СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
• АДФ - аденозиндифосфат
• АТФ - аденизинтрифосфат
• Ацетил-КоА - ацетилкоэнзим А
• ГАГ - гликозаминогликаны
• ГК - гиалуроновая кислота
• ГС - гепарансульфаты
• ХС - хондроитинсульфаты
• СГАГ — сульфатированные гликозаминогликаны
• НСГАГ - несульфатированные гликозаминогликаны
• D-ГК - D-глюкуроновая кислота
• Г6Ф-ДГГ- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
• 6ФГ-ДГГ - 6-фосфоглюконатдегидрогеназа
• НАД - никотинамидадениндинуклеотид
• НАДН+Н1"- восстановленный никотинамидадениндинуклеотид
• НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
• НАДФН+Н+- восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат
• НК - нуклеиновые кислоты
• ПОЛ - перекисное окисление липидов
• РНК - рибонуклеиновая кислота
• ерш - количество импульсов в минуту
• СГАГ - сульфатированные гликозаминогликаны
• *S - радиоактивномеченный сульфат ( SO4 ")
• УДФ - уридиндифосфат
• УДФ-ГК - уридиндифофатглюкуроновая кислота
• УК - уроновые кислоты
• УТФ - уридинтрифосфат
• ФАД - флавинадениндинуклеотид
• ФМН - флавинмононуклеотид
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Биохимические механизмы адаптации организма к патологическим состояниям, неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей среды, возрастным и физиологическим изменениям, например, таким как состояние беременности, в течение последних десятилетий постоянно привлекают внимание исследователей с целью создания средств, повышающих адаптационные возможности организма. В этом отношении недостаточно изучена роль гетерополисахаридов - гликозаминогликанов (ГАГ) (прежнее наименование "кислые мукополисахариды"), содержащих в своем составе гексозами-ны, гексозы и гексуроновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967), подразделяющихся в основном на гиалуроновую кислоту (ГК), хондроитинсульфаты (ХС) и гепа-рансульфаты (ГС).
ГАГ содержатся в межклеточном матриксе, клеточных мембранах (Hunter G.K., Heersche J.N.M., Aubin J.E.,1983; Vogel K.G., Dolde J.,1979; Vogel K.G., Peterson D.W., 1981), а также в ядрах клеток в виде ассоциированных с хроматином протеогликанов (Onarheim H., Missavage A.E., Gunther R.A. et al.,1991; Stein G.S., Roberts R.M., Davis J.L. et al.,1975). В настоящее время известно (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Фукс Б.Б., Фукс Б.И.,1968), что ГАГ в составе протеогликанов соединительной ткани обеспечивают ее механические свойства, участвуют в воспалительных реакциях (Лабори Г., 1970) и репаративных процессах (Слуцкий Л.И., 1969), необходимы для нормального кроветворения (Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Агафонов В.И. и др., 1995; Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П.,1993; Ястребов А.П., Юшков Б.Г., Большаков В.Н.,1988) и полноценного иммунного ответа (Соловьев Г.М., Петрова И.В., Ковалев СВ., 1987), выполняют за счет влияния на проницаемость веществ в клетки трофическую и антитоксическую функции (Лабори Г., 1970). Следует подчеркнуть, что традиционные представления о механизмах антитоксических эффектов ГАГ основываются на их полианионных возможностях связывать гидрофильные токсические вещества основного характера в межклеточном матриксе, блокируя тем
самым их поступление в клетки (Лабори Г., 1970; Переверзев А.Е.,1986).
Этот механизм не представляется исчерпывающим в связи с общностью метаболических путей обмена ГАГ, пентозофосфатного цикла, детоксицирую- щих реакций глюкуронидной конъюгации (Парк Д.В.,1973) и монооксигеназ-ной системы (Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А.,1986).
