I. Введение.
Вкус наряду со зрением, осязанием, слухом и обонянием является одним из пяти основных чувств, участвующих в восприятии информации об окружающем нас мире. Основной функцией вкусовой системы является оценка качества пищи, проверка ее съедобности. Так, в ходе эволюции млекопитающими была развита высокая чувствительность к горькому, так как большинство горьких веществ являются ядовитыми, с другой стороны, имеющие привлекательный (т.е., сладкий) вкус вещества являются высококалорийными. Считается, что человек способен различать пять базовых вкусов: кислый, соленый, сладкий, горький и умами (umami), который вызывается глютаматом и некоторыми другими аминокислотами. Поведенческие эксперименты, а также регистрации активности вкусовых нервных волокон свидетельствуют о том, что вкусовой анализатор животных так же способен различать эти базовые вкусовые модальности. Это предполагает существование специфических молекулярных структур на рецептирующей поверхности вкусовых клеток, которые отвечают за отдельное распознавание каждого вкусового стимула. Исследования вкусовой системы методами молекулярной биологии подтверждают, что это действительно так. В частности, в последние годы идентифицированы мембранные рецепторы для сладких и горьких веществ и аминокислот, вызывающих умами (umami) вкус. Тем не менее, молекулярные механизмы вкуса во многом не ясны, поскольку во вкусовой клетке ни для одного из вкусовых стимулов не прослежена вся последовательность событий от взаимодействия с молекулярным рецептором до выброса нейромедиатора.
Одной из задач физиологии вкусового органа, которую предстоит решить, является исследование межклеточных коммуникации во вкусовой почке. Популяция вкусовых клеток гетерогенна. Во вкусовой почке идентифицировано три морфологически различных типа веретенообразных клеток, функциональная роль которых доподлинно
неизвестна, но которые, по-видимому, выполняют рецепторную, поддерживающую и/или секреторную функции. Эти клетки обмениваются примерно раз в двадцать дней, развиваясь из клеток предшественников и в конце жизни подвергаясь апоптозу. Поскольку вкусовые клетки устанавливают афферентные синапсы с вкусовыми нервами, то их непрерывное обновление требует постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация также может подвергается первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных, но синхронизированных процессов, несомненно, требует хорошо отлаженных коммуникаций между клетками вкусовой почки."Ряд фактов, установленных в последние годы, свидетельствуют в пользу подобной точки зрения. В частности, присутствие сигнальных молекул нескольких типов (серотонин, ацетилхолин, ГАМК, субстанция Р) во вкусовой почке было показано иммуногистохимически, в то время как присутствие во вкусовых клетках рецепторов к ним было показано методами молекулярной биологии и электрофизиологии.
Недавно в нашей лаборатории было установлено, что вкусовые клетки желобоватого и листовидного сосочков экспрессируют метаботропные P2Y рецепторы, активация которых приводит к мобилизации внутриклеточного Са2+. Фармакологическое исследование Са2+ ответов вкусовых клеток показало участие P2Y2 и P2Y4 рецепторов, которые, скорее всего, играют основную роль в рецепции на экстраклеточных нуклеотидов. Эти и другие наблюдения свидетельствуют о том, что АТР может быть сигнальной молекулой, обеспечивающей коммуникации между вкусовыми клетками. Необходимыми условиями выполнения подобной функции является наличие во вкусовой почке клеток, высвобождающих АТР, и клеток-мишеней, способных
детектировать АТР во внеклеточном пространстве. Поэтому в работе ставились следующие основные задачи:
1. Установить, имеется ли во вкусовой почке популяция клеток, способных распознавать внеклеточный АТР, и если да, то описать феноменологию их возбуждения нуклеотидом.
2. Изучить последовательность событий, запускаемых АТР в цитоплазме вкусовых клеток, и охарактеризовать основные элементы пуринергического сигнального каскада.
3. Выяснить, происходит ли выброс АТР из вкусовых клеток в ответ на их стимуляцию.
