2 3 2 Введение ретровирусных конструкции в семенники
животных 2 3 3 Оптимизация технологии временного
блокирования сперматогенеза у кроликов
2.4. Заключение 145
Глава 3 Цитогенетические исследования в сохранении .-со генетических ресурсов
3.1. Обзор литературы 152
3.1.1. Цитогенетические различия и видовая изоляция 152
3.1.2. Проявление хромосомного дисбаланса у животных 157
3.1.3. Нарушения в кариотипе при трансгенезе 161
3.2. Материалы и методы исследований 164 6г 3.3. Результаты исследований и обсуждение 166
Усовершенствование метода кариотипирования 3.3.1. различных видов животных с использованием 166
прикладных компьютерных программ
3.3.1.1. Этапы цитогенетического анализа 167
3.3.1.2. Анализ препаратов 168
3.3.1.3. Подсчет и измерение хромосом 170
3.3.1.4. Кариотипирование 171
3 32 Изучение и сравнительный анализ кариотипов яка,
крупного рогатого скота, овцебыка и овец /# 3 3 3 Анализ хромосомных аберраций у трансгенных
животных 3 3 3 1 Цитогенетическое обследование трансгенных
кроликов 3 3 3 2 Изучение влияния чДНК на стабильность
кариотипа трансгенных кроликов 3 3 33 Цитогенетическое обследование трансгенных /^ ' свиней
3 3 3 4 Изучение влияния чДНК на стабильность
кариотипа трансгенных свиней 3.4. Заключение 190
4. Выводы 193
5. Практические предложения 196
6. Список литературы 197
7. Список сокращений 245
Общая характеристика работы.
Актуальность темы. Сохранение генетических ресурсов и рациональное использования животных является неотъемлемой частью биотехнологической и сельскохозяйственной науки. Из 6200 пород животных, относящихся к 40 видам, внесенных в банк данных ФАО/ЕАЖ, более 30% мировых генетических ресурсов домашних животных находятся на грани вымирания (Shend, 1997; Sherf, 2000).
Впервые проблему сохранения генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных поднял A.C. Серебровский (1928) и ввел термин «генофонд». Автор подчеркивал, что «в лице генофонда мы имеем такое же национальное богатство, как в виде нефти, золота, угля, сокрытых в наших недрах». Рассматривая эту проблему, Ю.П. Алтухов с соавторами (1996) ввели термин «природоохранная генетика», который употребим и для популяций сельскохозяйственных животных, поскольку породы - это не что иное, как неотъемлемая часть животного мира.
Одним из выдающихся достижений отечественной науки XX столетия явилась разработка биотехнологического метода искусственного осеменения, позволяющего тиражировать ценные генотипы в сотни и даже тысячи раз, увеличивая их распространение в популяциях и вытесняя при этом малоценные генотипы.
Открытие Миловановым В.К., Соколовской И.И., Смирновым И.В. (1947) возможности длительного сохранения семени животных в глубокоохлажденном состоянии явилось основой для создания криобанка генетических ресурсов высокопродуктивных, редких, уникальных и исчезающих видов животных.
Криобанк семени перед традиционными методами сохранения видов имеет такие преимущества, как возможность транспортировки
5
на большие расстояния; легкость обмена генетического материала между популяциями; высокая степень надежности; сведение до минимума эффекта генетического дрейфа и инбридинга; обеспечение сохранения видов в случае эпидемий, экологических и социальных катастроф; использование отдаленной гибридизации с целью совершенствования животноводства; создание коллекции биологических материалов для различных исследований.
Генетический материал, сохраняемый в криобанке, может быть использован не только для восстановления исчезающих видов, но и для обмена генетическим материалом между популяциями, разводимыми в неволе; для обогащения резерва наследственной изменчивости свободноживущих популяций, находящихся под угрозой исчезновения ввиду их малой численности; при разведении животных-(т носителей уникальных генов, полученных в процессе трансгенеза
(Эрнст Л.К. и др., 1994; Эрнст Л.К., 2004).
