5 ВВЕДЕНИЕ.
4
Перечень условных обозначений, наименований, сокращений, используемых в тексте.
Ig G, Ig M - иммуноглобулины G, иммуноглобулины М;
тх - ошибка;
р - уровень доверительной вероятности;
Rf - коэффициент подвижности;
X - средняя арифметическая;
X - длина волны;
АлАТ - аланинаминотрансфераза;
АсАТ - аспартатаминотрансфераза;
БАВ - биологичеки активные вещества;
ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГАМК - гаммааминомаслянная кислота;
ГКА - глюкозо-картофельный агар;
ГКС - глюкозо-картофельная среда;
ДВ - действующее вещество;
ИПС - изопропиловый спирт;
ИЭ - интенсэффективность;
КЖ - культуральная жидкость;
КРС - крупный рогатый скот;
ЛД - летальная доза;
МПБ - мясопептонный бульон;
НОК - неокисленная олеиновая кислота;
НЭЖК - неэтерифицированные жирные кислоты;
ОК - олеиновая кислота;
ПЭФ - петролейно-эфирная фракция;
СРО - свободнорадикальное окисление;
ТСХ - тонкослойная хроматография;
ХЛ - хемилюминесценция;
ЭЭ - экстенеэффективность.Актуальность. Паразитозы сельскохозяйственных животных широко распространены во всем мире и вызывают тяжелые поражения различных органов и тканей, нанося тем самым значительный экономический ущерб, связанный со снижением продуктивности, ухудшением качества животноводческой продукции, а в отдельных случаях и гибелью животных. В связи с этим, одной из важных задач ветеринарной медицины и биотехнологии является создание и применение эффективных и безопасных лечебных средств широкого спектра антипаразитарного действия. Применяемые до недавнего времени методы борьбы с экто- и эндопаразитами животных, основанные на использовании химических препаратов, загрязняющих окружающую среду и являющихся зачастую высокотоксичными для животных, не всегда давали желаемый результат (Т. Г. Никулин, А. А. Шевцов, 1984; А. А. Антипов, 1993).
Новым этапом в борьбе с паразитозами животных явилось открытие авермектинов, продуцируемых микроорганизмом Streptomyces avermitilis и обладающих широким спектром противопаразитарной активности (W. С. Campbell, М. Н. Fisher, E. G. Starley, 1983). На основе этих соединений в ряде зарубежных стран созданы препараты, содержащие в качестве действующего вещества (ДВ) ивермектин - комплекс гидрированных форм авермектинов Bia и Вш (ивомек, баймек, цевамек и др.). Эти препараты нашли широкое применение в
i ветеринарной практике во многих странах мира, в том числе и России (И. А.
1 Архипов, 1987; В. А. Апалькин, Н. М. Корешков, 1991; Ф. А. Волков, 1993; Р.
1 Т. Сафиуллин, 1997).
Исследования по разработке отечественной технологии биосинтеза авермектинов, начатые в НПО «Биотехнология» в конце 80-х годов, позволили соз-
i
дать первые образцы авермектинсодержащих препаратов аверсект-1 и ниацид (В. А. Мосин, В. А. Дриняев, М. Н. Мирзаев, 1992-1993; В. А. Дриняев, С. Н. Савченков, Т. С. Стерлина и др., 1995). В настоящее время в России известны и другие противопаразитарные средства, созданные на основе натуральных авер-
6
мектинов - аверсект-2, ивертин, рустомектин (Т. С. Гульчинская, 2001). Перечисленные препараты зарегистрированы в РФ, достаточно широко апробированы в ветеринарной практике, но многие вопросы, связанные с воздействием их на иммунобиологический статус животных, технологией применения с учетом вида животных и др. требуют дальнейшего изучения и уточнения. Об этом свидетельствуют, например, данные (В. А. Дриняев, В. А. Мосин, Е. Б. Кругляк, 1998) о регулирующем действии авермектинов на деление клеток макроорганизмов.
Другой важной задачей является рациональное использование биомассы продуцента авермектинов, являющейся отходом производства. Возможным путем использования отработанной биомассы Streptomyces avermitilis при производстве авермектинов является получение на ее основе других биологически активных веществ.