Данная работа представляет собой попытку ответить на эти и некоторые другие вопросы, и посвящена исследованию внутриклеточных событий, запускаемых внеклеточным АТР во вкусовых клетках млекопитающих.
II. Литературный обзор.
II.1. Организация вкусового анализатора.
Самые разнообразные животные от беспозвоночных до человека обладают органами вкуса, важнейшая функция которых - анализ химического состава пищи. У млекопитающих вкусовые стимулы воспринимаются специализированными сенсорными клетками, называемых вкусовыми, которые организованны в плотные клеточные ассоциаты из 20 -100 клеток - вкусовые почки (Murray et al., 1969, Lindemann, 2001) (Рис.1). Наибольшее число вкусовых почек расположено в эпителии дорсальной поверхности языка в составе вкусовых сосочков - желобоватых, листовидных и грибовидных; так же они обнаружены в эпителии рта, губ, переднего отдела глотки, пищевода и гортани.
Микровилли с Реиептопные клетки рецепторами \ синапс
Вкусовая пора
Tight junction
Реиептооные клетки
Нервные окончания
Рисунок 1. Схематичное строение вкусовой почки, объяснения в
тексте.
Клетки вкусовых почек морфологически неоднородны (Lindemann, 1996) и среди них выделяют следующие четыре типа: тёмные (I тип), светлые (II тип), промежуточные (тип III) и базальные (тип IV) (Lindemann, 1996; Herness и Gilberson, 1999). Округлые базальные клетки являются клетками-предшественниками для всех клеток вкусовой почки, популяция которых постоянно обновляется. Этот процесс, по всей видимости, контролируется трофическими факторами, которые поставляются эфферентными нервными волокнами, иннервирующими вкусовую почку (Ganchrow and Ganchrow, 1992; Takeda et al., 1996; Cho et al., 1998; Sollars et al., 2002). Биполярные удлиненные клетки первых трех типов (которые, как считается, выполняют опорно-секреторную или рецепторную функции (Lindemann, 1996; Herness и Gilberson, 1999)) в апикальной части несут микроворсинки, выступающие во вкусовую пору, таким образом, апикальная (рецептирующая) мембрана имеет доступ к вкусовым веществам в ротовой полости. Соседние клетки во вкусовой почке образуют плотные контакты (tight junction), которые разделяют плазматическую мембрану вкусовых клеток две функционально различных части - апикальную и базолатеральную мембраны. Последняя практически недоступна для действия большинства вкусовых стимулов, прежде всего в виде больших органических молекул (Lindemann, 2001).
Большинство клеток вкусовой почки образуют афферентные синапсы с нервными волокнами, как это следует из ультраструктурных данных (Delay and Roper, 1988; Yoshie et al.,1996; Yang et al., 2000a). Долгое время считалось - и это вполне логично - что хеморецепторные клетки должны образовывать синапсы с нервными эфферентными окончаниями в силу необходимости передачи мозгу информации о качестве и интенсивности вкусового стимула (Lindemann, 1996). Однако наличие эфферентного синапса точно было показано для вкусовых клеток типа III (Royer and Kinnamon, 1991; Yee et al., 2001), тогда как для других типов клеток это является предметом спора (Yang et al, 2000a; Pumplin and
Getschman, 2000). Между тем, данные последних лет свидетельствуют о том, что истинно рецепторными клетками являются вкусовые клетки II типа (Margolskee, 2002; Scott 2004), что ставит вопрос о каналах передачи первичной вкусовой информации в ЦНС. По разным оценкам время жизни дифференцированной вкусовой клетки составляет 10-14 дней (возможно, из-за непрерывного воздействия агрессивных факторов на апикальную мембрану, постоянно экспонированную во вкусовую пору), в конце своей жизни клетки подвергаются апоптозу (Ganchrow, Ganchrow, 1988; Oakley et al., 1990; Nagato et al., 1995; Seta et al., 1999; Zeng et al., 2000; Krimm et al., 2001; Sun and Oakley, 2002).
II.2. Трансдукция вкусового сигнала.
