ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
АУВ - ароматические углеводороды
БК - бензойная кислота
БП - 3,4-бенз(а)пирен
ВРФН - водорастворимая фракция нефти
ЕС - эффективная концентрация
ЕС5о - полуэффективная концентрация
ЗВ - загрязняющие вещества
К - контроль
М Д - 2-метил-1,3 -диоксол ан
МДК - максимальная допустимая концентрация
ПАУ - полициклические ароматические углеводороды
ПДКр - предельно допустимая концентрация вещества для рыбохо-
зяйственных водоемов
ПК - пороговая концентрация
п-К - параксилол
п-ТК - пара-толуиловая кислота
УВ - углеводороды
ХА - хромосомные аберрации
G - темп размножения клеток водорослей
AL - прирост длины
F] - F7 -1 -VII поколения листецов ряски
Кп - коэффициент прироста численности клеток водорослей
LC50 - полулетальная концентрация, вызывающая гибель 50 % особей
LT5o - время, за которое погибают 50 % особей
N - численность клеток водорослей
Р - степень достоверности различия с контролем
Р<0,05 - статистически достоверные различия с контролем: *- (0,05) на первом уровне значимости, **- (0,01) на втором уровне значимости, ***-(0,001) на третьем уровне значимости
X - средняя арифметическая
S_ - ошибка средней
X
* - статистически достоверные различия с К
# - разница с К > 25 %
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Антропогенное воздействие на биосферу - одна из первостепенных глобальных экологических проблем. Интенсивное развитие нефтяной, нефтеперерабатывающей и химической промышленности привело к тому, что популяции живых организмов вынуждены длительное время находиться в условиях поликомпонентного загрязнения и приспосабливаться к хроническому действию токсических веществ.
Среди веществ, попадающих в поверхностные водные объекты со стоками предприятий, одно из первых мест по разнообразию биологической ак- тивности занимают ароматические и гетероциклические соединения с двумя гетероатомами в цикле, особенно азот-, и кислородсодержащие (Ровинский и др., 1988; Елин, 2001; Левина, 2002). В эту группу входят бензол и его производные, а также диоксоланы. Некоторые из этих веществ являются исходными (2-метил-1,3-диоксолан и параксилол) и побочными (бензойная и пара-толуиловая кислоты) продуктами синтеза полиэфирных волокон (Благовещенский химический комбинат «Полиэф»), которые со сточными водами бу- дут поступать в р. Белую - водоем высшей рыбохозяйственной категории и источник питьевого водоснабжения городов и населенных мест Башкортостана.
Анализ литературных источников свидетельствует о весьма ограниченной информации, позволяющей составить представление об экологической опасности этих веществ (Benville, 1977; Кондратьева, 2000). Хотя известно, что родоначальник класса ароматических соединений — бензол обла- дает выраженным токсическим и мутагенным действием как на теплокровных животных и человека, так и на водные организмы (Фельд, 1985; Peilak-Walker et. al., 1985; Тульчинская, 1986; Luce et. al., 1988; Вредные химические вещества, 1998).
В этой связи, актуальным является выявление количественной зависимости между уровнями загрязнения среды некоторыми малоизученными производными бензола и диоксолана и биологическими эффектами на разных уровнях организации (молекулярном, клеточном, организменном, попу-<¦ ляционном) продуцентов, являющихся ключевым звеном экосистемы.
Цель исследований
Оценить токсичность и генетическую опасность п-ксилола, бензойной и пара-толуиловой кислот, а также 2-метил-1,3-диоксолана для водорослей (Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb.), макрофитов (Lemna minor Linne) и
высших наземных растений (Tradescantia viridis Linne, Allium сера Linne). 4
Задачи исследований
1. Изучить влияние производных бензола и 2-метил-1,3-диоксолана на:
а) водоросли Scenedesmus quadricauda по показателям выживаемости, продукции и деструкции, соотношению живых и мертвых клеток в культуре, скорости размножения и темпу прироста культуры;
б) ряску Lemna minor по показателям выживаемости 7 поколений, при-$ росту листецов, фотосинтезу, хромосомным аберрациям и гибели клеток
корней растения;
в) традесканцию Tradescantia viridis по показателям изменения роста листьев, стеблей и корней, частоте хромосомных аберраций и гибели клеток в корнях, выживаемости всего растения;
г) лук Allium сера по показателям роста листьев и корней, фотосинтетической активности, частоте хромосомных аберраций и гибели клеток корней.