Следует отметить, что научных разработок в этом направлении очень мало, хотя в ряде стран с развитой биотехнологической промышленностью проблема рационального использования биомассы микроорганизмов решена не полностью. Таким образом, при изучении возможности использования биологически активных веществ биомассы Streptomyces avermitilis, важно исследовать ее биохимический состав и метаболизм самого микроорганизма.
Многочисленные данные литературы указывают на возможность использования в ветеринарной практике ряда соединений (липиды, белки, полисахариды), синтезируемых микроорганизмами и обладающих биологически активными свойствами (А. И. Журавлев, 1975; В. Д. Кузнецов, Т. П. Ефимова и др., 1975; М. И. Рецкий, 1998 и др.).
Поэтому работы по использованию биомассы, а также побочных продуктов, образующихся при производстве авермектинов, в качестве сырья для получения биологически активных веществ являются актуальными, имеющими народно-хозяйственное и экологическое значение.
Цель и задачи исследований. Целью работы является изучение воздействия на иммунобиологический статус свиней противопаразитарного препарата
7
ниацид, получаемого по технологической схеме, ориентированной на безотходное производство.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• изучить биосинтез авермектинов и липидов микроорганизмом Strepto-myces avermitilis-56 при культивировании глубинным способом;
• отработать технологию выделения, очистки и определения фракционного состава липидов биомассы продуцента авермектинов;
• определить лечебно-профилактическую эффективность ниацида, содержащего в качестве действующего вещества полный авермектиновый комплекс и абамектин;
• изучить влияние препарата на гематологические, биохимические и иммунологические показатели организма животных;
• оценить биологически активные свойства липидов биомассы Strepto-myces avermitilis-56 на лабораторных животных и модельных системах.
Научная новизна работы. Впервые показано стимулирующее влияние противопаразитарного препарата ниацид на бактерицидную активность сыворотки крови свиней, а также отсутствие отрицательного воздействия его на факторы клеточного, гуморального иммунитета и основные биохимические показатели.
Впервые изучены фракционный состав и биологически активные свойства липидов биомассы продуцента авермектинов S. avermitilis-56. Показано, что петролейно-эфирная фракция обладает достаточно высокой антиокислительной активностью. Выявлена ростстимулирующая способность липидов S. avermitilis на микро- и макроорганизмы (Е. coli, белые мыши).
Предложена технологическая схема выделения и очистки липидной фракции биомассы Streptomyces avermitilis.
Практическая и теоретическая значимость. Получены экспериментальные данные для уточнения технологии применения противопаразитарного препарата ниацид при лечении гельминтозов свиней и составлены изменения к
8 наставлению по его применению.
Результаты исследования состава и биологически активных свойств ли-пидной фракции биомассы Streptomyces avermitilis могут быть использованы при разработке безотходной технологии получения авермектинов.
Апробация результатов работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 2000 г. и на «Методической и научной конференции» Московской Государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина, 2001г.
Публикация результатов исследований. Опубликованы 4 работы, в том числе 3 по теме диссертации.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Данные по эффективности препарата ниацид при лечении гельминтозов в условиях Подмосковья, Республики Беларусь, Омской области, а также воздействие его на биохимические, гематологические и иммунологические показатели животных.
2. Выделение, очистка и определение фракционного состава липидов биомассы Streptomyces avermitilis-56.
3. Биологически активные свойства липидной фракции биомассы Streptomyces avermitilis-56.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста. Содержит 13 таблиц и 18 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по использованию научных выводов, библиографического списка и приложения. Список литературы включает 177 источников, из них 131 отечественных и 46 иностранных авторов.
9 I. Обзор литературы
1. Стрептомицеты как объекты биотехнологии. 1.1 Общая характеристика стрептомицет.
Стрептомицеты привлекают большое внимание ученых-биотехнологов в связи с тем, что они являются продуцентами широкого спектра биологически активных соединений (антибиотики, ферменты, витамины и другие вещества), используемых в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и других отраслях народного хозяйства.
Стрептомицетами в мировой литературе называют представителей рода Streptomyces группы 25 «Срептомицеты и близкие роды»[102].
В «Определителе актиномицетов» [103] род Streptomyces Waksman et Henrici (1943) показан как синоним Actinomyces.