Основополагающей функцией вкусовых рецепторных клеток является распознавание вкусовых веществ (ионов и молекул, содержащихся в пище) - трансдукция - и кодирование информации об их концентрации и вкусовой модальности для дальнейшего анализа в соответствующих структурах мозга (Gilbertson et al., 2000; Herness and Chen, 2000). Для трансдукции вкусовых стимулов в настоящий момент общепризнанна множественность механизмов, которые можно разбить на две условные группы. Во-первых, предполагается, что при воздействии солёных и кислых стимулов для образования и передачи сигнала во вкусовой клетке достаточно модуляции ионных потоков через апикальную мембрану, обусловленной изменением ионного состава среды (Na+, в случае солёного; Н*, в случае кислого стимула) во вкусовой поре (Lindemann, 1996; Herness and Gilberson, 1999). Во-вторых, большинство сладких и горьких веществ (а так же ряд аминокислот) активируют хеморецепторный путь передачи сигнала. Предполагается, что в этом случае внешний стимул связываясь с трансмембранным G-белок связывающимся рецептором (GPCR, G-protein coupled receptor) (Lindemann, 2001), переводит его в возбужденное состояние, находясь в
котором рецептор катализирует диссоциацию нескольких сотен гетеротримерных G-белков на а-субъединицу и комплекс Ру-субъединиц. Каждый из них может регулировать активность ионных каналов и/или эффекторных ферментов, которые генерируют внутриклеточные сигналы, что в свою очередь приводит к передаче вкусового сигнала далее от вкусовой клетки. (Herness and Gilberson, 1999; Lindemann 2001; Margolskee 2002).
Следует отметить, что прогресс последнего десятилетия в области молекулярной биологии, иммуногистохимии и электрофизиологии вкусового органа позволил идентифицировать многие эффекторные молекулы его сигнальных каскадов. Так, одними из первых были идентифицированы восемь а-субъединиц G-белков, которые являются своего рода визитной карточкой сигнального каскада. Наиболее представлено семейство Gi/Go, четыре представителя которого экспрессируются во вкусовых клетках: а-гастдуцин, а-трансдуцин, Gj_2, и Gi_3. Кроме того, найдены G-белки Gs (a-Gs) и Gq (a - Gq, a - Gu, a - G15) типа (McLaughlin et al., 1992; Margolskee, 2002). Их специфическая роль в физиологии вкусовых клеток практически не известна, за исключением, быть может, гастдуцина: поведенческие эксперименты и регистрации от вкусового нерва показывают, что мыши, у которых была подавлена (knock out) экспрессия гастдуцина, оказались на два порядка менее чувствительны к горьким и сладким (но не к соленым и кислым) веществам по сравнению с мышами дикого типа (Wong et al., 1996). Это однозначно говорит о принципиальной роли гастдуцина в формировании горького и сладкого вкуса. Методом single cell RT-PCR анализировалась экспрессия субъединиц G-белков, и было показано, что гастдуцин, скорее всего, состоит из а-гастдуцина и Ру-субъединиц (Huang et al., 1999), причем а-субъединица, скорее всего, активирует фосфодиэстеразу (PDE), а Ру-комплекс контролирует фосфолипазу С (PLC) (Margolskee, 2002). Гастдуцин экспрессируется преимущественно в клетках типа II (Boughter
et al., 1997; Sbarbati et al., 1999; Smith et al., 1999; Yang et al., 2000b), что является необходимым условием для нормального рецептирования сладких и горьких стимулов (Wong et al., 1995; Ruiz-Avila et al., 2001). Поэтому гасдуцин-положительные клетки типа II могут быть хеморецепторными, однако они не формируют синапсы с эфферентными волокнами; возможно, они секретируют сигнальные молекулы, чтобы, например, модулировать активность соседних вкусовых клеток.
