7 Введение
Актуальность работы. Исследование функционирования ферментов представляет как самостоятельный научный интерес в связи с их значением для организации и регуляции клеточного метаболизма, так и служит ключом к прояснению путей оптимизации биотехнологических процессов, поскольку ферментативные реакции часто играют ключевую роль в определении их эффективности, оказывая как положительное, так и отрицательное воздействие. Особый интерес представляют ферменты растений, нашедшие применение в различных отраслях промышленности. В этой связи исследование структуры, специфичности действия, а также физико-химических свойств и регуляции активности ферментов имеет как теоретическое, так и практическое значение.
Среди гидролитических ферментов, участвующих в метаболизме липи-дов, важное место занимает липаза (триацилглицерол эфиргидролаза, К.Ф. 3.1.1.3), которая расщепляет сложноэфирные связи глицерина и жирных кислот в молекулах триацилглицеролов (ТАГ). Исследованию и использованию липаз посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов (Arpigny J.L. et al., 1999; Pandey A. et al., 1999; Неклюдов А.Д. и др.. 2002). Имеются некоторые данные о негативном действии липаз в процессах хранения и переработки семян масличных растений: подсолнечника, рапса, хлопчатника (Корчагина Л.Н. и др., 1979; Ананьева О.Н. и др., 1978; Beisson F. et al., 2000). Однако исследования в этом плане немногочисленны, что связано с методическими трудностями, возникающими при выделении и изучении растительных ферментов по сравнению с ферментами из других источников. Среди особенностей тканей растений, обуславливающих экспериментальные затруднения, следует отметить: освобождение и выход из клеточных компартментов при гомогенизации материала вакуолярного сока с низким значением рН, а также таннинов, полифенолоксидаз, протеаз, снижающих активность ферментов (Гильманов М.К., 1981).
s
В настоящее время, как источник новых натуральных компонентов, применяемых в отечественной и зарубежной пищевой, медицинской и комбикормовой промышленности, особое внимание привлекает пшеничный зародыш - побочный продукт мукомольного производства, являющийся биологически ценным продуктом, содержащим витамины, белки с незаменимыми аминокислотами, липиды. Однако широкое использование пшеничного зародыша ограничено ввиду нестойкости его при хранении.
Одной из причин порчи зародышей пшеницы является сопряженное действие гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов: липаза гидролизует триглицериды ненасыщенных жирных кислот, а липоксигеназа, при непосредственном участии кислорода воздуха, осуществляет их окисление. Образующиеся при этом перекиси, гидроперекиси и другие более глубокие продукты распада резко снижают качество зародышей пшеницы. Образующиеся при этом пероксиды, гидропероксиды и другие продукты распада резко снижают качество зародышей пшеницы. Если изучению действия липоксигеназы уделялось значительное внимание (Зяблова Т.В., 2000; Prakash R.B. et al., 1993) , то исследованию липазы зародышей пшеницы посвящены лишь некоторые работы (Stauffer СЕ. et al., 1966; Sauhders CM. et al., 1998).
В этой связи вызывает значительный интерес выделение и исследование каталитических и регуляторных свойств липазы. Это имеет существенное значение для понимания путей сопряжения и регуляции липидного обмена в клетке, а также решения задач по лимитированию активности липазы и разработке рациональных методов стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении.
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение липазы зародышей семян пшеницы в гомогенном состоянии, исследование её физико-химических характеристик, регуляции активности, а также разработка и обоснование рациональных режимов хранения и использования пшеничных зародышей в пищевой промышленности с учётом каталитических свойств фермента.
9
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
• разработка эффективного метода выделения и очистки липазы зародышей пшеницы;
• характеристика кинетических параметров каталитического действия и некоторых физико-химических свойств липазы зародышей пшеницы;
• изучение влияния рН среды и температуры на активность и стабильность липазы. Определение основных термодинамических параметров;
• исследование регуляции активности липазы под действием ингибиторов и активаторов;
• исследование субстратной специфичности фермента по отношению к синтетическим и природным субстратам;
• идентификация функциональных групп активного центра фермента, исследование механизма действия липазы зародышей пшеницы;
• разработка рациональных методов стабилизации зародышей пшеницы при хранении, с учётом каталитических свойств липазы, апробация их в лабораторных и производственных условиях; изыскание путей и способов использования зародышей пшеницы в пищевой промышленности.