Описаны разнообразные питательные среды для выращивания и поддержания актиномицетов и биосинтеза с их помощью биологически активных веществ, в том числе антибиотиков [32]. Наиболее распространенные в промышленности и условно разделенные на группы по составу (в основном по доминирующему компоненту) или по назначению питательные среды приведены в работе С. М. Семенова [127].
Микроорганизмы рода Streptomyces образуют на плотных средах хорошо развитый мицелий, который подразделяется на субстратный и воздушный. Колонии обычно небольшие, 1-10 мм в диаметре, плотные, кожистые, врастающие в субстрат [91, 92].
Поверхность агара, как правило, покрыта мучнистым, бархатистым или пушистым воздушным мицелием, который чаще всего толще субстратного и обладает гидрофобными свойствами. Цепочки спор образуются на специальных спороносящих гифах, отходящих от стерильных гиф воздушного мицелия мо-ноподиально или в виде пучков.
10 Стрептомицеты образуют различные пигменты, являющиеся продуктами
вторичного метаболизма. Они обуславливают окраску воздушного и субстратного мицелия, а также субстрата [103].
1.2 Практически значимые биологически активные вещества, продуцируемые стрептомицетами.
1.2.1 Антибиотики.
Среди стрептомицет выявлено множество представителей, угнетающих рост других микробов при помощи вырабатываемых ими антибиотиков. В настоящее время известно несколько тысяч антибиотиков, а практически используется только малая часть. Объясняется это тем, что многие препараты имеют высокую химиотерапевтическую активность, но ядовиты для человека и животных. В тоже время известно значительное количество антибиотиков, пригодных для широкого применения в ветеринарии и животноводстве [18, 38, 48, 106].
Так, свойства некоторых кормовых антибиотиков позволяют не только профилактировать различные заболевания, но и стимулировать рост и развитие животных [74].
Антибиотик стрептомицин, выделенный из Act. streptomycini, обладает широким спектром действия, он подавляет рост грамположительных и грамот-рицательных микробов, таких, как стафилококки, стрептококки, а главное -действует на возбудителя туберкулеза, который относится к кислотоустойчивым микробам. Стрептомицин наиболее активен в аэробных условиях, не подавляет рост анаэробов, грибов, риккетсий, вирусов, механизм его действия связан с ингибированием синтеза белка [3, 64].
Из культуральной жидкости Act. kanamyceticus выделен антибиотик ка-намицин. Препарат подавляет рост микробов, устойчивых к пенициллину, стрептомицину, левомицетину, тетрациклинам и другим антибиотикам. Ток-
11
i сичность для животных такая же, как и у стрептомицина, но ниже чем у неоми-
цина, с которым он имеет много общего. Сульфат канамицина вводят, в основ-1 ном, внутримышечно [18, 3].
Неомицин - комплекс антибиотиков (колимицин, мицерин и др.), образуемый при биосинтезе Act. fladiae и других грибов. Применяют сульфат не-i омицина В, который хорошо растворим в воде и слабо - в спиртах. Сохраняется
до двух лет как в кристаллическом состоянии, так и в растворах. Неомицин — антибиотик широкого спектра действия, но к нему устойчивы клостридии, грибы, некоторые штаммы синегнойной палочки. Антибиотическая активность на многие микробы выше, чем у стрептомицина, но он более токсичен. Вызывает потерю слуха и воспаление почек [18].
Микроорганизм Streptomyces griseus является продуцентом антибиотика кормогризина, который получают при глубинной ферментации микроба на сре-^ де, содержащей кукурузную муку, крахмал и минеральные соли. Антибиотик
обладает малой токсичностью для теплокровных, угнетает развитие значительного количества видов бактерий, грибов и дрожжей. Используют и высушенную массу мицелия S. griseus, которую вносят в корм как ростстимулирующую добавку, оказывающую положительное влияние на обмен веществ животных. Хороший эффект дает кормогризин при откорме свиней, а также индеек, гусей и другой птицы [10, 24, 31,48, 49,107,108, 8].
Антибиотик витамицин продуцируется стрептомицетом Streptomyces
^ aureverticillatus. Препарат представляет собой высушенную культуральную
жидкость вместе с мицелием. Установлено, что биологическая активность ви-
тамицина может компенсировать недостачу в кормах витамина А. Препарат ус-i
коряет рост животных и позволяет экономить корма [65, 17, 50].
