3 Введение
3.1.1 Актуальность проблемы
Озеро Байкал среди крупнейших озер планеты занимает первое место практически по всем биологическим и физическим параметрам (Кожов, 1962; Тимошкин, 1995; Martens, 1997), как наиболее древнее по происхождению, наиболее глубокое - около 1700 м, имеющее наибольший запас пресной воды - 23 000 км3, занимает второе место (31 500 км2) среди пресноводных озер (32 600 км ) по площади после Танганьики.
По различным источникам количество известных видов животных насчитывает от 2500 видов и подвидов, из которых 82% эндемики (Тимошкин, 1995), до 1825, из которых 54% эндемичные формы (Martens, 1997).
С точки зрения видового разнообразия фауна Байкала прочно занимает первое место среди озер Земли, число видов животных может приблизится к 3500 (Тимошкин, 1995). Таким образом, ценность Байкала для эволюционных исследований несомненна. Объяснение механизмов, которые создали в относительно ограниченной экосистеме такое колоссальное разнообразие жизни важно не только для познания Байкала, но и для общей теории видообразования.
За последнее десятилетие в филогенетических исследованиях широкое распространение получили методы молекулярной систематики, в частности сравнительный анализ гомологичных последовательностей ДНК. Одним из преимуществ этого подхода является теоретическая возможность временных оценок дивергенции различных таксонов на основе гипотезы молекулярных часов, а также соотнесение процессов видообразования с различными явлениями преобразования экосистемы. Зачастую молекулярно-филогенетический подход является единственно возможным способом, позволяющим разобраться в родственных связях таксонов.
Наиболее интересными представляются исследования таких объектов как эндемичные "букеты видов", то есть монофилетичные группы близкородственных видов, дивергировавшие в рамках одной замкнутой экосистемы (Brooks, 1950). Букеты видов особенно часто обнаруживаются в древних пресноводных озерах, каким является Байкал. В отличие от других
древних озер (Танганьика, Малави и др.), где молекулярно-филогенетические исследования, получившие мировую известность, проводились преимущественно для цихловых рыб, на Байкале проведены работы, посвященные вопросам молекулярной эволюции, коттоидных рыб (Slobodyanyuk et al., 1994), амфипод (Огарков и др., 1997; Sherbakov et al., 1998), моллюсков (Зубаков и др., 1997,), губок (Itskovich et al., 1998) и байкальских планарий (Kuznedelov & Timoshkin, 1993). Несомненный интерес представляет изучение эволюционной истории байкальских олигохет. Байкальские малощетинковые черви уникальны тем, что обитают в грунте (до 20-25 см) и на них не действуют многие изолирующие факторы, существенные для других групп организмов.
В рамках настоящей работы проведен сравнительный филогенетический анализ нескольких букетов видов - амфипод, моллюсков и олигохет -различающихся по своим экологическим характеристикам. Для этого анализа использовали один и тот же ген, кодирующий первую субъединицу митохондриальной цитохром оксидазы. В результате появилась возможность сравнительного анализа эволюционных историй этих групп, вносящих существенный вклад в современное биоразнообразие озера Байкал.
Цель и заттачи исследования
Целью настоящей работы явилось восстановление эволюционных историй некоторых букетов видов байкальских беспозвоночных - амфипод, двух групп моллюсков и олигохет семейства Lumbriculidae с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей, а также соотнесение основных эволюционных событий с историей байкальсой экосистемы.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Выбрать генетические маркеры, которые бы эволюционировали со скоростью, оптимальной для получения разрешенных филогении каждой группы организмов и позволяли бы сравнение эволюционных древ различных групп;
2. Получить продукты амплификации этих генов и определить их нуклеотидные последовательности;
' 3. Охарактеризовать эволюцию генетических маркеров, определить
• наиболее подходящие модели молекулярной эволюции, пригодные для
] построения филогении;
4. Провести филогенетический анализ и исследовать полученные филогенетические гипотезы для определения их статистической достоверности;
5. Выбрать набры последовательностей, для которых соблюдается 9 гипотеза молекулярных часов, определить, для каких типов замен она
верна;
6. Подобрать наиболее подходящие калибровки для молекулярных часов и оценить время основных эволюционных событий в истории букетов видов;
7. Сопоставить датировки главных эволюционных событий с известными событиями истории Байкала.