Не вызывает сомнений, что именно механизмы устойчивости к ксенобиотикам определяют возможность самого выживания организмов в окружающей среде, которая становится все более насыщенной невероятным количеством разнообразных химических соединений. То есть, проблема адаптации организма к неблагоприятным ситуациям во многом может быть сведена к общебиологической способности клетки защищать себя от токсического воздействия экзогенных и эндогенных токсикантов, используя в качестве щита гетерополисаха- ридные компоненты межклеточного матрикса (Зимницкий А.Н., Башкатов CA., 2004).
Однако участие в процессах детоксикации, как уже отмечалось, только часть функций ГАГ в рамках глобального явления адаптации. Источники литературы свидетельствуют, что в организме человека с возрастом отмечаются морфологические и физиологические изменения, являющиеся следствием биохимических сдвигов. Данные литературы констатируют наличие возрастных изменений концентраций низко- и высокомолекулярных эндогенных соединений в органах и тканях организма человека и животных. Однако наблюдения авторов фрагментарны и часто противоречат друг другу. Так, например, не существует однозначного мнения о биохимических механизмах старения и их регуляции, о направленности обусловленных возрастом концентрационных сдвигов содержания альбуминов и глобулинов в крови, фракций ГАГ и ДНК в коже.
Не вызывает сомнений, что качество обмена биополимеров в организме во многом зависит от токсической нагрузки на него экзо- и эндогенных соединений, метаболизирующихся в реакциях микросомального окисления и различных типов конъюгации и, тем самым, отвлекающих на себя метаболические по-
токи субстратов и макроэргических соединений, а также загружающих бело-ксинтетический и каталитический аппараты клетки. Очевидно, что такие физиологические состояния как старение и беременность в силу различных при- чин сопровождаются интоксикацией. В указанной связи возникает закономерное предположение о наличии определенного сходства в направленности биохимических сдвигов при этих состояниях. В пользу этой гипотезы свидетельствуют, например, сведения различных авторов об уменьшении концентрации альбумина в сыворотке крови, как при старении (Маршалл В.Дж., 2002; Пименов Ю.С., 1993; Кипшидзе H.H., Ткешелашвили Л.К., Салуквадзе Н.С., 1963; Коркушко О.В., 1963; Нагорный Л.В., Никитин В.И., Буланкин И.И., 1963), так и при беременности (Кухта В.К., 1986).
В конце восьмидесятых годов прошлого века в руководимой нами лабо- ратории биотехнологии Отдела биохимии и цитохимии Уфимского научного центра РАН был разработан лекарственный препарат «Плазан», представляющий собой высокомолекулярную фракцию биополимеров из плаценты человека, основным компонентом которой являлись гетерополисахариды из класса ГАГ. В экспериментах на животных была продемонстрирована способность плазана стимулировать синтез РНК, подавлять рост патогенных микроорганизмов, значительно ускорять процессы репаративной регенерации. После успешного проведенных доклинических исследований безопасности препарата и получения разрешения на клиническую апробацию в начале девяностых годов была показана высокая терапевтическая эффективность плазана при лечении хирургических и гинекологических заболеваний.
В последующие годы плазан успешно использовался в качестве биологически активной добавки в изделиях лечебно-профилактической косметики, существенно улучшая у пациентов состояние кожных покровов и корригируя внешние проявления старения кожи. Именно в этот период середины девяностых годов стала очевидной взаимосвязь между качеством обмена ГАГ и функциональным состоянием кожи у человека, послужившая толчком к выполнению
настоящих экспериментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов старения организма, сопряженных с обменом ГАГ. На наш взгляд, выполненная работа является примером того, как выяснение
'# биохимических механизмов, лежащих в основе фармакологической активности
препаратов, позволяет получить новую информацию о сути общебиологических процессов. В нашем случае исследование фармакологической активности ГАГ проливает свет на ранее неизвестные стороны метаболизма биополимеров и патохимических механизмов старения организма в целом. В указанной связи сведения о терапевтической эффективности плазана в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных и в клинике вынесены в заключительную часть работы, так как используются в качестве дополнительного подтверждения основной гипотезы исследования.
