соотношения белок/полимер-носитель, но и от конфигурации этих производных;
3) предложен подход к созданию макромолекулярных терапевтических систем, повышающих устойчивость полипептидов к ферментативному гидролизу и обеспечивающих направленный транспорт полипептидов в кровоток через пищеварительную систему;
4) изучен процесс химической модификации полипептидов соединениями, обеспечивающими их направленный транспорт, и продемонстрирована зависимость активности синтезированных производных от химической природы полипептидов, а также конформации и размеров их макромолекул;
9
5) предложено использовать биоспецифические взаимодействия для направленного транспорта гидрогелевых частиц и предварительно введенного в них, но химически с ними не связанного полипептида;
6) на основе сополимеров акриламида с N-(2-D-hik>ko3)-акриламидом, сшитых конканавалином А, созданы химические системы, работающие по механизму обратной связи и способные выделять предварительно введенный в них инсулин в ответ на достижение определенной концентрации глюкозы в окружающей среде;
7) обнаружено, что при взаимодействии таких гидрогелей с растворами глюкозы различной концентрации, существует пороговая концентрация глюкозы, при достижении которой наблюдается быстрый переход гидрогеля в растворимое состояние с эмиссией инсулина, и определены значения пороговой концентрации для сополимеров различного состава.
Разработанные основы создания и применения биоспецифических полимерных материалов, способных целенаправленно изменять свои свойства по механизму обратной связи в процессе эксплуатации, позволяют вплотную подойти к решению некоторых принципиально важных проблем современной химии медико-биологических полимеров. В первую очередь это относится к решению проблемы направленного транспорта лекарственных веществ путем их иммобилизации на полимерах с НКТС и последующего нагревания мишени до температуры, выше НКТС. Другой решаемой проблемой является проблема контролируемого выделения биологически активного вещества. Нами разработаны подходы к созданию полимерных систем, выделяющих заданное количество биологически активного вещества не только в ответ на изменение температуры или рН окружающей среды, но также реагирующих на изменение концентрации глюкозы, то есть способных моделировать функцию поджелудочной железы - выделять определенное количество
10
инсулина в ответ на появление определенного количества глюкозы в окружающей среде.
Сформулированные в работе подходы к направленному транспорту полипептидов с одновременным повышением их устойчиврсти к ферментативному гидролизу путем их ковалентного связывания с ингибиторами ферментов или путем физической иммобилизации в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибитором ферментов, могут быть использованы при создании полипептидных лекарственных препаратов для перорального применения.
Практическая значимость некоторых частей работы подтверждена патентами РФ, положительными результатами экспериментов на животных и клиническими испытаниями.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном семинаре «Инсулин: получение, производство, применение» (Минск, 1995); Первой и Второй Международных конференциях «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Санкт-Петербург, 1996, 1998); European Symposium «Formulation of poorly-available drugs for oral administration» (Paris, 1996); Международной конференции «Фундаментальные проблемы науки о полимерах» (Москва, 1997); Четвертом и Пятом Симпозиумах «Химия протеолитических ферментов», (Москва, 1997, 2002); Третьей Белорусской научно-практический конференции «Эфферентные и физико-химические методы терапии» (Могилев, 1998); The 26th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials (Boston, 1999); 1st Workshop of Young European Scientist (Lodz, 2002), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2004, 2005, 2006), 22-ом и 23-ем Симпозиуме по реологии (Валдай, 2004, 2006), конференции "MedBioTech-2006" (Москва, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 статей в научных журналах, получено 2 патента Российской Федерации,
11
опубликовано 16 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Личный вклад автора. Автор является инициатором выбора направления данного исследования, лично проводил работы по синтезу полимерных производных биологически активных соединений, изучению их строения и свойств. Разработал новый методический подход к созданию универсальных транспортных систем направленного транспорта биологически активных соединений. Автор принимал непосредственное участие в проведении экспериментов на животных и клинических испытаниях.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 211 страницах печатного текста и включает 59 рисунков, 43 таблицы и 13 схем. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (298 наименований).
12
ГЛАВА I.
Некоторые подходы к созданию полимерных систем для направленного транспорта лекарственных препаратов.
Создание лекарственных препаратов направленного действия (ЛПНД), относится к наиболее бурно развивающейся области химии медико-биологических полимеров. Только на последнем (2006 года), ежегодно организуемом обществом «Controlled Release Society», симпозиуме было представлено более 500 докладов, посвященных проблемам контролируемого выделения лекарств и создания ЛПНД. Это общество объединяет более 2500 членов из почти 50 стран, и примерно 2/3 его членов являются представителями промышленности.