Научная новизна работы. _ '
Впервые для изучения эволюционных взаимоотношений амфипод Байкала использован молекулярно-филогенетический подход на основе сравнения нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов. Более того, исследование, посвященное изучению эволюции mtCOIII гена 1 (Огарков и др., 1997), было первой молекулярно-филогенетической работой по
эволюции митохондриального гена не только для байкальских амфипод, но и для всей мировой амфиподной фауны. Впервые для оценки соотношения возраста байкальских амфипод и представителей мировой амфиподной фауны используются последовательности митохондриальных генов, считающихся наиболее перспективной моделью исходя из гипотезы "молекулярных часов" (Li, 1997).
В настоящей работе впервые предпринята попытка молекулярно-
_ филогенетической оценки характера и времени видовой радиации, которая
привела к современному разнообразию люмбрикулид Байкала. Впервые
амплифицированы и определены нуклеотидные последовательности фрагментов
генов!8S рРНК для 13 видов люмбрикулид и mtCOI для 26 видов байкальских
люмбрикулид, а также mtCOI для 16 особей из двух популяций Rhynchelmis alyonae. Впервые предложены схемы филогенетических взаимоотношений внутри семейства Lumbriculidae, основанные на молекулярных данных. Уникальными для данной группы "мягких" организмов, не оставляющих палеонтологической летописи, являются временные оценки видообразования, полученные на основе гипотезы "молекулярных часов". На базе этих данных показана возможность связи эволюции люмбрикулид с конкретными геологическими событиями в истории Байкала. Рассмотрены возможные причины образования некоторых букетов видов, сделаны предположения относительно характера и механизмов адаптивной радиации групп видов исследованных олигохет.
Впервые для изучения эволюционных взаимоотношений байкальских моллюсков использован молекулярно-филогенетический подход. Использованный в данной работе в качестве филогенетического маркера фрагмент гена СО I ранее не применялся в подобного рода исследованиях байкальских организмов. Впервые в явном виде предложена схема филогенетических взаимоотношений видов моллюсков семейства Baicaliidae (для семейства Benedictiidae такая схемы была построена ранее на основе анализа морфологических признаков). С помощью молекулярных часов выдвинуты независимые от полученных ранее палеонтологических оценок предположения о временной шкале видообразовательного процесса в обеих группах исследуемых моллюсков. На основании этого показана возможность связи их эволюции с конкретными геологическими и климатическими событиями в истории Байкала. Сделаны предположения относительно характера и механизмов адаптивной радиации букетов видов исследованных моллюсков.
Практическая значимость
Полнота информации о структуре и функциях компонентов биоценоза на всех уровнях его организации (от числа видов в их естественных морфологических вариациях до сведений об организации геномов и нуклеотидных последовательностях отдельных генов у организмов, образующих изучаемый биоценоз) имеет огромное практическое значение для
i 10
! мониторинга изучаемой экосистемы, прогнозирования путей ее развития,
• разработки подходов по снижению антропогенного воздействия и разумного ! использования её ресурсов. Научный подход к использованию природных
ресурсов любой экосистемы в целом, и тем более такой относительно замкнутой экосистемы, как озеро Байкал, подразумевает прогнозирование её изменений в контексте исторического развития. Применение молекулярно-биологических подходов для изучения эволюции байкальских амфипод, как элемента фауны озера, соотнесение полученных результатов с известными
# геологическими событиями может пролить свет на многие вопросы в истории формирования биоразнообразия озера, а значит способствовать дальнейшему совершенствованию научного подхода к использованию природных ресурсов Байкальского региона. Полученная информация о структуре mtCOI гена байкальских амфипод может быть использована как один из методов мониторинга. В настоящее время ведется разработка подходов видовой идентификации трудно дифференцируемых амфипод Байкала (молодь, мелкие и переходные формы) с помощью методов молекулярного зондирования.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Возраст монофилетической клады, объединяющей большинство исследуемых видов эндемичных амфипод озера Байкал, оценивается не моложе, чем в 30-28 млн. лет, что соответствует достоверно известному возрасту Байкала как непрерывно существующему во времени водоему.