Р 2. Сравнить водные и наземные растительные тест-объекты по чувстви-
тельности и устойчивости по отношению к исследуемым веществам.
3. Сравнить токсичность исследуемых веществ по отношению к растительным тест-объектам.
6
4. Определить токсикометрические параметры исследуемых веществ для водорослей, ряски, традесканции и лука как тест-объектов при установлении ПДК.
5. Определить возможные уровни воздействия исследуемых веществ, до которых растения могут адаптироваться.
6. Разработать метод определения стабильности веществ с помощью Scenedesmus quadricauda.
Научная новизна и теоретическое значение
1. Впервые установлено, что исследуемые вещества обладают мутагенным и токсическим действием на водоросли и высшие растения на всех уровнях организации: молекулярном, клеточном, тканевом, организменном, популяционном.
2. На 7 поколениях ряски показан характер кумулятивного токсикоза и определены пределы токсического воздействия исследуемых веществ, к которым могут адаптироваться растения.
3. Показана различная устойчивость и чувствительность водных и наземных растений к исследуемым веществам.
4. Разработан метод определения стабильности химических веществ с помощью Scenedesmus quadricauda, который более чувствительный, чем традиционный дафниевый.
Практическое значение работы
1. Установлены токсикометрические параметры и дозоэффективные зависимости воздействия представителей двух классов химических веществ (ароматические и гетероциклические) на представителей водных и наземных растений.
2. Значительная часть полученных материалов вошла в научные отчеты по установлению ПДК параксилола, бензойной кислоты, пара-толуиловой кислоты и 2-метил-1,3-диоксолана для рыбохозяйственных водоемов.
7
3. Разработанные и утвержденные нормативы внедрены на предприятии «Полиэф» г. Благовещенск (Башкортостан), который впервые начинает выпускать полиэфирные волокна на основе терефталевой кислоты.
4. Установлена эколого-генетическая опасность стоков предприятия для поверхностных водоемов.
5. Материалы работы вошли в лекционный курс и спецпрактикум по водной токсикологии, прикладной экологии и прикладной гидробиологии для студентов Тюменской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Исследуемые вещества обладают токсическим действием на все уровни организации растений: молекулярный, клеточный, тканевый, орга-низменный, популяционный.
2. Исследуемые вещества обладают мутагенным действием.
3. Растительные тест-объекты обладают различной устойчивостью и чувствительностью по отношению к данным веществам.
4. Особенностью действия исследуемых веществ является кумулятивный токсикоз, что показано на примере 7 поколений ряски малой. v
5. Растения обладают адаптивными возможностями по отношению к разным уровням воздействия исследуемых веществ.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые в решении проблем АПК» (Тюмень, 2003), на Международной конференции «Контроль и реабилитация окружающей среды» (Томск, 2004), на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы экологии и охраны окружающей среды» (Уфа, 2004), на Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Бо-рок, 2005).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ, 2 находятся в печати.
Структура и объем работы
Материал изложен на 179 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, 42 рисунка.
Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материала и методов исследования (глава 2), изложения полученных результатов (главы 3), обсуждения результатов (глава 4), выводов, списка используемых источников (230 отечественных и 45 иностранных источников) и 4 приложений.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Роль водорослей и макрофитов в гидроэкосистеме
Участие растений во внутриводоемных процессах сводится к двум ос- новным функциям: во-первых, синтез органического вещества и выделение в среду в процессе фотосинтеза кислорода и усиление окислительной минерализации, во-вторых, поглощение из среды большого количества минеральных элементов, используемых в конструктивном и энергетическом метаболизме (Ткаченко, 1988; Мироненко, Егоров, 2002).
Развитие гидрофитов тесно связано с содержанием соединений фосфора и азота в воде: снижение концентрации фосфатов с сотых до тысячных, нитратов - с десятых до сотых долей единиц в воде водоемов сопровождается существенным снижением численности водорослей (Лысенко, 1990).