Первая модель ЛПНД, предложенная еще в начале прошлого века П. Эрлихом [1], предполагала прямую связь лекарства с носителем и нашла свое успешное воплощение в работах, связанных с использованием моноклональных антител одновременно в качестве и векторов, и носителей [2-4]. В дальнейшем эта модель была модернизирована X. Ринге дорфом [5], и в ее состав были включены блоки, обеспечивающие растворимость и узнавание мишени (вектор), а также лекарство, присоединенное к полимеру через специальные вставки - спейсеры. Все блоки были объединены полимером-носителем, поэтому вся система представляла собой единое макромолекулярное образование.
Модель X. Рингсдорфа основана на представлении об аддитивности свойств компонентов, входящих в состав ЛПНД: физико-химические характеристики системы определяются в основном полимером-носителем, а биологическая активность — остальными компонентами, включая лекарство. Возможность варьировать структуру полимерного носителя и изменять взаимное расположение компонентов ЛПНД позволяли в широких пределах регулировать фармакологические и фармокинетические свойства ЛПНД [5].
13
Дальнейшее развитие работ в этой области сводилось, в основном, к поиску подходящих полимеров-носителей, отвечающих все более возрастающим требованиям к таким полимерам, и молекул-векторов, в минимальной степени изменяющих свойства входящих в систему компонентов и более избирательно взаимодействующих с органом-мишенью или даже отдельными клетками. Много усилий было уделено выяснению основных закономерностей взаимодействия ЛПНД с тканями живого организма и изучению путей вывода всей системы или отдельных ее компонентов из организма. Среди принципиальных решений, появившихся за это время, следует отметить разработку методов повышения эффективности использования вектора за счет большего насыщения ЛПНД биологически активным компонентом, а также использование «умных» полимерных носителей, изменяющих свою конформацию при незначительных изменениях параметров окружающей среды и поэтому способных одновременно с функцией носителя выполнять роль молекулы-вектора.
К полимеру-носителю предъявляется ряд специфических требований, таких как растворимость в воде, нетоксичность и биосовместимость, наличие функциональных групп, к которым в достаточно мягких условиях можно присоединять все входящие в систему блоки (как правило, это группы —ОН, —NH2, —СНО, —СООН).
ММ и ММР полимера-носителя определяют длительность циркуляции всей системы в кровяном русле. С одной стороны при необходимости попадания ЛПНД внутрь клеток посредством эндоцитоза полимер-носитель должен иметь достаточно высокую ММ, с другой стороны, для выведения через почки ММ должна быть сравнительно низкой. Экспериментальным путем было установлено, что минимальная ММ полимера-носителя должна быть не ниже 20000, а максимальная - не выше 80000 [6]. При этом предпочтение отдается биодеградируемым полимерам, наиболее легко выводящимся из организма [7]. В качестве
14
таких полимеров наибольшее распространение нашли полисахариды, такие как декстраны, крахмал и их производные, которые не обладают острой или хронической токсичностью, а наличие в их макромолекулах большого количества функциональных групп облегчает присоединение активных компонентов [8]. Для иммунодепрессантов и канцеролитических средств в качестве полимеров-носителей используют транспортные белки [9].
Следует отметить, что идеального полимера-носителя, полностью удовлетворяющего всем перечисленным требованиям, пока нет и, вряд ли, он будет синтезирован. Применяемые в настоящее время для направленного транспорта полимерные носители обычно разделяют на два типа: водорастворимые синтетические и природные полимеры и коллоидные системы - полимерные частицы и липосомы. Однако существуют носители, не укладывающиеся в такую классификацию. Так, предложено, например, использовать в качестве носителей сложные полиионные мицеллы, образующие в водных средах пары противоположно заряженных блоксополимеров с полиэтиленгликольными сегментами [10], а также гидрогели [11].
Одним из наиболее распространенных классов известных водорастворимых полимеров является декстран и его производные, которые хорошо зарекомендовали себя в биологическом плане: они практически не токсичны и не антигенны, способны к биодеструкции [12-14]. Наличие в декстране большого количества гидроксильных групп обеспечивает возможность его модификации; так модификация карбоксиметилдекстрана остатками Сахаров (галактозы и маннозы) позволила получить новый полимерный носитель для направленного транспорта [14].
Большие надежды возлагались на использование в качестве носителей белков и, в первую очередь, сывороточного альбумина, глобулинов и антител. Так, например, в экспериментах in vivo сывороточный альбумин, связанный с остатками галактозы или глюкозы,
15
обеспечивал направленный транспорт к клеткам печени связанных с ним лекарств [15]. Однако применение белков зачастую ограничено необходимостью в каждом конкретном случае детального изучения их иммунологических (антигенность, иммуногенность), фармакологических (стабильность, растворимость) и биофармакологических (абсорбция, распространение, метаболизм) свойств [16].