2. Время дивергенции представителей байкальского рода Micruropus и пресноводных гаммарид больше, чем время существования остальных исследованных байкальских амфипод и соответствует периоду 70-30 млн. лет, т.е. времени существования крупных, но не постоянных озер на территории современного Байкала и Прибайкалья.
3. Наиболее правдоподобная оценка времени начала дивергенции семейства • Lumbriculidae в Байкале приходится на период около 28-30 млн. лет назад.
Возраст наиболее молодой радиации, приведшей к образованию букета видов группы "Lamprodrilus", оценивается в 3.8 - 2.8 млн. лет.
11
4. На основе анализа топологии полученных филогенетических древ, обнаружено, что в сем. Baicaliidae имело место взрывное видообразование. Виды внутри данного семейства формируют два основных кластера. Время существования общего предка современных байкалиид не превышает 3.5 миллионов лет.
5. Ускоренный кладогенез у субэндемичного рода Choanomphalus приходится на период 3.5 млн. лет до нашего времени. Единственный небайкальский предстаитель этого рода Ch. mongolicus, обитающий в оз. Хубсугул, произошел в Байкале и является членом байкальского букета видов хоаномфалов.
Апробация работы и публикации:
Материалы работы были представлены на Второй байкальской верещагинской конференции, Иркутск, 1995; Первом и третьем Международных симпозиумах 'Видообразование в древних озерах1, Брюссель 1993 и Иркутск 2003; Международной конференции . 'Baikal as World Natural Heritage Site: Results and Prospects of International Cooperation', Улан-Удэ, 1998; «Fourth European Crustacean Conference», Амстердам 2002.
По материалам диссертации имеется 51 публикаций, включая 16 статей в рецензируемых журналах.
Диссертация изложена на 219 страницах, содержит 34 рисунка и 11 таблиц.
4 Методы молекулярно-филогенетического анализа
Основным инструментом молекулярно-филогенетического анализа является сравнение гомологичных генов или белков и, прежде всего, первичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей.
Существует несколько причин того, что именно молекулярные данные являются более мощным инструментом для эволюционных исследований нежели сведения о морфологических или физиологических свойствах изучаемых
12
организмов. Во-первых, в большинстве случаев, эволюционные изменения последовательностей ДНК или белков протекают более равномерно, чем изменения физиологических и морфологических признаков. Это позволяет получить более ясную картину взаимоотношений организмов за счет того, что степень их сходства в данном случае более четко отражает степень родства. Во-вторых, филогенетические реконструкции на основе сравнения нуклеотидных или аминокислотных последовательностей базируются, как правило, на сотнях и тысячах признаках (нуклеотидных или аминокислотных остатков), в то время как в традиционной систематике, число используемых признаков редко превышает несколько десятков. В-третьих, молекулярные данные существенно легче чем морфологические могут быть подвергнуты количественной оценке. В настоящее время для этого разработан изощренный математический и статистический аппарат, позволяющий, помимо всего прочего, в какой-то степени избегать чрезмерного субъективизма исследователей при построении филогенетических схем.
Одно из основных допущений молекулярной систематики состоит в том, что эволюция генов отражает эволюцию соответствующих организмов. Существует, однако, ряд обстоятельств по которым это предположение может нарушаться.