Эти и перечисленные выше данные говорят о том, что потенциально возбуждение вкусовых клеток может происходить путем модуляции активности ионных каналов G-белками или в результате изменения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов, или за счет генерации инозитолтрифосфата (1Р3) и мобилизации Са2+ (Ogura et al., 2002). Действительно, многие элементы циклонуклеотидного и фосфоинозитидного каскадов найдены во вкусовых клетках, и в частности: аденилатциклаза (AC) (Abaffy, et al., 2003), PDE (Kinnamon and Margolskee, 1996), циклонуклеотид-зависимые каналы (Kaupp and Seifert, 2002, Wei et al., 1998), PLC (Asano-Miyoshia et al., 2000, Rossler et al., 1998), 1Р3-рецепторы (Yan et al., 2001) и TRP-каналы (Zhang, et al., 2003). Однако вклад этих каскадов в возбуждение вкусовых клеток химическими стимулами фактически не исследован и мало известно о том, какие рецепторы контролируют активность этих сигнальных систем.
В 2000г было идентифицировано семейство генов кодирующих так называемые T2R/TRB-penenTopbi (Adler et al, 2000), специфически экспрессирующиеся во вкусовых клетках, и, по-всей видимости, функционирующие как вкусовые рецепторы (Lindemann, 2001). Со структурной точки зрения, T2R/TRB рецепторы лишь отдаленно связаны с другими GPCR, такими как VIR (рецепторы на феромоны), и даже внутри семейства степень гомологии составляет 30-70%. Эти рецепторы имеют высококонсервативные области в цитоплазматических петлях и прилежащих к ним трансмембранных сегментах (предположительно они
10
выполняют функцию взаимодействия с G-белками) и сильно дивергирующие экстраклеточные области (потенциальные сайты связывания с лигандами) (Gilbertson, et al., 2000). У крыс и мышей T2R/TRB рецепторы экспессируются в 15 - 20% вкусовых рецепторных клеток желобоватых и листовидных сосочков и в очень малом количестве вкусовых рецепторных клеток грибовидных сосочков (Margolskee, 2002). Основываясь на данных in situ гибридизации, показано, что T2R/TRB рецепторы экспрессируются в определенных типах вкусовых рецепторных клеток (Adler et al., 2000). В частности, T2R/TRB рецепторы экспрессируются в клетках экспрессирующих гастдуцин (Gilbertson, et al., 2000; Margolskee, 2002). В биохимических экспериментах было показано, что T2R5 - рецептор, распознающий горькое вещество циклогексимид, селективно активирует гастдуцин, но не другие G-белки, экспрессируемые во вкусовых клетках (Chandrachekar et al., 2000). Это дает основание думать, что именно гастдуцин связывает T2R5 и возможно другие рецепторы к горьким веществам с эффекторными ферментами. Было также показано, что горькие вещества стимулируют синтез 1Р3 и что этот ответ блокируется антителами к Ру-субъединицам гастдуцина и к РЬСРг в. то время как контрольные антитела и антитела к а-гастдуцину были неэффективны (Rossler et al., 2000). Это говорит о том, что после рецептор-стимулируемой диссоциации гастдуцина именно ру-комплекс активирует PLCp2, запуская тем самым образование 1Р3 и диацилглицерола (DAG).
Методами биоинформатики в геноме мыши был найден новый рецептор, T1R3, который был идентифицирован как продукт гена из локуса sac на четвертой хромосоме мыши (Max et al., 2001). Поскольку мутации в этом гене ведут к потере чувствительности к сахарину и не затрагивают чувствительность к веществам других вкусовых модальностей, было предположено, что T1R3 - сладко-чувствующий рецептор. Он имеет гомологию порядка 30% с T1R1 и T1R2, GPCR,
11
идентифицированными ранее (Hoon et al., 1999), которые структурно составляют еще одно семейство вкусовых рецепторов (T1R1, T1R2 и Т1Ю). Интересно отметить, что методом двойной in situ гибридизации было показано, что T1R1 и T1R2 эксперессируются в разных вкусовых клетках, но некоторые вкусовые клетки экспрессируют комбинации T1R1 и T1R3 или T1R2 и T1R3 (Hoon et al., 1999; Nelson et al, 2001). Ha основании этих данных было сделано предположение, что функциональный рецептор, скорее всего, является гетеродимером (T1R1/T1R3 и T1R2/T1R3), что нашло подтверждение в следующих экспериментах. Оказалось, что при экспрессии комбинации T1R2 + T1R3 в клетках НЕК-293 (которые в контроле не реагировали на вкусовые вещества) таковые отвечали на сладкие вещества (Nelson et al., 2001). При экспрессии комбинации T1R1 + T1R3 индуцировалась чувствительность к аминокислотам (Nelson et al., 2001). Это дает основание полагать, что гетеродимер T1R2/T1R3 является сладко-чувствующим рецептором, а T1R2/T1R3 - функционирует как рецептор аминокислот.