Когда начинается массовое отмирание синезеленых водорослей и оседание их на дно наблюдается интенсивное размножение микроорганизмов, а вслед за ними - мелких инфузорий - бактериофагов и крупных хищников (Лиепа и др., 1984). Максимальные показатели общей численности бактерий соответствуют максимальному уровню концентрации минеральных форм азота и фосфора, напротив, быстрый рост численности водорослей влечет за собой значительное потребление биогенных веществ (Александрова и др., 1984). Так, интенсивное развитие диатомовых водорослей сопровождается резким уменьшением содержания минерального фосфора и азота (Клоченко и др., 2002). Диатомовые потребляют нитраты при любой их концентрации в окружающей среде. Зеленые водоросли чрезвычайно требовательны к содержанию в воде соединений азота, преимущественно нитратного (Трифонова, 1980; Александрова и др., 1984; Лиепа и др., 1984; Тимофеева, Сигарева, 2004).
Таким образом, в загрязненных водоемах за пиком численности бактерий следует увеличение биомассы фитопланктона, а после отмирания последнего - снова пик биомассы бактерий. Такие взаимоотношения бактерий
10
и фитопланктона характерны для водных объектов, независимо от состояния исходной воды (Телитченко, Федоров, 1961; Ленова, Шевченко, 1969; Александрова и др., 1984).
Водоросли являются важным звеном в пищевой цепи. Даже в довольно простых установках культура простейших Paramecium caudatum может многократно делиться, питаясь преимущественно хлореллой (Кокова, Лесовский, 1976).
Некоторые представители фитопланктона защищают себя от выедания зоопланктоном. Так, Coenocystis, Scenedesmus и Oscillatoria образовывают слизевой чехол, что затрудняет их выедание (Лысенко, 1990). Дафнии Daph-nia longispina не используют в пищу клетки синезеленых водорослей Apha-nizomenon flos-aquae (L) Ralfs, Microcystis aeruginosa Kutz em. Elenk., но при фильтрации дробят их крупные колонии антеннами и постабдоменом.
Повышение доли крупных водорослей в общей массе, прежде всего синезеленых и динофлагелят, учащение пиков биомассы и увеличение роли летнего максимума в сезонной динамике, повышение биомассы и продукции фитопланктона, можно считать основными признаками процесса эвтрофиро-вания (Трифонова, 1980). Очевидно, что в отличие от наземных растений и животных водные организмы осуществляют весьма значительный обмен с водной средой, получая из нее непосредственно многие минеральные вещества. Водоросли обладают высокой кумулятивной способностью, снижая степень загрязнения воды токсическими веществами. При наличии водорослей (эвглены, сценедесмуса) и дрожжей токсичность растворов резорцина, ман-нита, солей кадмия в острых опытах для дафний была меньшей, чем в их отсутствие (Стом, Гиль, 2000). Но в передаче радиоактивных веществ водоросли имеют ничтожное значение. Из 12 видов морских одноклеточных водорослей только два имеют высокие коэффициенты накопления стронция-90 (Поликарпов, 1964).
11
В формировании водных экосистем немаловажная роль принадлежит макрофитам (Козловская, 2000). Это наиболее устойчивое звено гидробиоценоза, особенно к кратковременным вспышкам загрязнения. В то же время они являются хорошим индикатором хронического загрязнения, поскольку концентрируют минимальные примеси токсических веществ из среды обитания, в связи с чем их используют для доочистки сточных вод (Фрейндлинг, 1975). К макрофитам относят высшие цветковые растения, произрастающие в воде и имеющие специфические особенности морфологии, связанные с обитанием в водной среде, а также крупные по размерам водоросли, такие например, как фукусы, ламинарии, хара, а также водные мхи, плауны, хвощи (Жданов, 1981; Алимов, 1989).