¦¦' В связи со сказанным, основной гипотезой нашей работы являлось
предположении о том, что патохимические механизмы старения сопряжены с изменением обмена таких биополимеров как гликозаминогликаны, белки и нуклеиновые кислоты. В качестве объекта исследования мы, помимо лабораторных животных, намеренно выбрали женскую популяцию по двум причинам: во-первых, на наш взгляд, характеристика «практически здоровые лица» в старческом возрасте больше соответствует женщинам и, во-вторых, если говорить о прикладном аспекте наших исследований, то есть о прикладной геронтологии и дерматокосметологии, то женская популяция в силу исторически сложившейся структуры социальных отношений, системы культурных ценностей и норм поведения больше заинтересована в создании средств, корригирующих патологические изменения при старении.
Целью настоящей работы является теоретическое и экспериментальное обоснование значимой роли гликозаминогликанов и других биополимеров в биохимических процессах возрастных изменений, уточнение патохимических механизмов старения и разработка подходов к их направленной коррекции.
10
Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:
1. Изучить фракционный состав гликозаминогликанов в органах и тканях неин- бредных белых крыс.
2. Оценить интенсивность метаболизма в органах и тканях различных фракций ГАГ по интенсивности включения радиоактивного сульфата (35S042") и 14С-глюкозы, меченой по Сь у лабораторных животных различных возрастных групп.
3. Квантово-химическими и молекулярно-генетическими (дот-гибридизация) методами оценить возможность взаимодействия карбоксильной и гидрокси-метильной групп моно- и полисахаридов с генетическим аппаратом клетки.
4. Изучить фракционный состав ГАГ и белков в сыворотке крови у женщин различных возрастных групп.
5. Изучить фракционный состав ГАГ, уровни общего белка и ДНК в коже у женщин различных возрастных групп.
6. Исследовать возрастную динамику состояния печени по показателям «печеночных проб» у женщин.
7. Сопоставить возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин с аналогичными показателями в динамике беременности.
8. Оценить возможность стимуляции ГАГ транскрипционных процессов (синтеза РНК) и репаративной регенерации в целом.
9. Методами корреляционного, регрессионного, дисперсионного, факторного и кластерного анализов изучить взаимосвязи и взаимовлияния изучаемых показателей, описать их математически с помощью уравнений линейной регрессии, а также выявить латентные переменные и их конструкты.
10. Оценить принципиальную возможность патогенетически обоснованной коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов.
11. Разработать концепцию дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения.
11
12. Обосновать возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.
13. Показать возможность практического использования результатов экспе- риментальных исследований биохимических механизмов фармакологической активности ГАГ в хирургии, гинекологии и дерматокосметологии.
Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе старения, сопоставить их с побочными эффектами беременности и выявить взаимосвязь с генетическим аппаратом клетки. При этом установлены зависимости между возрастом и показателями содержания в органах и тканях глико-заминогликанов, белков, а также их фракций и нуклеиновых кислот. Показано сходство сдвигов исследованных биохимических параметров при старении и беременности. Разработаны методические подходы к формированию оптимальных концентраций гиалуроновой кислоты в органах и тканях для профилактического применения с целью повышения резистентности организма к возрастным изменениям биохимических процессов. Предложена концепция дестабилизации системы гликозаминогликанов как одного из общих механизмов старения, заключающегося в том, что с возрастом нарушается генетически детерминированный обмен биополимеров межклеточного матрикса, приводящий к обеднению гликозаминогликанами органов, покровной ткани и повышением вследствие этого их концентрации в сыворотке крови. В экспериментах по изучению биохимических механизмов фармакологических эффектов гликозаминогликанов (и в частности, препарата «Плазан») установлено, что в их реализации существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности клеточных ядер, обеспечивающая интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.
Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что показана принципиальная возможность прогнозирования интенсивности процессов старения по показателям гликозаминогликанового и белкового
12
обменов путем определения фракционного состава гликозаминогликанов, белков в сыворотке крови с последующей подстановкой результатов в соответствующие уравнения линейной регрессии. Сопоставление данных биохимических исследований механизмов метаболизма гликозаминогликанов и результатов клинических испытаний препарата «Плазан», содержащего плацентарные ГАГ, при хирургических и гинекологических заболеваниях позволяет рекомендовать проведение дальнейших исследований с целью расширения показаний к применению плацентарных ГАГ и, в перспективе, широкого внедрения препаратов на их основе в практическое здравоохранение и дерматокосметологию. На защиту выносятся следующие научные положения:
1. В патогенезе старения существенное значение имеет снижение генетически детерминированного синтеза организмом несульфатированных и сульфати- рованных гликозаминогликанов.
2. Существуют возрастные различия во фракционном составе гликозаминогликанов и белков в органах и тканях у подопытных животных, а также в сыворотке крови и коже у женщин.
3. Существуют возрастные различия показателей состояния печени у женщин.
4. Существуют возрастные изменения фракционного состава белков сыворотки крови у женщин, сопоставимые с аналогичными показателями в динамике беременности.
5. В норме в организме существуют взаимосвязи и взаимовлияния показателей возраста, беременности и обмена биополимеров.
6. Существует принципиальная возможность коррекции негативных возрастных биохимических сдвигов путем стабилизации обмена биополимеров межклеточного матрикса.
7. В биохмическом механизме фармакологической активности гликозаминогликанов существенную роль играет стимуляция транскрипционной активности ядер клеток, обеспечивающей интенсификацию репаративной регенерации тканей и антимикробной активности иммунокомпетентных клеток.
13
8. Дестабилизацию системы гликозаминогликанов правомерно рассматривать в качестве одного из общих механизмов старения организма.
9. Существует возможность прогнозирования интенсивности процессов ста-'•; рения по показателям гликозаминогликанового и белкового обменов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на IV Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international»(MocKBa,2005), на II Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные, аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004), на IV Международном конгрессе по эстетической медицине (Москва, 2004), на III Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2004), на III Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, **' 2004), на Международной конференции «Профессиональная косметика и со-
временные технологии в эстетической косметологии» (Санкт-Петербург, 2004), на Международном форуме по пластической хирургии и дерматокосметологии (Москва, 2003), на II Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik international» (Москва, 2003), на IV конгрессе по пластической, реконструктивной и эстетической хирургии (Ярославль, 2003), на IV Коференции «Косметология будущего - косметология antu-age» (Санкт-Петербург, 2003), на X Юбилейной научно-практической конференции «Клиническая эффективность нелекарственных оздоровительных продуктов: пара-фармацевтики, нутрицевтики, космецевтики» (Москва, 2003), на VII Всероссийской конференции по проблеме термических травм (Челябинск, 1999), на IV Съезде травматологов и ортопедов России (Нижний Новгород, 1997), на Научной конференции «Люминесцентный анализ в медицине и его аппаратурное обеспечение» (Рига, 1988), на Международной конференции «Медицина и катастрофы» (Уфа, 1990), на Научно-практической конференции «Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов (Уфа, 1989).
14
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 54 научные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 334 страницах, содержит 125 таблиц, 79 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов, предметов и методов исследования, 14 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 235 источников, из которых 132 отечественных и 103 иностранных авторов.
15
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура и функции гликозаминогликанов
Гликозаминогликаны представляют собой линейные гетерополисахари-ды, состоящие из повторяющихся дисахаридных фрагментов, в которые входят гексозы, гексозамины и гексуроновые кислоты (Кочетков Н.К., 1967). ГАГ, содержащие гексуроновые кислоты, подразделяют на несущие сульфогруппы хондроитинсульфаты, дерматансульфаты, гепарансульфаты, гепарин и несуль-фатированную гиалуроновую кислоту (Стейси М., Баркер С, 1965; Tool B.D., Biswas Ch., Gross J., 1979; Башкатов CA., 1996) (рис.1.1.1 - 1.1.5).