Конечным продуктом молекулярно-филогенетического анализа является филогенетическое древо - графическое представление эволюции гомологичных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, точки ветвления которого соответствуют моментам их дивергенции. В случае, когда филогенетическое древо реконструируется по гомологичным последовательностям одного гена оно может отличаться от древа видов по нескольким причинам. Во-первых, благодаря наличию внутривидового полиморфизма, дивергенция гомологичных последовательностей может предшествовать действительному расхождению видов, что приводит к завышению оценки длины ветвей (Nei, 1987). Во-вторых, порядок ветвления древа генов (т. е. его топология) может не соответствовать порядку ветвления соответствующих видов. Вероятность получения ошибочной топологии древа особенно велика в случаях взрывообразного видообразования, когда временные интервалы между дивергенцией отдельных видов относительно невелики (Pamilo
13
& Nei, 1988). Кроме этого, ошибочность филогении может быть обусловлена сравнением паралогичных генов, являющихся неаллельными вариантами генов, возникших в результате дупликации предкового гена. Особенно сложно установить истинную картину филогенетических взаимоотношений в случае ретикулярной эволюции, приводящей к горизонтальному переносу генов (Li, 1997).
Для разрешения перечисленных проблем рекомендуется исследовать несколько генетических локусов, эволюционирующих независимо друг от друга (Nei, 1987). Очень существенным является правильный выбор филогенетических маркеров: степень их вариабельности определяет "разрешающую способность" исследования (Swofford et al., 1996). Существует ряд статистических методов, позволяющих оценить степень достоверности топологии полученных филогенетических древ, что во многих случаях позволяет избежать слишком поспешных выводов. Кроме того, эволюционист далеко не всегда преследует целью установление точной последовательности дивергенции видов. Зачастую, не меньший интерес представляет общая оценка генетических дистанций между изучаемыми формами, определение характера и скорости их эволюционных преобразований.
Одной из основных причин, обусловивших громадный рост исследований в области молекулярной эволюции вообще и молекулярной филогении в частности, явилось выдвижение гипотезы о существовании молекулярных часов эволюции (Zuckercandl & Pauling, 1965). Согласно данной гипотезе, для любой макромолекулы (ДНК или белка) скорость накопления замен приблизительно постоянна во всех эволюционных линиях. Это предположение, первоначально возникшее как эмпирическое обобщение, позднее получило объяснение в рамках теории нейтральности молекулярной эволюции, предполагающей, что большинство изменений на молекулярном уровне определяется не отбором, а селективно нейтральными или почти нейтральными случайными процессами мутации и дрейфа генов (Kimura, 1968; Кимура, 1985).
Важнейшее практическое приложение гипотезы молекулярных часов состоит в возможности получения временных оценок дивергенции организмов исходя из анализа молекулярных данных. Однако, с самого начала выдвижения
14
этой гипотезы и по сей день продолжается активная дискуссия по поводу ее правомочности. Так, в качестве одной из крайностей, предполагается, что синонимичные замены накапливаются с равной скоростью у всех организмов (Ochman & Wilson, 1987). Другие исследователи полностью отрицают даже приблизительное постоянство хода молекулярных часов (Goodman, 1981; CzelusniakВопрос о существовании молекулярных часов для некой совокупности организмов требует выяснения нескольких аспектов: имеется ли в виду сравнение гомологичных генов (ядерных или митохондриальных), идет ли речь о синонимичных или несинонимичных заменах, какова степень сходства изучаемых организмов (по эффективным размерам их популяций, по времени смены поколений, по уровню метаболизма и т. д.). Так, показано, что скорость накопления несинонимичных замен в различных генах может различаться во много раз (Li, 1997). Более того, в пределах одного гена скорости эволюционных