В мелководных озерах, где повышенная мутность воды или ее цветность неблагоприятным образом сказываются на жизнедеятельности фитопланктона, макрофиты могут вносить значительный вклад в суммарную первичную продукцию (Бульон, 1985). Разрастаясь, макрофиты образуют биологическое плато, освобождающее поверхностный сток от механических примесей, в том числе и хлопьев малорастворимых в воде токсических компонентов сточных вод, а также избытка биогенов, предотвращая эвтрофирова-ние водоемов (Якубовский, Мережко, 1982; Фрейндлинг, 1975; Иванова и др., 1985; Глухова, 1988; Распопов, 2001). Установлено, что прибрежная и водная растительность играют немаловажную роль в ликвидации нефтяной пленки (Петров, 1968). В присутствии растений разложение нефти протекает в 2-5 раз быстрее, чем без них. Например, при концентрации 10 г/л нефтяная пленка в присутствии растений исчезала на 50 % площади на 28-36 день, а без растений - на 56-62 день. При прохождении через заросли макрофитов концентрация нефти в толще воды снижается на 20 % и больше.
Макрофиты, как составная часть водных биогеоценозов, непосредственно связаны с другими водными организмами (Кубилюте, Станкявичус, 2001). В разных типах зарослей, в частности погруженной растительности, обитают в значительном количестве организмы зоопланктона и зооперифи-
12
тона, являющиеся кормом для рыб. Погруженные макрофиты заселяются разными группами беспозвоночных и служат им пищей (Лавровская, 1967; Корелякова, Распопов, 1986; Майер и др., 1981).
Ассоциативная связь между микроорганизмами и макрофитами наблюдается в случае разложения нефти, нефтепродуктов и других органических соединений. Макрофиты стимулируют жизнедеятельность нефтеокисляющих бактерий, что приводит к ускорению бактериальной трансформации загрязняющих веществ. Промежуточные продукты их распада потребляются высшими водными растениями как необходимое звено в питании и дыхании и идут на энергетический и конструктивный обмены. Обладая соокислитель-ным или индуцирующим эффектом, биокатализирующие соединения макро-фитов способствуют ускорению бактериального окисления и деградации нефтяных и других высокотоксичных органических загрязнений до конечных продуктов - СОг и Н2О (Морозов, 2003).
Кроме положительного влияния на другие организмы, есть данные об отрицательном воздействии водорослей и макрофитов на беспозвоночных и водную экосистему в целом. Сине-зеленые водоросли загрязняют воду токсическими веществами: сероводородом, аммиаком, фенолами, продуктами гниения белков - путресцином и кадаверином, токсическими полипептидами и другими продуктами процессов жизнедеятельности и распада (Елин, 2001).
Токсические метаболиты синезеленых водорослей разрушают тиамин. Механизм антимикробного действия токсического соединения, выделенного из природных популяций синезеленых водорослей Кременчугского водохранилища, показал, что большие концентрации токсина (ТАВ-22) оказывают ингибирующее действие на сапрофитную микрофлору (Кириенко, Сиренко 1975). Так же, как и водоросли, высшие водные растения продуцируют разнообразные фенольные соединения. Рдесты, телорез, роголистник, уруть и элодея подщелачивают воду вокруг ассимилирующих органов и насыщают воду кислородом. Это сочетание - щелочная среда и кислород - наиболее
13
благоприятно для окислительной деструкции разнообразных соединений фе-нольной природы от самых простых до самых сложных: гуминовых и фуль-вокислот, лигнина, дубильных веществ, меланинов и других (Бекасова, Ко-кин, 1961; Елин, 2001; Кубилюте, Станкявичус, 2001).
Таким образом, макрофиты являются энергетическим источником для многих организмов и принимают участие в формировании среды обитания, субстрата для размножения, роста, укрытия от неблагоприятных воздействий. Ассимилируя и аккумулируя минеральные элементы (азот, фосфор), а также накапливая вредные химические вещества, они обусловливают и качество самой воды (Догадина, 1970; Кубилюте, Станкявичус, 2001).
1.2. Водоросли и макрофиты как биотесты
Водоросли и макрофиты используются при нормировании веществ в водоеме и биотестировании разных сред. Угнетение альгофлоры может привести к нарушению биологического равновесия в водоеме, следствием чего может явиться снижение его биопродуктивности (Кузяхметов и др., 1986). Угнетение фотосинтеза, подавление процесса формирования первичной продукции прерывает поток энергии в водоеме, являющийся материальной основой биопродукционного процесса (Брагинский, Мигаль, 1973; Брагинский, 1986).