Существование вида, его способность выжить в данной среде зависит от сохранности генома, которой вносит сперматозоид в ооцит при оплодотворении. Совокупность механизмов обеспечивающих Р защиту генома в половых клетках самцов, подвергающихся сложным
трансформациям в ходе сперматогенеза, является одним из условий, обеспечивающих существование вида.
Цель и задачи исследований.
Целью диссертационной работы являлась разработка и усовершенствование технологий и методик сохранения и рационального использования генетических ресурсов различных ^ видов животных с использованием биотехнологических методов.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
6
• Усовершенствовать технологию криоконсервации семени кроликов.
• Разработать технологию криоконсервации эпидидимального семени животных.
• Создать банк семени редких, исчезающих и уникальных видов животных.
• Изучить морфологические и гистологические особенности гонад и выполнить сравнительный анализ видовых характеристик сперматозоидов различных видов животных.
• Разработать методологию рационального использования генетических ресурсов.
• Изучить возможность получения трансгенных свиней после многолетнего хранения семени.
• Изучить возможность использования сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в ооциты кролика.
• Усовершенствовать методику кариотипирования с использованием прикладных компьютерных программ и провести цитогенетический анализ животных разных видов.
Научная новизна.
В ходе выполнения диссертационной работы была усовершенствована технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая улучшить биологическую сохранность сперматозоидов, получить более высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов и повысить многоплодие в сравнении с прототипом.
Впервые была разработана технология криоконсервации эпидидимального семени овцебыка, сайгака, яка как метод сохранения редких и исчезающих видов животных. Предложен метод внутритрубного осеменения для размножения трансгенных свиней при наличии ограниченных количеств глубокозамороженного семени.
7
Изучены видовые особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков. Доказано, что в процессе криоконсервации семени, сперматозоиды способны связываться с чужеродной ДНК и переносить ее в ооциты при оплодотворении. Изучено влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомной изменчивости у трансгенных свиней и кроликов.
Практическая значимость.
Предложена усовершенствованная технология
криоконсервации семени кроликов, на основе которой создан банк семени трансгенных кроликов. Разработана технология криоконсервации эпидидимального семени разных видов животных, с использованием которой создан банк семени редких, уникальных и исчезающих видов животных (овцебыков, сайгаков, яков). Создан банк семени трансгенных хряков 6-ти поколений (F2, F3| F4> F5, F6j F7). Доказано, что глубокозамороженное семя трансгенных хряков, хранящееся в жидком азоте более 10 лет, может быть использовано для получения потомства и возобновления трансгенной линии. Разработана методика кариотипирования на основе прикладных компьютерных программ, позволяющая повысить эффективность цитогенетического анализа животных.
Положения, выносимые на защиту.
• Усовершенствованная технология криоконсервации семени кроликов, позволяющая повысить сохранность, оплодотворяющую способность сперматозоидов и многоплодие.
• Технология криоконсервации эпидидимального семени как метод сохранения и рационального использования генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных.
8
• Биологическая полноценность семени трансгенных хряков, хранившегося более 10 лет в криобанке.
• Метод внутритрубного осеменения как способ тиражирования уникальных генотипов при ограниченном запасе семени.
• Морфологические и гистологические особенности семенников яков, сайгаков, овцебыков.
• Морфологические и гистохимические особенности сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков.
• Новая методика кариотипирования на основе использования прикладных программ как способ характеристики генетических ресурсов животных.
• Влияние чужеродной ДНК на уровень хромосомных нарушений и физиологические показатели у животных.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 12 научных конференциях (Москва, Дубровицы, Боровск, Санкт-Петербург, Гаага, Рим), на заседаниях ученого совета ВИЖа. По материалам диссертации опубликовано 33 научные работы, в том числе в центральных журналах - 8, книг - 6, методических рекомендаций - 3, в зарубежных изданиях - 2.