Научная новизна. Разработана схема очистки и получен гомогенный ферментный препарат липазы зародышей пшеницы. Изучено влияние различных факторов на активность фермента: действие ингибиторов и активаторов, рН и температуры. Исследованы кинетическое поведение и регуляция активности фермента липазы зародышей пшеницы, в том числе, субстратная специфичность по отношению к природным и синтетическим субстратам. Впервые получена информация о кинетике процесса термолиза зародышей пшеницы, определены формы связи влаги в них. С учётом каталитических свойств фермента разработаны способы стабилизации биохимического состава зародышей пшеницы при хранении, основанные на применении обладающей антиокислительной способностью аскорбиновой кислоты,
10
а также тепловой обработки с использованием осциллирующих режимов. Доказана эффективность предложенных способов стабилизации в промышленных условиях. Показана целесообразность использования стабилизированных зародышей пшеницы в пищевой промышленности.
Практическая значимость работы. Предложенная схема очистки ферментного препарата дает возможность широко использовать его в научно-исследовательских работах, связанных с моделированием ферментных систем, в том числе и сопряженных, in vitro. Полученные в работе данные способствуют созданию более глубоких представлений о механизмах ферментативной регуляции липидного обмена, что расширяет возможности поиска оптимальных путей интенсификации технологии растениеводства в сельском хозяйстве.
Разработанные способы стабилизации и предложенные режимы хранения зародышей пшеницы апробированы в производственных условиях на экспериментальной базе ООО «Воронежмельсервис» г. Воронежа, ОАО «Бутурлинов-ский мелькомбинат» г. Бутурлиновка. На способы стабилизации зародышей пшеницы получены приоритеты на изобретения №2002133774/13 (приоритет от 15.12.02) и №2003101790/13 (приоритет от 7.02.2003)
Стабилизированный пшеничный зародышевый продукт апробирован в качестве обогатителя при производстве мучных кондитерских изделий на ОАО "Заинский хлебозавод" г. Заинек. За разработку «Способ производства пищевых добавок на основе пшеничных зародышевых хлопьев» получен диплом выставки «Современное хлебопечение. Сладкоежка».
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 6-ой и 7-ой Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002-2003 гг.), международной конференции молодых учёных «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии" (Тверь, 2002 г.), международной научно-практической конференции "Актуальные
11
направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции (Воронеж, 2002 г.), ежегодных научных сессиях Воронежской государственной технологической академии (2001-2003 гг.).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 15 публикациях - 6 статьях и 9 тезисах докладов конференций.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Впервые разработан способ очистки липазы зародышей пшеницы до гомогенного состояния, включающий следующие стадии очистки: экстракция, кислотное осаждение, гель-фильтрация на сефадексе G-25, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-хроматография на сефадексе G-150.
2. Исследования, проведенное на высокоочищенных препаратах липазы из зародышей пшеницы показали, что в регуляции активности фермента могут принимать участие ионы Са2+, соли желчных кислот (в концентрации до 20 мМ), стимулирующие ферментативную активность, а также продукты реакции - жирные кислоты, диглицериды, а также холат и дезоксихолат натрия (в концентрациях выше 20 мМ), ионы К+, Mn2+, Cu2+, подавляющие активность липазы.
3. На основе идентификации функциональных групп активного центра липазы зародышей семян пшеницы: имидазольной группы гистидина, гидроксильной группы серина, карбоксильной группы глютаминовой или аспарагиновой кислот, предложена гипотетическая модель механизма действия фермента, согласно которой акт катализа обеспечивается "системой с переносом заряда".
Исследования кинетических и термодинамических параметров термической и кислотной инактивации фермента показало относительно низкую термо- и кислотную стабильность липазы. С учётом свойств липазы разработаны рациональные режимы хранения зародышей семян пшеницы,
12
позволяющие сохранить качество продукта и расширить возможности его использования в промышленности.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 202 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, списка литературы (292 источника) и приложения. Иллюстрационный материал включает 47 рисунков и 31 таблицу; в приложении - 9 рисунков и 7 таблиц.
13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Распространение и функции липазы в живых организмах
1.1.1 Катализируемая реакция
Согласно классификации ферментов принятой Международным биохимическим обществом липаза (триацилглицерол эфиргидролаза, ЕС 3.1.1.3), относящаяся к классу эстераз, катализирует расщепление сложноэфирных связей глицерина и жирных кислот по следующей схеме:
О
О CH2O-C-R! Н2О о СН2ОН Н2О
II I z ' II I z ^
R2-C-O-CH -------> R2-C-O-CH ^
CH2O-C-R3 Rl-COOH CH2O-C-R3 R
О О
сн2он н2о 9
но-сн -----*- но-сн
CH2-O-C-R3 R3-COOH СН2ОН
о
Ri, R2, R3 - углеводородные радикалы высокомолекулярных ненасыщенных и насыщенных жирных кислот.
Однако отдельные авторы считают такую классификацию необоснованной, т.к. некоторые препараты липаз, особенно микробного происхождения, способны гидролизовать как нерастворимые, так и растворимые в воде субстраты (Брокерхофф X., Дженсен Р., 1978; Грачева И.М., 2000).