С этих позиций достаточно перспективным представляется использование полиаминокислот, например, поли-а-Ь-глутаминовой кислоты, как упрощенной модели белка [17-20]. В большинстве случаев токсичность их невелика, а антигенные свойства выражены достаточно слабо. Сополиконденсацией различных аминокислот и пептидов удается синтезировать носители с требуемыми функциональными группами и необходимой гидрофильностью [17, 18]. Полиаминокислоты биодеструктируемы и распадаются в организме до биогенных низкомолекулярных соединений. Например, использование в качестве носителя а,р-поли-1Ч-гидроксиэтил-ВЬ-аспартамида позволило получить макромолекулярную форму противоракового препарата Цитарабина, которая обладала высокой стабильностью и нашла применение при противопухолевой хемотерапии [21].
Из других гетероцепных полимеров можно выделить довольно широкий круг биодеструктируемых полиуретанов, подверженных как ферментативному, так и неферментативному гидролизу в средах живого организма и полученных посредством использования моно-, ди- и полисахаридов в качестве гликолей при поликонденсации с различными изоцианатами [22]. Гетероцепные полимеры, содержащие в основной цепи звенья аминокислот и пептидов (полиамиды, полиуретаны, полимочевины и полиэфиры), синтезируемые методом «активированной поликонденсации», подвержены ферментативной деструкции, благодаря наличию в их макромолекулах звеньев природных соединений, содержащих связи СО—NH, СО—О и др. [23, 24]. Большой интерес
16
представляют полимеры, полученные методом «активированной конденсации» полиамида на основе пирромеллитового диангидрида и Na,N -бис-три-метилсилильных производных алкиловых эфиров L-лизина общей формулы:
соон
- СОЧ /CO-NH-CH-(CH2)4-NH-"
(CH3)-Si-OOCx v €OO-Si-(CH3)3
-'х
Такие полимеры подвергаются "самоуничтожению" за счет гидролиза, катализируемого внутримолекулярной орто-карбоксильной группой [25, 26].
Несмотря на высокую гидролитическую устойчивость и практически полную неспособность к биодеструкции, карбоцепные полимеры вследствие простоты синтеза и больших возможностей варьирования структуры с целью введения необходимых функциональных групп также достаточно широко применяются в качестве носителей. Одни и те же функциональные группы могут быть использованы как для придания растворимости ЛПНД, так и для присоединения лекарственных препаратов. Однако более удачным представляется разделение солюбилизирующих и связывающих лекарства групп (ОН, NH2, CHO, СООН и др.). Синтез сополимеров гидрофильных, но не функциональных мономеров (винилпирролидона, замещенных акрилатов и акриламидов) с мономерами несущими указанные выше функциональные группы (аллиламин, акролеин, кротоновый альдегид, акриловая, метакриловая кислоты и т.д.), позволяет регулировать количество связывающих групп, а в ряде случаев также и их распределение по полимерной цепи. Это позволяет минимизировать пространственные трудности, возникающие в результате кластерного связывания лекарства в ходе полимераналогичного превращения. Кроме того, проблемы растворимости для сополимеров
17
решаются проще, чем для гомополимеров (создание необходимого гидрофильно-липофильного баланса достигается варьированием состава сополимера).
В последние годы были предложены новые подходы к созданию биодеградируемых карбоцепных полимеров. Способы получения таких полимеров заключаются в ковалентном связывании небольших карбоцепных блоков посредством «вставок» из лабильных биодеструктирующих участков. К таким полимерам можно отнести полиуретаны на основе 1,6-гексаметилендиизоцианата и сложных олигоэфиргликолей полидиэтиленгликольсукцината, полиэтиленгликоль-диадипината и полидиэтиленгликольсебацината с этиленгликолем в качестве удлинителя цепи, которые подвержены биодеструкции под воздействием тканевых ферментов [27]. Использование сополимеров полиэтиленгликоля и полимолочной кислоты позволило получить синтетические биодеструктируемые системы для выделения морфогенетических белков, способствующих формированию костной ткани [28].
Существенным ограничением большинства рассмотренных ЛПНД является невысокое содержание в системе активного лекарственного начала: для направленного транспорта необходимо каждую молекулу биологически активного соединения модифицировать, по крайней мере, одной молекулой вектора. Повышение эффективности использования вектора, то есть повышение соотношения БАС : вектор, можно добиться либо путем предварительной ассоциации молекул БАС между собой и последующим связыванием ассоциата с носителем, либо иммобилизацией вектора на поверхности мицелл или микрочастиц, содержащих большое количество БАС.
В качестве первого подхода рассмотрим ЛПНД на основе ионов металлов [29, 30]. Известно, что изотопы некоторых металлов применяют для радиоиммунодиагностики и радиоиммунотерапии. Для связывания с
|