изменений отдельных его участков различны в зависимости от важности их функциональной роли (Irwin et al, 1991; Cantatore et al., 1994). Для объяснения существования наблюдаемых отличий в скоростях эволюции гомологичных генов у различных организмов называются три основных причины. Во-первых, эффективность системы репарации ДНК может быть различна в разных генетических линиях. Эта гипотеза была предложена Бриттеном (Britten, 1986) на основе опытов с культурами клеток для объяснения различий в скорости накопления замен между приматами и грызунами. К сожалению, данные in vivo по этому вопросу отсутствуют. Во-вторых, гипотеза о влиянии времени смены поколений ("generation-time effect") постулирует наличие более высоких скоростей эволюции у животных с более коротким циклом смены поколений (Laird et al., 1969). Следует, однако, отметить, что на динамику накопления мутаций большое влияние оказывает эффективный размер популяции. Как правило, крупные животные с длинным циклом воспроизводства имеют меньший эффективный размер популяции, нежели мелкие животные с коротким временем смены поколений, что может компенсировать различия в эволюционных скоростях (Кимура, 1985; Ohta, 1993). В-третьих, Мартин и Палумби (Martin & Palumbi, 1993) обнаружили отрицательную корреляцию между размерами тела животных и скоростью накопления замен в некоторых ядерных и
15
митохондриальных генах. Предполагается, что данная закономерность вызвана связью между размерами тела и уровнем метаболизма поскольку, чем выше уровень метаболизма, тем больше степень повреждения ДНК кислородными радикалами и, соответственно, выше вероятность возникновения мутаций. Данная гипотеза хорошо объясняет, в частности, сильные различия в скоростях эволюции митохондриальной ДНК гомо- и пойкилотермных животных.
В целом, несмотря на существующие противоречия, гипотеза молекулярных часов принята многими эволюционистами и используется для оценки времен дивергенции различных таксонов (например, Cunningham et al, 1992; Lynch & Jarrell, 1993; Adachi & Hasegawa, 1995; Amason et al, 1996). Считается, что вероятность нахождения "локальных" молекулярных часов для отдельных групп организмов выше при использовании синонимичных замен в гомологичных генах и при сходстве физиологии и жизненных циклов этих организмов (Li, 1997). Для проверки предположения о существовании молекулярных часов разработано несколько статистических тестов. В наиболее простом случае проверяется, насколько отличается филогенетическое древо, построенные с допущением равномерности эволюции исследуемых последовательностей, от древа, полученного без такого допущения для того же набора последовательностей (Felsenstein, 1988). Тест на относительные скорости эволюции ("relative rate test" - Sarich & Wilson, 1967) нацелен на проверку предположения о равенстве скоростей эволюции у двух родственных таксонов в сравнении с к. - л. внешней группой. Подобный ему метод сравнения длин ветвей ("branch-length test" - Takezaki et al., 1995) выявляет отклонения длины отдельных ветвей от средней длины для всего древа.
Среди множества возможных молекулярно-филогенетических маркеров одно из лидирующих мест, как по кругу решаемых задач, так и по объему проводимых исследований, принадлежит митохондриальной ДНК. Митохондриальный геном многоклеточных животных имеет размер 15000-17000 пар нуклеотидов, что составляет приблизительно 1/10000 от наименьшего ядерного генома животных (Li, 1997). Поэтому, по сравнению с ядерным геномом, получить чистые препараты мтДНК достаточно просто. Митохондриальные гены, как правило, уникальны, редко перекрываются и не содержат интронов. Структура митохондриального генома довольно стабильна:
16
13 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК, 22 гена тРНК и контрольный регион, содержащий сайты инициации репликации и транскрипции. Наследование мтДНК осуществляется по материнской линии. Эволюционные изменения происходят без участия рекомбинации за счет кроссинговера, в основном, за счет точечных мутаций, инсерции и вставки сравнительно редки.