Основной особенностью реакции катализируемой липазой является её протекание в гетерогенных системах, поскольку фермент растворим в воде, а субстрат нет. В физиологических условиях в организме человека, липаза расщепляет эмульсии жиров, стабилизированных поверхностно-активными веществами (Диксон Э., Уэбб М., 1982).
14 1.1.2 Распространение и роль в метаболизме клетки
Липаза является достаточно распространённым ферментом, играющим исключительно важную роль в обмене липидов в живых организмах (Anthonsen H.W., 1995). Ранее всех была открыта и на сегодняшний день достаточно глубоко изучена панкреатическая липаза, чему посвящен ряд обзоров (Miyake К., 2001; Lowe M.E., 1999; Layer P. 1999). В настоящее время фермент обнаружен у многих видов бактерий, грибов, достаточно большое количество работ посвящено изучению данного фермента в тканях и органах животных и человека, однако липаза из каждого источника имеет свою индивидуальную характеристику.
Продуценты липаз микробного происхождения нашли в настоящее время широкое применение. Насчитывается более 200 штаммов, причём основная часть представлена бактериальными и грибными штаммами. Были получены ферментные препараты с различной степенью очистки и активностью. Так имеющиеся в литературе данные показывают, что наиболее активные продуценты липазы встречаются среди грибов следующих родов: Aspergillus (Chang С. S. 1997; Carrea G. et al., 1996; Ionita A. et al., 1997; Gu-lati R. et al., 2000), Mucor (Goto, M. et al., 1996; Ngooi, Т. К. et al., 1990; Cavaille L. D., 1997), Penicillium (Ortiz-Vazquez E. et al., 1993; Krieger N. et al., 1996; Ibrik A. et al., 1998; McGee H., 1986; Kamezawa M et al., 1996; Mit-suda S. et al., 1992), Rhizopus (Wu X. Y. et al., 1996; Basri M. Et al., 1996; Ta-kahashi S. et al., 2001; Christen P. et al., 1995; Patel M. T. et al., 1996) и др. Способностью к синтезу липаз обладают и дрожжи родов Candida (Ngooi T. К. et al., 1990; Chang С. S., Tsai S. W., 1997; Nakano H. et al., 1996), Han-senula (Ionita A. et al., 1997), Humicola (Buisman G. J. H., 1998), Serratia (Duzhak A.B. et al., 2000; Duong F. et al., 1994), Yarrowia (DeFelice B. et al., 1997), Saccharomyces (Tanisake, 1993), хотя и в меньшей степени. Целый ряд работ посвящен продуцентам липаз бактериального происхождения, в основном родов Acinetobacter (Wakelin N. G., Forster C. F., 1997; Pratuangde-jkul J, Dharmsthiti S., 2000; Hostacka A., 2000), Cryptococcus (Kamini N.R et
15
al., 2000), Mycobacterium (Chen, S. C. et al., 1997), Pseudomonas (Goto M. et al., 1996; Mitsuda S. et al., 1992; Gaoa X. et al., 2000), Bacillus (Nawani N., Kaur J., 2000; Sinchaikul S. et al., 2001; Kauffmann I. 2001), Streptomyces (Sommer P. et al., 1997; Valdez F. et al., 1999; Yoshinari K. et al., 1994), Staphylococus (Gotz F., 1998).
Некоторые липазы микробного происхождения достаточно хорошо изучены (Morin M. et al., 1995; Nawani N. et al., 2000), расшифрована их первичная структура и механизм каталитического действия при расщеплении триглицеридов (Stadler P. et al., 1995). Основное направление их использования - биотехнологические процессы, в частности, для биоконверсии липидов (Неклюдов А.Д. и др., 2002).
Липазы широко распространены в семенах и вегетативных органах растений, однако эта группа организмов остаётся сравнительно малоизученной. Большинство исследований растительных липаз относится к липазам семян. Многие семена богаты триглицеридами, которые служат концентрированным источником энергии для появляющихся проростков.