Фитопланктон по чувствительности к токсикантам мало отличается от других тест-организмов. Например, к хлорофосу он чувствителен почти так же, как ракообразные (Лесников, 1986).
Из организмов фитопланктона в практике отечественной водной токсикологии в качестве тест-организма чаще всего используется Scenedesmus quadricauda, реже — Chlorella vulgaris. Критерием токсичности для водорослей служит изменение численности клеток (Методические указания..., 1998), коэффициент прироста численности и темп размножения клеток. Кроме того используются другие методы - изменение уровня замедленной флуоресцен-
14
ции, которая отражает фотосинтетическую активность клеток (Вшивцев, 1984; Карякин, Грибовская, 1987; Айвазова и др., 1988; Васильев и др., 1988; Гольд и др., 2001; Колмаков, Гаевский, 2001; Горбанева, Гаевский, 2002; Щур и др., 2004).
У одноклеточной водоросли хлореллы (Chlorella vulgaris) хорошая проницаемость клеточной мембраны для большинства химических веществ (Васильев и др., 1988). Разница между максимальным и стационарным уровнем флуоресценции служит показателем фотосинтеза клеток водорослей (Ве-селовский и др., 1988).
Критерием негативного влияния загрязнения на водоросли может служить образование покоящихся спор диатомовой водоросли. Остановку движения подвижных зооспор протококковых водорослей также можно использовать в качестве критерия токсичности сточных вод (наименее устойчивы зооспоры Chlorococcum macrostigmatum, наиболее устойчивы Hypnomonas ellipsoidea (Стом и др, 1993).
В основе широко применяемых в настоящее время модификаций и схем определения первичной продукции лежат два метода - кислородный и радиоуглеродный. Скорость ассимиляции органических субстратов (ацетата и глюкозы) положительно коррелирует с концентрацией хлорофилла и скоростью фотосинтеза планктона, следовательно, зависит от уровня трофности водоемов (Бульон, 1985; Тимофеева, 2002) и степени его загрязнения.
На галофильной водоросли Dunaliella изучали изменение первоначальной формы клеток (эллипсоидная). При разбавлении раствора солей дистиллированной водой клетки мгновенно изменяют свою форму в шаровую, а через 12-15 мин водоросли вновь восстанавливают первоначальный вид. При воздействии больших концентраций токсиканта водоросли к первоначальному виду не возвращаются. Токсичной является концентрация, при действии которой время восстановления первичной формы статистически достоверно выше, чем в контроле (Балаян, Стом, 1988; Стом и др., 1993).
15
В опытах по регистрации подвижности наблюдали изменение скорости движения одноклеточных водорослей от одной минуты до 720 часов под действием тяжелых металлов (Сабуров, 1990).
Хорошо известен метод, основанный на регистрации биоэлектрической реакции протоплазматической мембраны клеток харовых водорослей (Nitella flexilis), широко распространенных в пресноводных прудах и водоемах. Харовые растут на глубине 1 - 5 метра, образуя заросли, встречаются в слабощелочных водах. Химическое воздействие приводит к изменению ионной проницаемости и электрических параметров клетки. В качестве тест-реакции используют биоэлектрическую реакцию клетки, измеряя два независимых параметра: разность электрических потенциалов между клеткой и наружной средой и электрическое сопротивление клеточной мембраны (Юрин, 1988).
Изучая видовой состав, обилие, структуру и уровень организации сообществ макрофитов, а также возможные отклонения в развитии и росте, можно использовать их в качестве биоиндикаторов (Козловская, 2000). Макрофиты являются более чувствительными к действию загрязняющих веществ, чем считалось ранее (Лесников, 1986). При воздействии токсических соединений на макрофиты наблюдают изменение окраски, падение тургора, оседание на дно (Стом и др, 1993). В качестве тест-объектов в лабораториях широко используются элодея и ряска (Лесников, 1986).