! Культурой S. aurigineus вырабатывается антибиотик кормарин. Препарат
готовят из смеси культуральнои жидкости и мицелия-продуцента, высушенных на распылительной установке. Кормарин содержит витамины группы В, гормо-^ ноподобные вещества и другие факторы роста. Использование кормарина в ра-
ционах животных и птицы повышает приросты живой массы, улучшает обмен
12 веществ и усвояемость компонентов корма [18].
Флавомицин (продуцент S. bambergiensisj применяют как стимулятор роста свиней. Кормовой антибиотик виргиниемицин (продуцент S. virginiae) является хорошим стимулятором роста с длительным действием, используемым при выращивании животных. В значительных количествах применяют румен-зин (продуцент S. cinnamonensis), улучшающий переваримость корма за счет замедления скорости его прохождения по пищеварительному тракту [3].
Имеются сведения о широком использовании тилозина (продуцент S. fra-diae), обладающего широким антимикробным спектром, но в основном действующим на грамположительные микроорганизмы. На кишечную палочку, в частности, он влияет слабо. Введение данного препарата в кормовой рацион свиней способствует большему приросту живой массы, чем введение других антибиотиков [65,18].
1.2.2 Витамины, аминокислоты.
Немаловажным можно считать и образование стрептомицетами таких биологически активных веществ как витамины, аминокислоты и др.
В мицелии стрептомицет, являющемся главным отходом микробиологического производства, накапливается 16-17 аминокислот, микроэлементы, полисахариды и т.д. [114,105].
Общая сумма аминокислот в мицелии колеблется от 130,19 до 325,27 мг/кг сухой биомассы. Среди них обнаружены незаменимые аминокислоты (лизин, гистидин, метионин, треонин, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин), частично заменимые (аргинин, глицин, тирозин), заменимые (глутаминовая, ас-парагиновая кислота, аланин, серии, пролин) [17].
Стрептомицеты (S. tyoideus, S. aviculastus и др.) также используются для получения аминокислот (L-аланина и др.) [65].
Некоторые стрептомицеты (Streptomyces aurantiaca), культивируемые на отходах животноводческих ферм или гидролизате древесины, позволяют полу-
13
чать массу, содержащую не только Р-каротин, но и витамины группы В и антибиотики [65, 53].
По данным Л. П. Ковальчука культуры Act. griseus 15, Act. aureoverticilla-tus 1306 и Act. aurigineus 2377 в процессе выращивания на различных средах синтезируют витамины группы В (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, никотиновую кислоту и истинный витамин В12).
Сравнительное исследование содержания витаминов в мицелии и культу-ральной жидкости показывает, что разные виды актиномицетов при выращивании их в одинаковых условиях незначительно отличаются по способности синтезировать витамины группы В. Витамин В12 накапливается в основном в мицелии, а остальные изучаемые витамины (до 80%) выделяются в ферментационную среду [80,79,23].
1.2.3. Липиды.
Среди веществ, входящих в состав клеток микроорганизмов, особая роль принадлежит липидам. Эти соединения выполняют самые разнообразные функции - входят в состав клеточных мембран, митохондрий, являются составной частью ферментов, участвуют в процессе активного переноса электронов и различных веществ внутри клетки, оказывают влияние на биосинтез нуклеиновых кислот и белков [28, 34,152].
Исследования ряда авторов показывают, что липиды обладают различной биологической активностью: антибактериальной, радиозащитной, иммунологической, противоопухолевой и т.д. [19,94,96,88,176].
Имеются сообщения об адъювантных свойствах отдельных липидов, видимо, за счет повышения активности макрофагов [9,68].
Липидный состав стрептомицетов неоднороден. В него входят следующие основные классы соединений: эфиры стеринов, триглицериды, свободные жирные кислоты, диглицериды, моноглицериды, стерины и фосфолипиды. Преобладающим классом являются триглицериды [60,71].
14 Результаты опытов по изучению анаболического действия стеринов Strep-
tomyces griseus на цыплятах породы леггорн показали, что стерины обладают достоверным ростстимулирующим действием в дозе 1 мкг на голову в сутки. Увеличение этой дозы в 2 раза снижает эффект, что говорит о высокой биологической активности этой фракции [111, 112].