Данные о каталитических свойствах фермента из высших растений ограничены (Huang A.H., 1984). Имеется ряд работ, посвященных изучению свойств фермента из растений, являющихся источником получения растительных жиров: подсолнечника Helanyhus annum (Ананьева О.А., Рудюк В.Ф., 1978; Bahri S., 2000), рапса Brassica napus L. (Belguith H. et al., 2000; Ben Miled D.D. et al., 2000), сои Soja hispida L. (Lin et al., 1984; Гавриченков Ю.Д. и др., 1969), хлопчатника Gossypium herbaceum L. (Мадьяров Ш.Р. и др., 1975; Priolo N.S., 1995; Рахимов М.М. и др., 1970), пальмы Elaeis guineensis (Abigor et al., 1985; Oo, Stumpf., 1983). В меньшей степени исследована липаза из зерновых культур. Имеются данные о ферменте из ячменя Hordeum vulgare L. (Firn, Kende, 1974), кукурузы Zea mays L. (Lin et al., 1983; Lin, Huang, 1984), риса Oryza sativa L. (Funatsu M. Et al., 1971; Shastry B.S. et al., 1971), овса Avena sativa L. (Martin H.F., Peers F.G., 1953), пшеницы Triticum aestivum L. (Saunders СМ., 1998; Shtauffer C.E, Glass R.L., 1966). Как отмечают многие авторы, роль липазы при
16
хранении зерновых продуктов достаточно велика (Stauffer C.E., 1966; Galliard, 1983; Saunders С. М. et al., 1998; Kubicka E. et al., 2000). Отдельные работы посвящены изучению липазы в клубнях картофеля Solanum tuberosum L, в бобах нута Cicer arietinum L, фундука Corylus avellana (Bonvehi J.S., Rosua N.S., 1996), арахиса Arachis hypogeae (Sanders et al., 1975), кунжута (Jayanthi B.N. et al., 1972), жожобы (Moreau et al., 1988), Vernonia anthelmintica (Olney C.E. et al., 1968), Cucumeriopsis edulis (Opute, 1975), Carica papaya (Gandhi N.N. et al., 2000), а также плодах яблока (Somolenska et al., 1974). Достаточно хорошо исследована липаза клещевины Ricinus communis (Ory et al., 1967; Lin et al., 1986; Moreau et al., 1988), чернушки Nigella damascena L. (Корчагина Л.Н. и др., 1975), Arabidopsis thailana (Beisson F. et al., 2000).
Физиологическая роль липазы в клетке заключается в её участии в метаболизме липидов (Sadurska В. et al., 2001). Липаза катализирует начальный этап в катаболизме триацилглицеролов - гидролитическое расщепление эфирных связей глицерина и жирных кислот. Наиболее интенсивно процессы метаболизма липидов протекают в семенах масличных растений, а также в жировой ткани человека и животных.
1.1.2.1 Активность липазы в пшеничных зародышах. Химический состав и биологическая ценность зародыша семян пшеницы
Исследованию липолитических ферментов из зерновых культур было посвящено достаточное количество работ, анализ которых показывает противоречивость полученных данных (Stauffer C.E., 1966; Galliard, 1983; Kubicka E. et al., 2000). Интерес к липазам из зерновых культур вызван, прежде всего, определяющей ролью липаз в процессе хранения. Особенно важна роль липазы при хранении муки и крупы, содержащих большое количество жира. Особенно неустойчивы при хранении, по сравнению с неповрежденным зерном, мука и продукты переработки зерна: отруби, зародыши. Так, по данным английских исследователей, за 1990 год было нерационально использовано около 5 % всей
!7
выработанной муки, вследствие её прогоркания (действие гидролитических и окислительно-восстоновительных ферментов и процессов автоокисления (Saunders С. М. et al., 1998).
В некоторых работах показано, что липолитическая активность зёрен хлебных злаков слабо проявляется в крахмалистом зерне, а локализуется в основном в эмбриональных фракциях и на периферийных участках зерна (Тор-жинская Л. Р. 1959; Chichester CO., 1977; Братерский Ф.Д., 1994). Что касается пшеницы, большинство исследователей приписывают активность зародышу (Ferrigan М., 1958; Irvine G.N. et al., 1955; Stauffer C.E., 1966), другие отрубям (Шварцман М.И., 1972).
Строение зерновки пшеницы типично для всех злаковых и характеризуется наличием трёх составных частей: зародыша, эндосперма и оболочек, которые имеют различное биологическое значение (рис. 1.1). Нижняя часть зародыша является его зародышевым корешком, верхняя часть - зародышевой почечкой. Часть зародыша, прилегающая к эндосперму - щиток служит для передачи питательных веществ из эндосперма в зародыш при прорастании. По данным разных авторов соотношение частей зерна пшеницы составляет (в %): эндосперм - 78,7 - 84,3, зародыш - 1,4 - 4,2, плодовые и семенные оболочки - 5,6 - 11,2, алейроновый слой 5,2 - 8,8. В пищевом отношении наиболее ценной частью зерна является эндосперм (Казаков Е.Д., Кретович В.Л., 1989; Степанов С.А., 1993). Оболочки, состоящие из неиспользуемых организмом человека од-ревесневевших клеток, при переработке в муку стараются удалить, как и алейроновый слой.
Присутствие в муке зародыша тоже нежелательно (хотя он и богат питательными веществами), так как зародыш с трудом поддаётся измельчению, а при хранении ускоряет порчу муки,
Рис. 1.1. Продольный разрез зерновки пшеницы: 1 - плодовая оболочка, 2 - семенная оболочка, 3 - алейроновый слой, 4 -эндосперм, 5 — щиток, 6 — зародыш, 7 - бородка.

Получить работу