Объем работы. Диссертация изложена на 235 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 73 рисунка, 5 графиков, 3 схемы. Библиографический список содержит 375 источников, в том числе 177 на иностранных языках.
9
Глава 1
СОХРАНЕНИЕ И РАЦИОНАЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ.
1.1. Обзор литературы. 1.1.1. Сохранение генетических ресурсов.
Биологическое разнообразие животных является необходимым элементом для нашей планеты. Сохранение генетических ресурсов должно являться неотъемлемой частью биотехнологической и сельскохозяйственной науки. (Эрнст Л.К. и др., 2004; Багиров В.А. и др. 2003, 2004).
В 20-е годы прошлого столетия выдающимся генетиком Николаем Ивановичем Вавиловым была сформулирована задача мобилизации генофонда для нужд селекции. Под его руководством была создана уникальная коллекция семян культурных и диких представителей флоры, собранная из различных районов мира (Столповский, 1997; Саморуков и Марзанов, 2002).
Огромный вклад в сохранение генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных внес отечественный генетик Александр Сергеевич Серебровский.
В 1978 г. Б.Н. Вепринцев выступил с докладом на XIV Генеральной Ассамблее Международного союза охраны природы, в котором обосновал необходимость создания генетических криобанков и использования методов биологии развития для сохранения биоразнообразия (Veprintsev и Rott, 1979).
Анализ банка данных FAO/EAAP указывают, что более 30% генетических ресурсов домашних животных мира находятся на грани вымирания. По данным FAO каждую неделю исчезает одна порода домашних животных. Из 19 локальных пород КРС Содружества только 6 в нормальном (по численности) состоянии (Столповский, 1997).
10 1.1.2. Общая характеристика овцебыков (Ovibos moschatus).
В последней четверти XX в. в биологической науке России произошло историческое событие: в двух тундровых районах - на полуострове Таймыр и острове Врангеля - созданы жизнеспособные популяции нового копытного вида - овцебыка или мускусного быка (Якушкин Г.Д. 1998).
Самец овцебыка Самка овцебыка
DncyHOK 1. Овцебыки
Овцебык классифицируют следующим образом:
Phyla Chordata Позвоночные -Тип
Mammalia Млекопитающие - Класс
Artiodactyla парнокопытные - Отряд
Ruminata Жвачные - Подотряд
Bovidae Полорогие - Семейство
Caprinae Козьи - Подсемейство
Ovibovini Овцебыки - Триба
Ovibos Овцебык -Род
0. moschatus Овцебык мускусный -Вид
0. m. moschatus ; Овцебык тундровый - Подвид
0. m. wardi Овцебык белоголовый - Подвид
Ovibos moschatus moschatus (Zimmerman, 1780), Ovibos moschatus wardi (Lydekker, 1900)
11
Овцебык - последний представитель так называемой мамонтовой фауны, сохранившийся к настоящему времени. Он населял тундростепи Евразии, проникнув затем и в Северную Америку. В период расцвета мамонтовой фауны тундростепи занимали большую часть территории Европы, Северной Азии и больше половины материка Северной Америки. После этого в результате сильного потепления, размораживания Полярного бассейна, повышения уровня океана, заболачивания почв, деградации грунтовых льдов, усиления снегопадов, появление настов и гололеда и др. - мамонтовая фауна стала быстро деградировать и вымирать (Верещагин, 1959).
На севере Таймыра, долгое время оставалась небольшая
выжившая популяция. Тем не менее, в голоцене мускусного быка не
% стало на всей северной части Евразии. Последняя небольшая
популяция этого вида исчезла на севере Таймыра около 3000 лет
назад (Якушкин, 1998, Царев, 1999).
По предположению Н.К. Верещагина (1979) главной причиной ее исчезновения был не человек, а крайне неблагоприятные fr природные условия. Можно сказать, овцебыки чудом сохранились
лишь на небольших участках наиболее континентальной высокоширотной Канадской Арктики - на островах и материке, а затем, при последующих похолоданиях, распространились здесь и в Гренландии.