Вкус умами вызывается L-глутаматом в миллимолярных концентрациях (Lindemann, 2001). Во многих тканях глутамат идентифицирован как возбуждающий нейротрансмиттер, где в микромолярных концентрациях он активирует ионотропные и метаботропные (т.е. G-белок сопряжённые) рецепторы (Brown and Dale, 2002). Классические глутаматные рецепторы также найдены во вкусовых клетках (Chaudhari et al., 1996; Lin and Kinnamon, 1999), но они вряд ли обеспечивают рецепцию глутамата как вкусового вещества, поскольку афинность этих рецепторов к глутамату характеризуется микромолярными константами диссоциации. Недавно был идентифицирован подтип метаботропного рецептора (mGlu4t (truncated)), специфически экспрессируемый во вкусовых клетках (Chaudhari et al., 2000). Его особенность в том, что по сравнению с классическим mGlu4-рецептором у него не хватает 130 аминокислот на N-конце (расположен
12
экстраклеточно и несет сайт связывания глутамата), что сдвигает афинность mGlu4t рецептора в область миллимолярных концентраций (Chaudhari et al., 2000). Это обстоятельство, а также апикальная локализация mGlu4t, дают основание считать, что данная изоформа метаботропного рецептора, специфическая для вкусовых клеток, обеспечивает детекцию глутамата в пище (Chaudhari et al., 2000).
Итак, во вкусовых клетках найдены многие элементы внутриклеточных сигнальных систем - рецепторы, G-белки, эффекторные ферменты, ионные каналы. На этом основании до недавнего времени доминировала гипотеза, предполагающая одновременное существование множественных механизмов, использующих cGMP/cAMP и IP3/DAG/Ca в качестве вторичных мессенджеров для трансдукции вкусовыми клетками стимулов разных вкусовых модальностей (Lindemann, 1996; Herness and Gilberson, 1999; Gilberson et al., 2000; Lindemann 2001; Margolskee 2002). Здесь следует отметить сложность изучения молекулярных механизмов вкуса, которая состоит в том, что многочисленные модели вкусовой трансдукции трудно проверить экспериментально, поскольку в электрофизиологических экспериментах не более 5% вкусовых клеток отвечает на адекватные вкусовые стимулы. Однако недавно появившиеся данные ставят под сомнение эту традиционную точку зрения. Согласно поведенческим экспериментам и регистрации от вкусового нерва, у животных с нокаутированными PLC ((32 изоформой) или ионным каналом TRPM5 (семейства TRP-каналов; Runnels et al., 2002, Vazquez et al., 2001, Venkatachalam et al., 2001), практически исчезала чувствительность к сладким, горьким стимулам и аминокислотам при неизменной чувствительности к кислым и солёным стимулам (Zhang et al., 2003). Следовательно, PLCP2 и TRPM5 являются общими и ключевыми элементами сигнальных каскадов, обеспечивающих трансдукцию сладких, горьких стимулов и аминокислот.
13
П.З. Первичные посредники вкусовой почки.
Так как вкусовые клетки подвергаются непрерывному обновлению, иннервация вкусовых почек также должна непрерывно меняться. Таким образом, оказывается, что для нормального функционирования вкусовых клеток необходимо наличие некоторого набора первичных мессенджеров для контроля над такими процессами, как клеточный цикл и изменение иннервации, вкусовая трансдукция и обработка информации, которые одновременно происходят во вкусовой почке. На роль подобного коммуникативного медиатора есть несколько претендентов.