Токсические вещества изменяют вязкость протоплазмы, влияя на характер перехода ее из геля в золь и обратно. Разжижение протоплазмы, в связи со снижением ее вязкости, способствует увеличению скорости ее движения. Наоборот, повышение вязкости вследствие денатурации и коагуляции белков протоплазмы снижает ее подвижность вплоть до полной остановки. Чем больше отличается этот показатель от контроля, тем более глубокие изменения происходят в метаболизме клетки (Воробьева, 1973; Строганов, 1975; Сиренко, Смирнова, 1993).
16
При изучении действия смесей фенолов на рост и движение цитоплазмы элодеи канадской, впервые наблюдалось окрашивание раствора смеси пирокатехина и резорцина. Первоначально прозрачный раствор этой смеси при контакте с растениями становится бледно-зеленым, затем постепенно зеленым, через длительное время появляется коричневый оттенок (Стом и др, 1993).
Одним из современных методов биологической индикации является цитогенетический мониторинг, в качестве критериев которого используются, прежде всего, частота и спектр хромосомных аберраций и патологий митоза (Засухина, 1979; Инге-Вечтомов,1989; Ильинских и др., 1992; Пак, Войни-ленко, 1995; Муратова и др., 2004).
Все процессы, происходящие в клетке, находятся под генетическим контролем. Не составляют исключения клеточный цикл и митоз. Гены контролируют последовательные стадии репликации ДНК, цитокинез, движение, спирализацию-деспирализацию хромосом и т.д. Мутации этих генов могут прерывать клеточный цикл на различных этапах. Поэтому для исследования клеточного цикла и митоза можно применить генетический анализ (Инге-Вечтомов, 1989).
Нарушения хромосом в ана-, телофазе представляют особый интерес. Анафаза начинается в момент деления центромер, удерживавших до этого вместе обе хроматиды каждой хромосомы. Все центромеры при этом делятся одновременно. Дочерние хромосомы разъединяются и расходятся к противоположным полюсам по нитям веретена, фиксированным у полюсов митоза. Телофаза - заключительная стадия митоза — начинается завершением движения хромосом к полюсам. Хромосомы, которые теперь состоят из одной нити каждая, становятся тоньше и длиннее и становятся невидимыми. В это же время происходит цитокинез - разделение цитоплазмы. У растений деление клетки завершается формированием фрагмопласта — новой клеточной стенки между дочерними ядрами (Инге-Вечтомов,1989; Карманова, Болгов, 2004).
17
1.3. Механизмы реагирования продуцентов на действие химических веществ
В настоящее время поток токсических веществ антропогенного происхождения настолько велик, что определить их химико-аналитическим путем невозможно. В биосфере содержится более миллиона различных антропогенных веществ, образующих с природными еще большее количество новых соединений, токсичность которых остается неизученной (Гусева и др., 1991).
Водные организмы вынуждены реагировать и приспосабливаться к изменяющейся среде обитания. Под механизмом реагирования понимается последовательный ряд физиолого-биохимических реакций организма, приводящих к нормализации вызванных нарушений или к их углублению, а затем и полному расстройству жизненных функций со смертельным исходом или к образованию различных уродств. Реакция организма на воздействие токсиканта имеет свои особенности, которые проявляются в разной чувствительности и устойчивости к токсическому воздействию. Часто по реагированию организма на воздействие высоких концентраций токсиканта судят о механизме его действия. По действию на организм малой концентрации токсиканта не улавливается механизм действия, но хорошо прослеживается реагирование особей в ряду поколений (Строганов, 1975).
С развитием индустрии, водного транспорта, увеличением добычи нефти и развитием сети трубопроводов значительную долю в загрязнении поверхностных вод составляют нефтяные углеводороды. Фитотоксичность углеводородов возрастает в следующем порядке: неразветвленные парафины, олефины, циклопарафины, ароматические углеводороды (Minshall, Helson, 1979). Последние являются одними из наиболее опасных компонентов, поступающих в воду не только со стоками предприятий или при авариях, но и в процессе жизнедеятельности самих гидробионтов (Benville, 1977; Вшивцев, 1984; Пфейфере, Платпира, 1986; Ирха, Кирсо, 1992; Duxbury et. al., 1994).
Ароматические углеводороды - это бензол и его производные. Они представляют собой циклические соединения, содержащие одно или более

Получить работу