Высокий ростстимулирующий эффект обнаружен и у стеринов из мицелия Act. canosus. Так, в опытах на белых крысах парентеральное введение 1-2 мг стеринов в растворе вазелинового масла вызывало увеличение привесов на 40-60% [ПО, 111].
Установлено достоверное эстрогенное действие на половую систему самок крыс стеринов стрептомицет при семикратном внутрибрюшинном введении в дозах от 7,2-17 мг на животное в сутки [111].
Липидные фракции актиномицетов обладают не только антимикробными щ свойствами по отношению к ряду тест-микроорганизмов (грамположительные
и грамотрицательные бактерии, дрожжи и дрожжеподобные грибы рода Candida), но и антиоксидантной активностью, а при внутримышечном введении повышают естественную резистентность и интенсивность роста поросят на 15-20%, что снижает затраты корма на 15-23% [35,36,37].
Липидные фракции разных видов актиномицетов обладают неодинаковой антиокислительной активностью. Так, в разной степени выраженными свойст- вами обладают фосфолипиды, стерины и свободные жирные кислоты, значи-4р тельную антиокислительную активность проявляют моноглицериды. Трудно
говорить о взаимосвязи антиокислительной активности с другими биологиче- скими свойствами липидных фракций, но можно отметить, что стерины, имеющие низкую антиокислительную активность, не обладают эстрогенным действием [111].
Особое внимание было уделено фосфолипидной фракции, поскольку антибиотики этой природы (например, флавомицин), по мнению авторов, могут ^ оказаться наиболее эффективными для применения в практике [ПО].
Фосфолипиды микроорганизмов представляют собой обширную группу
15 соединений, содержащих глицерин, остаток фосфорной кислоты, жирные ки-
слоты и спирты. Фосфолипиды или глицерофосфаты (в микроорганизмах их не менее 10) необычайно лабильны, легко превращаются и участвуют в метабо-
' лизме клеток. Располагаются фосфолипиды, преимущественно в мембранах,
причем, активность ферментов внутренних и внешних мембран митохондрий изменяется в зависимости от степени ненасыщенности входящих жирных кислот. Их биологическая роль заключается в активации молекул акцептора и об-разовании активных промежуточных продуктов [56, 22,101].
Фосфолипиды оказывают существенное влияние на транспорт веществ из внешней среды в клетку, активизируют синтез большой группы ферментов, участвуют в обмене нуклеиновых кислот, т.е. являются связующими соединениями в узловых пунктах метаболизма. В некоторых случаях фосфолипиды определяют вирулентность бактерий, а иногда обладают бактерицидным и бакте-риостатическим действием [81, 82, 83, 111]. В мембранах клетки очевидно расположены и ферменты, воздействующие на фосфолипиды, так называемые фосфолипазы, гидролизующие эфирные связи в молекулах фосфолипидов. Следовательно, фосфолипиды могут рассматриваться как динамические компоненты биомембран, поддерживающие постоянство и стабильность мембранной организации путем тонкосбалансированных реакций распада и ресинтеза.
В настоящее время фосфолипиды привлекают к себе внимание исследователей в аспекте использования их в качестве биоантиоксидантов.
. Известно, что в условиях практически полной изоляции животных от
прямого воздействия факторов внешней среды они нередко оказываются в различных стрессовых ситуациях - гиподинамия, гипоксия, транспортировки на значительные расстояния, несбалансированное кормление и т.д. В таких экс-
: тремальных условиях в организме возникают реакции свободно-радикального
(перекисного) окисления. Это приводит к снижению продуктивности животных, повышению расхода корма на единицу продукции, а в тяжелых условиях вызывает глубокие нарушения обмена веществ типа кетозов. Блокировать про-цессы перекисного окисления могут только вещества называемые антиоксидан-
16
тами.
По данным Т. Н. Раковой фосфолипиды стрептомицет стабилизируют систему антиоксидантной защиты организма, что свидетельствует о целесообразности их применения для нормализации роста переболевших животных, ги-потрофиков, а также в целях профилактики отрицательных последствий транспортного стресса [114].
Следует отметить, что по данным того же автора, фосфолипиды стрепто-мицет обладают анаболическими и адъювантными свойствами [9,11].