Овцебык - удивительное животное, напоминающее с одной стороны овцу, а с другой - быка. Этому соответствует и его название - овцебык, или, как его иногда называют, мускусный бык. Он -довольно крупное травоядное животное с массивным телом, живет в суровых условиях. Длинная густая шерсть закрывает конечности овцебыка почти до самых копыт. По размерам и массе овцебык ближе стоит к такину и яку, но меньше зубра и бизона (Якушкин, 1998).
12
Размеры тела взрослых самцов таковы: длина в среднем 225 см, высота в холке - 145 см, масса - около 300 кг. Самки мельче самцов. На фермах при хорошем кормлении самцы имели массу 635-658 кг. У взрослых быков самые длинные пряди волос имеются на подбородке - до 62 см, по бокам тела, на животе, шее, огузке направляющие и остовые волосы достигают длины 45 см. Пуховые волосы составляют 60-80% шерсти, достигают в длину 5-7 см, они очень тонкие мягкие извилистые, расположенные густо по всему телу. За свой прекрасный шелковистый пух, или кивиут, овцебыки и ценятся (Забродин, 1994; Якушкин, 1998; Царев, 1999).
Критическая температура, которую выдерживает овцебык, очень низка. У недельного теленка она равна -70°С. Ректальная температура у взрослых особей равна 38,4°С. ^, Химический состав молока овцебыка следующий:
Жир 8,0-12,4%
Белок 11-13%
Лактоза 3,6-4,2%
Овцебыки живут стадами и при опасности взрослые самцы * образуют каре, выставив наружу мощные рога. Самки и телята внутри
такого круга оказываются очень труднодоступны не только для волков, но и для белого медведя (Гровес, 1992).
Перед гоном, в июле, самцы-доминанты образуют гаремные стада. Своих соперников они изгоняют из гарема. Средний размер стада 15-20 голов (взрослые самки, неполовозрелые особи и телята). Гон длиться с конца июля по начало октября, а разгар - со средины и августа по начало сентября. Самки полиэструсны. Стельность у
овцебыков продолжается приблизительно 8 месяцев (235 дней; Pharr и Rowell. 1989).
В природе масса новорожденного теленка 7-8 кг, в фермах 10-12 кг, молочное кормление длится 3-4 мес, иногда дольше.
13
Материнская опека продолжается до года (Тепег, 1965; Lent, 1988; Забродин, 1994).
Впервые идея возвращения овцебыка в Российскую Арктику появилась в конце 1920-х годов. С ней связаны имена Н.П. Верховского, С.А. Бутурлина, а позднее - СМ. Успенского.
Вопрос о завозе овцебыков в нашу страну стал еще более актуальным, указывались даже места выпуска - Северный Урал, Таймыр, Якутия, северо-восток Сибири (Насимович, 1933).
С.С. Шварц (1959) дал классическое определение процесса акклиматизации овцебыков, A.A. Насимович (1972) показал важность соблюдения экологических и географических параметров районов отлова и расселения овцебыков.
В 1974 г. правительство Канады приняло решение подарить СССР стадо овцебыков. В 1975 г. такое же решение приняло правительство США.
Главную работу по выбору районов выпуска животных провели специалисты Норильского института сельского хозяйства Крайнего Севера (НИИСХ) СО РАСХН и особенно - Г.Д. Якушкин, В.А. Забродин в процесс переселения овцебыков и борьбы за их выживание на полуострове Таймыр.
Сотрудниками «Центральной научно-исследовательской лаборатории охотничьего хозяйства и заповедников Охотдепартамента МСХ России» проводиться огромная работа по расселению и одомашниванию овцебыка на севере России.
1.1.3. Общая характеристика яков (Bos mutus).
Як (Bos mutus) стоит особняком среди собственно быков, и иногда специалисты выделяют его в особый подрод (Poophagus). Яки -животные парнокопытные млекопитающие входят в семейство
14
полорогих и подсемейство быков. Кроме них, в этом же подсемействе зубр, бизон, буйвол и живущие и Южной Азии гаур, гаял и бантенг (Сарбагишева и др 1994).