С помощью метода иммуногистохимии во вкусовой почке были локализованы следующие нейроактивные вещества: ацетилхолин, норэпинефрин, серотонин, аминокислоты (например, глутамат и ГАМК) и пептиды (например, вещество Р и кальцитонин связывающий пептид) (Nagai et al., 1996; Yamomoto et al., 1998; Ganchrow, 2000). Хотя их роль в физиологии вкусовой почки достоверно не известна, вероятно, и они могут быть вовлечены в межклеточную сигнализацию. Для формирования внутриклеточного ответа на подобные регуляторные вещества вкусовые клетки могут использовать каскады усиления внешнего сигнала, что характерно для многих клеток и тканей (Suh and Hille, 2002). Несмотря на многообразие первичных мессенджеров, основными элементами цепи их восприятия и передачи сигнала остаются специфические рецепторы-белки на мембране, G-белки и различные ферменты биохимических каскадов, влияющие на уровень вторичных мессенджеров и, как следствие, на генерацию внутриклеточного ответа на внешнее воздействие. Такие механизмы усиления используются при гормональной регуляции и в фототрансдукции, они участвуют в процессах формирования памяти и развития (Fain et al., 2001; Eatock, 2000; Bunemann et al., 1999; Bums and Baylor, 2001).
Во вкусовых клетках был обнаружен ряд трансмембранных рецепторов, включая адренэргический, глутаматный,
14
холецистокининовый, лептиновый, и мускариновый рецепторы (Chaudhan et al.,1996, 2000; Kawai et al., 2000; Ogura, 2002; Hemess et al., 2002a; Herness et al., 2002b). Электрофизиологические эксперименты и Са2+ imaging указывают на то, что многие из обнаруженных медиаторов предположительно могут контролировать возбудимость вкусовых клеток путем регуляции потенциал-зависимых К , Са и СГ токов или мобилизируя внутриклеточный Са2+ (Delay et al., 1997; Herness and Chen, 1997, 2000; Hemess and Sun, 1999; Kawai et al., 2000; Ogura, 2002; Herness et al., 2002a; Herness et al., 2002b; Obata et al, 1997; Ren et al., 1999). Как нейротрансмитер, глутамат может действовать и через метаботропный и через ионотропный рецепторы (Chaudhan et al.,1996, 2000; Toyono et al., 2002), что сопряжено с модуляцией тока покоя и/или мобилизации внутриклеточного Са2+ (Bigiani et al., 1997; Lin and Kinnamon, 1999; Caicedo et al., 2000).
Пурины (ATP, ADP и аденозин) и пиримидины (UTP и UDP) широко известны как медиаторы, ко-медиаторы или нейромодуляторы, действующие в периферийной и центральной нервных системах (Ralevic-and Burnstock, 1998; Galligan et al., 2000; Burnstock, 2001; Stojilkovic and Koshimizu, 2001; Dunn et al., 2001; Di Virgilio and Solini, 2002). Рецепторы на пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды подразделяют на две группы - Р1- и Р2-типа по сродству к агонистам - для первых это аденозин, а для вторых - ATP, ADP и UTP. Семейство рецепторов Р2-типа состоит их двух подсемейств, включающих ионоторопные Р2Х рецепторы и метаботропные P2Y рецепторы (Ralevic and Burnstock, 1998). Р2Х рецепторы являются катионными каналами, активируемыми экстраклеточным ATP (Dunn et al, 2001; North, 2002), и присутствуют как в пре-, так и в постсинаптических мембранах.