Опыты, проведенные на поросятах-гипотрофиках, масса которых в возрасте 26 дней не превышала 3,6 кг, показали, что спустя месяц после применения препарата масса контрольных поросят составила 9,2+0,15 кг, а опытных значительно больше - 10,9±0,13 кг. Тем самым между контрольной и опытной группами выявлены достоверные различия в изменении прироста массы. ^ В опытах с поросятами, которым одновременно с вакцинами вводили
фосфолипиды, повышение уровня иммунного ответа подтверждалось такими изменениями иммунного статуса, как увеличение фагоцитарного числа (с 2,83+0,32 до 3,61+0,39), увеличением количества плазматических клеток в 2,1 раза по сравнению с контролем. Количество же Т-лимфоцитов превышало показатели контрольных животных в 1,5 раза, а В-лимфоцитов в 1,4 раза.
Комплекс липидов Str. griseus 15, извлеченный из мицелия петролейным эфиром, имеет высокую биологическую активность, которая обусловлена со-щ держанием веществ стериновой природы. Стерины в комплексе с полисахари-
дами и фосфолипидами оказывают иммуностимулирующее действие при введении животным в процессе вакцинации, что дает возможность применять их для коррекции иммунного ответа [114, 115].
Петролейно-эфирная фракция липидов Str. griseus повышает естественную резистентность животных, активизирует азотистый, углеводно-липидный, минеральный и витаминный обмен веществ, обеспечивает стабильный прирост «_ живой массы по сравнению с контролем на 13-16%, не изменяя при этом веса
паренхиматозных органов и химического состава мяса [114,117].
17 Следует отметить существенное изменение минерального обмена под
воздействием петролейно-эфирной фракции липидов. Установлено положительное действие препарата на содержание таких важнейших микроэлементов, как медь, цинк, кобальт и марганец, транспорт аминокислот через мембраны клеток и синтез белка.
Показано также, что липидные фракции актиномицетов обладают антибиотическими свойствами селективного действия по отношению к различным микроорганизмам (St. aureus 209, Вас. subtilis 6633, Е. coli 113-3, Cand. albicans и др.). Антибиотическая активность обусловлена содержанием в них фосфоли-пидов и проявляется при определенной очистке последних [109].
1.2.4 Авермектины и другие противопаразитарные вещества.
Значительное место среди метаболитов стрептомицет, применяемых в ветеринарии и животноводстве, занимают противопаразитарные вещества широкого спектра действия.
Так, микроорганизмом Streptomyces cyanogrisens sp. p. noncyanogenus продуцируется соединение - немадектин, из которого путем химической модификации получается моксидектин, который является действующим веществом противопаразитарного препарата цидектина.
В работах отечественных и зарубежных исследователей приведены факты о его высокой эффективности при паразитозах животных. Так, Е. Т. Lyons, J. Н. Drudge, I. С. Tolliver (1989) показали высокую эффективность немадектина при нематодозах пищеварительного тракта овец.
А. А. Антипов (1993) показал 100% эффективность цидектина против ме-тастронгил. При псороптозе и гематопинидозе телят, псороптозе овец и желудочно-кишечных и легочных стронгилятозах овец и телят цидектин также показал 100% эффективность [21].
В опытах по применению цидектина на спонтанно инвазированных поро-
18 сятах и свиноматках показано, что эффективность препарата против аскарид
составила 100%, эзофагостом - 90% [123].
Мильбемицины, выделенные из Streptomyces hygroscopicus, по химической природе представляют собой макроциклические лактоны, обладающие широким спектром инсектоакарицидного действия, особенно против гельминтов крупного рогатого скота [137,172,174].
Особое внимание исследователей привлекают такие метаболиты, как авермектины, обладающие широким спектром противопаразитарной активности и относительно безвредные для животных и окружающей среды. Эти соединения продуцируются микроорганизмом Streptomyces avermitilis и представляют собой по химическому строению 16-членные макролиды, в состав которых входят лактон и дисахарид, состоящий из двух остатков олеандрозы.
В настоящее время в ветеринарной практике используется много проти- вопаразитарных средств на основе авермектинов: ивомек, аверсект, ниацид, ци-дектин, баймек, фармации и др.