Исследование эволюции митохондриальных генов млекопитающих выявило скорость накопления синонимичных замен порядка 5.7*10-8 замен на нуклеотидный сайт в год (Brown, 1982), что почти в 10 раз превышает скорость "молчащей" эволюции в ядерных белок-кодирующих генах. Однако, в том, что касается накопления несинонимичных замен, действие отрицательного отбора проявляется с одинаковой силой и на митохондриальный и на ядерный геномы (Li, 1997).
Калибровке хода молекулярных часов в митохондриальных генах различных организмов посвящено множество работ (Knowlton et al., 1993; Russo et al., 1995; Juan et al., 1996; Hoeh et al., 1996; Peek et al., 1997; Schubart et al., 1998 и др.). Довольно часто делаются попытки оценить скорость эволюции всей мтДНК. Такой подход вряд ли можно считать оправданным, поскольку при этом не учитывается различный вклад синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен, их дифференцированность на транзиции и трансверсии, которые имеют существенно различную динамику накопления (Nei, 1987).
Наиболее точные и надежные оценки темпов эволюции мтДНК животных получены для гена Cyt В млекопитающих (Irwin et al., 1991) и брюхоногих моллюсков рода Nucella (Collins et al., 1996). В обоих исследованиях авторы имели довольно редкую возможность опираться на обширную, а в последнем случае, практически, полную палеонтологическую летопись изучаемых организмов. Дивергентные скорости накопления трансверсий в третьей позиции кодонов в гене CytB млекопитающих и моллюсков близко совпадают друг с другом (0.5% и 0.42% за млн. лет, соответственно). В обоих случаях обнаружено, что период линейного накопления трансверсий составляет не менее 60-80 млн. лет, в то время как в отношении транзиции эффект насыщения сказывается уже после 5 млн. лет. При этом, скорость накопления транзиции в третьем положении кодонов для моллюсков рода Nucella оценивается в 3-4% за
17
млн. лет (Collins et al., 1996). В работе по млекопитающим (Irwin et al., 1991) явных оценок скорости накопления транзиций в 3-й позиции кодонов не дается, но, судя по приведенным графикам, она составляет около 3.75% за млн. лет, т. е. примерно ту же величину что и у моллюсков.
Ген CytB наиболее часто использовался в качестве маркера в молекулярно-филогенетических исследованиях, в основном, благодаря тому, что подбор праимеров, обеспечивающих его амплификацию в ПЦР, не представлял сложности для большинства форм позвоночных животных. Проблема поиска универсальных праимеров для беспозвоночных животных долгое время служила сдерживающим фактором в широком применении молекулярно-филогенетического подхода в изучении их эволюции до тех пор, пока такие праймеры не были найдены для фрагмента гена СО I (Folmer et al., 1994). Ген СО I, кодирующий первую субъединицу цитохром С оксидазы, считается самым эволюционно консервативным во всем митохондриальном геноме (Минченко, Дударева, 1990; Clary, Wolstenholme, 1985; Valverde J. R. et al., 1994). Эта его особенность делает возможным изучение филогении очень далеких таксонов, в то же время, наблюдаемое количество синонимичных замен достаточно для проведения исследований и на межвидовом, и даже, на популяционном уровне (Folmer et al., 1994). Число эволюционных работ на беспозвоночных животных с использованием последовательностей гена СО I в последние годы стремительно возрастает (Knowlton et al., 1993; Juan et al., 1996; Hoeh et al., 1996; Peek et al., 1997; Black et al., 1997; Harasewych et al., 1997; Caterino & Sperling, 1999). Следовательно, этот маркер можно рассматривать как наиболее перспективный для филогенетических исследований, поскольку потенциальных возможностей для сравнительного исследования его эволюции в разных группах беспозвоночных существенно больше, чем для других митохондриальных генов.
4.1.1 Методы филогенетической реконструкции на основе молекулярных данных
Способы оценки генетических расстояний на основе данных о последовательностях ДНК
Простейшее эволюционное событие в молекуле ДНК - фиксация замены одного нуклеотида на другой - занимает тысячи и миллионы лет и не может быть
|