Поскольку нейромедиаторы часто выделяются вместе с АТР, активация пресинаптических Р2Х рецепторов, проницаемых для ионов Са , создает положительную обратную связь, которая ускоряет секрецию
15
нейромедиатора. В синапсах, в которых АТР секретируется как нейромедиатор, Р2Х рецепторы в постсинаптической мембране обеспечивают передачу возбуждения (Fields and Stevens, 2000). При повреждении тканей АТР высвобождается из клеток и активирует Р2Х рецепторы, локализованные на нервных окончаниях сенсорных нейронов, тем самым внося вклад в формирование болевого ощущения (Burnstock, 2001). Р2Х рецепторы, в свою очередь, подразделяются на 7 подклассов: от P2X1R до P2X7R (North, 2002). Также было обнаружено три гетеродимерных формы Р2Х рецепторов: ЗР2Х2/Р2ХЗ Р2Х1/Р2Х5 Р2Х4/Р2Х6 (Dunn, 2001; Di Virgilio and Solini, 2002). Каждый из подклассов Р2Х рецепторов имеет топологию, существенно отличную от топологии других известных лиганд - связывающих каналов. Р2Х рецептор - белок, состоящий из 378 - 472 аминокислотных остатков (два гидрофобных трансмембранных домена с большой экстрациркулярной гидрофильной петлей), размещенный в мембране и образующий в ней пору. Экстраклеточная петля всех подтипов Р2Х рецепторов содержит 10 консервативных цистеиновых и 14 консервативных глициновых аминокислотных остатка, а также от двух до шести сайтов для гликозилирования. Гликозилирование необходимо для экспрессии рецептора на клеточной поверхности и для его функции (Torres, 1998). Р2Х рецепторы различаются по их чувствительности к различным агонистам, антагонистам и катионной селективности. Существуют данные о том, что подтипы Р2Х рецепторов могут образовывать гетеродимеры, в частности комбинация Р2Х2 и Р2Х3 типов формирует уникальный ионный канал со специфическими свойствами. Также возможны комбинации Р2Х])5 и Р2Хг,б- Систематическое исследование подтипов Р2Х рецепторов говорит нам о том, что между ними существуют сложные белок -белковые взаимодействия. Подтипы Р2Х4 и Р2Х7 не могут образовывать гетеродимеров, тогда как Р2Х6 нуждается в ассоциации с другими
16
подтипами P2Xi)2>4,5 для формирования активного канала (Dunn, 2001; Di Virgilio and Solini, 2002; Bumstock, 2001).
Что касается P2Y рецепторов, все они сопряжены с различными гетеротримерными G-белками, которые, в свою очередь, активируют разные сигнальные внутриклеточные каскады (Ralevic and Bumstock, 1998; Di Virgilio and Solini, 2002; Kunapuli et al., 2003). Так, рецепторы P2Yb P2Y6 действуют через G-белок Gq/Gu, который активирует PLCp2 с последующей генерацией 1Р3 и DAG, что в общем случае приводит к выбросу Са2+ из внутриклеточных депо и активации РКС. В случае P2Y2 и P2Y4 помимо Gq/ц возможно также сопряжение с Gj белком, вследствие чего может иметь место ингибирование АС или стимуляция PDE а-субъединицей и/или активация PLCp Ру-комплексом G-белка (Stojilkovic and Koshimizu 2001; Bumstock, 2001). P2Yn сопряжен с Gq/n и Gs, последний может активировать АС и влиять на эффективность сАМР-зависимого сигнального каскада. Следует отметить, что изоформы P2Y рецепторов различаются по чувствительности к различным агонистам и антагонистам, что позволяет их идентифицировать в физиологических экспериментах. P2Y рецепторы широко распространены во всех типах клеток, однако наибольшая экспрессия наблюдается в эпителиальных и эндотелиальных тканях и тромбоцитах для P2Yi( !2. Мы показали методом RT-PCR, что во вкусовых клетках экспрессируются P2Yb P2Y2, P2Y4, P2Y6 изоформы P2Y рецепторов (Федоров и другие, 2005). Методом ингибиторного анализа нами было достоверно показано, что во вкусовых клетках действительно имеет место вовлечение P2Y2 и P2Y4-изoфopм в АТР-зависимую мобилизацию Са2+ и модуляцию ионных токов (Baryshnikov et al., 2003). Эти данные указывают на предполагаемую роль АТР как одного из первичных мессенджеров, действующего во вкусовой почке. Дополнительным свидетельством в пользу работы АТР как посредника межклеточных коммуникаций во вкусовой почке служит тот
17

Получить работу