Механизм действия авермектинов на паразитов (W. С. Campbell, 1983) следующий:
- у нематод авермектин стимулирует образование гаммааминомаслянной кислоты (ГАМК) нервными окончаниями с усилением связывания ГАМК с постсинаптическими ГАМК-рецепторами. При этом происходит блокировка передачи нервных импульсов, вызывающая паралич нематод.
- у членистоногих (иксодовые и чесоточные клещи, вши, насекомые) па-разитов авермектин блокирует передачу нервных импульсов между нервным окончанием и клеткой мышечной ткани посредством усиления ГАМК эффекта.
Ивермектин же является химически модифицированным членом семейства авермектинов. Он состоит из пары близких гомологов, отличающихся только одной метильной группой. Ивермектин содержит не менее 80% 22, 23- дигидроавермектина В1а и не более 20% 22, 23-дигидроавермектина В16. Компонент В1а имеет молекулярный вес 874, а компонент В1б - 860 [143,148].
19 2. Биотехнологические процессы получения авермектинов и готовых
лекарственных средств на их основе.
Для биосинтеза авермектинов в настоящее время используются высокопродуктивные штаммы Streptomyces avermitilis, которые были получены из диких культур путем воздействия мутагенных факторов и селекции.
Первое описание культуры Streptomyces avermitilis MA 4680 (NRRL 8165) как продуцента авермектинов появилось в 1979 г. С тех пор в разных коллекциях микроорганизмов зарегистрировано несколько новых штаммов. Во Всероссийской коллекции микроорганизмов имеется типовой штамм Streptomyces avermitilis под номером ВКМ Ас 1301 [61].
В результате изучения морфологической изменчивости популяции S. avermitilis ВКМ Ас 1301 на 18 агаровых средах обнаружено, что в наибольшей степени она выражена на 2 %-ном глюкозо-картофельном агаре (ПСА). В популяции выявлено 9 разновидностей колоний, различающихся цветом воздушного и субстратного мицелия [61].
В результате многоступенчатого отбора получены моноизоляты, обладающие более высокой продуктивностью. Типичная хроматограмма одного из отобранных моноизолятов (рис. 1) показывает, что штамм продуцирует все четыре основных компонента А\, А2, Bj и Вг, но в разном количестве [62, 63].
В самом авермектиновом комплексе преобладают компоненты Ai и Аг, обладающие меньшим противопаразитарным эффектом, чем компоненты Bi и В2. Штамм продуцирует значительное количество высокотоксичного олигоми-цинподобного компонента. Все перечисленные причины делают штамм S. avermitilis ВКМ Ас 1301 технологически малопригодным для организации производства препаратов на основе авермектинов.
В НПО «Биотехнология», Ml 11 «Бифидум» путем отбора из штамма 1301 был получен естественный мутант, имеющий лабораторное название S. avermitilis - 198. Штамм депонирован во Всероссийском институте сельскохозяйственной микробиологии под номером S. avermitilis - 50.
20
At
Рис. 1. Хроматограмма спиртового экстракта одного из моноизолятов S. avermitilis ВКМ Ас 1301: А], A2j Bj, В2 - авермектины.
Полученный штамм отличается от исходной культуры значительно меньшей морфологической гетерогенностью и при посеве на 2 %-ный ГКА дает популяцию, состоящую на 95 % из основного варианта, который образует обильно спорулирующие плотной консистенции выпуклые колонии серовато-коричневого цвета. На отдельных колониях к 10-му дню развития образуются белые бархатистые включения размером до 1 мм в диаметре. К 21-му дню развития колонии достигают в диаметре 7-9 мм. В процессе развития колонии меняют окраску с белого через серый и темно-серый до серовато-коричневого. Обратная сторона колонии темно-каштановая. В агар выделяется темно-каштановый пигмент.
Проверка авермектинобразующей способности полученного штамма показала, что его продуктивность почти вдвое превышает продуктивность коллекционного штамма и сохраняется после пятикратного пассирования.
Наиболее существенным отличием штамма 198 является повышение процентного содержания в авермектиновом комплексе авермектина Bj до 31,3 %.
Содержание олигомицинподобного компонента в культуральной жидкости (КЖ) S. avermitilis - 50 снизилось почти в три раза по сравнению с содержа-

Получить работу