Рисунок 2. Як Яки крупное животное с длинным телом, относительно
короткими ногами и тяжелой, низко посаженной головой. По фенотипу он занимает приблизительно между зубром, буйволом и КРС (Денисов, 1958).
Яки водятся в высокогорных районах Средней Азии, Тибете, на севере Китая, в Монголии и других странах. Домашние стада процветают только высоких горных местностях, суровый холод переносят легко. Одомашненные яки уже около трех тысяч лет заменяют и корову, и лошадь, и овцу, и свинью. Люди получают от них молоко, шерсть, мясо. Молоко яков очень густое, богатое белком и жиром (Вердиев и Ерин, 1981; Денисов В.Ф. 1983г.)
Як населяет безлесные высокогорные щебнистые полупустыни, пересекаемые долинами с болотами и озерами. В горы он поднимается до 5200 м. В августе и сентябре яки уходят к границе вечных снегов, а зиму проводят в долинах, довольствуясь скудной травянистой растительностью, которую могут добыть из-под снега (Денисов, 1958; Паденко, 1976).
_
15
Яки не образуют больших стад. Обычно они держатся группами по 3-5 животных, и лишь молодые собираются в несколько большие стада. Старые быки ведут одиночный образ жизни (Денисов, 1958).
Средняя продолжительность внутритрубного развития яков составляет 257 дней. Отелы в основном происходит весенние месяцы (Сарбагишев, 1994).
Домашние яки скрещиваются с крупным рогатым скотом. Полученные гибриды - хайныки - отличаются большой работоспособностью, дают молоко и мясо. Правда, гибридные самцы-хайныки бывают бесплодными. Гибридные коровы дают потомство (Буйная и Мусиенко, 1981; Гайдышева, 1981; Денисов, 1958).
1.1.4. Общая характеристика сайгаков (Saiga tatarica).
У сайгаков два подвида (Saiga tatarica tatarica и Saiga tatarica mongolica). Сайгак - некрупная антилопа, высоконогая, легкая и подвижная. У них крупная голова с вздутой горбатой мордой, оканчивающейся как бы небольшим хоботком.
»•(1
Сайгак самки
. и • ' ЯЛ
Сайгак самец
Рисунок 3. Сайгаки
У самцов - небольшие полупрозрачные светлые рога с темными кончиками, самки безроги. Самые крупные взрослые животные не превышают 60 кг, в среднем самцы бывают порядка 45
16
кг, а самки - 30-35 (Лущекина, 2002; Соколов и Жирнов, 1988; Кузнецов 1988; Арылов, 2002).
Сайгаки стадные животные. Миграция стад сайгаков -удивительный природный феномен. Осенью, с наступлением зимы, сайгаки постепенно перемещаются из степей на юг - где снега нет. Летом, когда на юге травы выгорают и пересыхают водоемы, сайгаки двигаются на север. В мигрирующих стадах могут собираться тысячи животных, двигающихся сплошным потоком. Весной, при рождении молодняка, сайгаки обычно концентрируются на традиционных участках, причем подходят туда постепенно, группами. После 10 дней саигаченок уже практически постоянно следует за самкой (Лущекина, 2002; Арылов Ю.Н. и др. 2000).
История сайгака - как качели - то это основной охотничий объект в степях, то вид, находящийся на грани исчезновения.
600 -, 4-50 -400-350 -300 ¦ 2S0 -200 -ISO -100 -SO -
о
1980
1985
1990
1995
2000
Рисунок 4. Изменение численности калмыцкой популяции сайгака в последние 20 лет. Milner-Gulland E.J., et al. 2001.
За последнее десятилетие возникло множество новых проблем, связанных с сайгаками. С одной стороны восстановление степных экосистем, а значит - увеличение площадей биотопов, пригодных для обитания сайгака. А с другой стороны - резко возросло

 Часть из работы     Получить работу