Структурная единица гиалуроновой кислоты (рис.1.1.1) представляет собой остаток D-глюкуроновой кислоты, связанный ?l-*3 о-гликозидной связью с остатком N-ацетилглюкозамина. Внутри полимера структурные единицы связаны ?l—>4 о-гликозидными связями.
\
н он
Н NHCOCHj H ОН
H NHCOCH.
Рис. 1.1.1. Строение гиалуроновой кислоты.
Хондроитин-4-сульфат (хондроитинсульфат А) состоит из остатков D-глюкуроновой кислоты и Г\[-ацетил-О-галактозамин-4-сульфата, связанных ?l—>3 о-гликозидной связью. В свою очередь, дисахариды связаны ?l—»4 o-гликозидными связями.
Хондроитин-6-сульфат (хондроитинсульфат С) (рис. 1.1.2) отличается от хондроитинсульфата А сульфатированностью N-ацетил-о- галактозамина в 6 положении.
16
\
ООН
CH,OSO,H
NHCOCH3 H
о
н н ^——f н
ОН Н NHCOCH
Рис. 1.1.2. Строение хондроитинсульфата С.
На рисунке 1.1.3. изображено строение дерматансульфата (хондроитинсульфата В), в дисахаридах которого остаток L-идуроновой кислоты связан ?l-*3 о-гликозидной связью с 1<1-ацетилгалактозамин-4-сульфатом. Следует отметить, что в составе этого гетерополисахарида иногда, помимо L-идуроновой кислоты, встречается D-глюкуроновая кислота. Дисахариды дерматансульфата связаны ?l—*4 о-гликозидными связями.
Ho,sq сн,он
н он Н NHCOCH3 H ОН
Рис. 1.1.3. Строение дерматансульфата.
Н NHCOCHj
Гепарансульфаты (рис. 1.1.4) и гепарин (рис. 1.1.5) являются структурно близкими соединениями, дисахаридные звенья которых состоят из остатков глюкуроновой или идуроновой кислот, связанных с глюкозамином al—»4 о-гликозидными связями. Повторяющиеся димеры связаны 1-»4 о-гликозидными связями. При этом уроновые кислоты могут быть сульфатированы во 2 и 3 положениях, а глюкозамин может быть N- ацетилированным, N- и О-сульфатированным.
17
(%
Н NHCOCHj H OSO3H H NHCOCHj
Рис. 1.1.4. Строение гепарансульфатасульфата.
соон
—о
Н NHSO,H Н OSO,H Н NHSO„H
Рис. 1.1.5. Строение гепарина.
В тканях организма сульфатированные гликозаминогликаны входят в состав протеогликанов, в которых ковалентно связаны с белковой молекулой -кором (Lyon M., Nieduszynski I.A., 1983).
В свою очередь, протеогликаны могут быть объединены несульфатиро-ванной молекулой гиалуроновой кислоты , имеющей молекулярную массу от 1 до 10 млн Да, в огромные нековалентно связанные комплексы. Так, электрон-номикроскопические исследования показали, что в хрящевой ткани одна молекула гиалуроновой кислоты может удерживать до 140 протеогликанов с образованием агрегата с молекулярным весом около 70 млн Да (Rosenberg L., Hellmann W., Kleinschmidt A.K., 1975).
В настоящее время считается, что функциональная роль протеогликанов обусловлена входящими в их состав гликозаминогликанами и заключается в обеспечении по ионообменному механизму и благодаря особому пространственному строению их агрегатов, проявляющемуся в феномене переплетения и эффекте исключенного объема, трофической функции (особенно в бессосуди- |
