ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И
ТЕРМИНОВ
GSH — восстановленный глутатион
GSSG — окисленный глутатион
Тгх — тиоредоксин
Grx — глутаредоксин
НАДН — восстановленный никотинамидаденин-динуклеотид
НАД — окисленный никотинамидаденин-динуклеотид
НАДФН — восстановленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат
НАДФ — окисленный никотинамидаденин-динуклеотидфосфат
АТФ — аденозин-5 '-трифосфат
GGT — у-глутамилтранспептидаза
GOR — глутатионредуктаза
GST — глутатион-8-трансфераза
SOD — супероксиддисмутаза
СССР — карбонилцианид-т-хлорфенилгидразон
FCCP —р-трифлуорометоксикарбонилцианидфенилгидразон
DNP — 2,4-/?-динитрофенол
ТРР+ — тетрафенилфосфоний
DCCD — Л^Чдициклогексилкарбодиимид
NEM — N-этилмалеимид
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
— электрохимический градиент протонов
— разность электрических потенциалов АрН — разность концентраций ионов водорода АФК — активные формы кислорода
MRP — белки, придающие устойчивость к многим химическим
соединениям
рО2 — парциальное давление кислорода
7 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Изучение роли и функций глутатиона (GSH) в клетках эукариотических организмов давно привлекает внимание исследователей. Хорошо известна его роль как главного редокс-буфера и антиоксиданта, имеющего большое значение в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в белках и в защите клеток от окислительного стресса и действия токсических соединений (Meister and Anderson, 1983; Arner and Holmgren, 2000; Ritz and Beckwith, 2001; Schafer and Buettner, 2001). В последние годы новая волна исследований связана с выяснением роли глутатиона в генной экспрессии, клеточной сигнализации, в регуляции апоптоза и других клеточных процессов, в контроле активности ферментов путем образования смешанных дисульфидов с глутатионом (Voehringer, 1999; Klatt and Lamas, 2000; Filomeni et al., 2002; Paolicchi et al., 2002). Появились данные, указывающие на то, что регуляция всех важнейших биологических процессов, вплоть до решения проблемы жизни и смерти клетки, связана с изменениями редокс-состояния существенных тиоловых групп в белках при участии GSH и другого важнейшего редокс-активного соединения, тиоредоксина. Интенсивно изучаются медицинские и клинические аспекты функций глутатиона, включая канцерогенез и лекарственную устойчивость, нервно-дегенеративные и глазные болезни, болезни сердца, ВИЧ, состояние иммунной системы и старение организма.
Резкий контраст с этим исследовательским бумом представляет состояние изучения роли и функций глутатиона у прокариотических клеток. Такое положение связано с несколькими причинами. Во-первых, GSH содержат далеко не все прокариоты, он встречается преимущественно у грамотрицательных и лишь у некоторых видов грамположительных бактерий (Fahey et al., 1978; Newton et al., 1996). Во-вторых, мутантные бактерии, полностью лишенные глутатиона, сохраняют способность к нормальному росту на богатой и бедной средах (Apontoweil and Berends, 1975b; Fuchs and
8
Warner, 1975; Murata et al., 1981). И, наконец, в-третьих, мутанты, не способные синтезировать глутатион, не проявляют повышенной чувствительности к действию оксидантов и генераторов супероксида (Greenberg and Demple, 1986; Romera and Canada, 1991). Таким образом, складывалось впечатление, что, в отличие от эукариот, GSH не играет существенной роли в бактериальных клетках. Однако дальнейшие исследования показали, что в стационарной фазе и при росте бактерий Е. coli на минимальной среде, отсутствие глутатиона в мутантных клетках приводит к значительному повышению их чувствительности к действию Н2О2 и менадиона (Chesney et al., 1996; Vlamis-Gardikas et al., 2002). Глутатион также защищал клетки Е. coli от повреждающего воздействия радиации в присутствии кислорода (Наггор et al., 1991). Лишенные глутатиона мутанты имели более низкое значение внутриклеточного рН и были более чувствительны к резким изменениям рН и осмолярности среды (McLaggan et al., 1990; Riccillo et al., 2000). Кроме того, накапливается все больше данных о том, что все важнейшие метаболические системы клеток образуют сети, в которых отсутствие отдельных компонентов может в той или иной мере компенсироваться повышенной активностью других. Так, функции редокс-системы глутатиона дублируются редокс-системой тиоредоксина (Ritz and Beckwith, 2001; Vlamis-Gardikas et al., 2002), а мутации по компонентам обеих этих систем активируют антиоксидантные ферменты (Prieto-Alamo et al., 2000). Поэтому слабый эффект отдельной мутации на рост и выживаемость в лабораторных условиях не всегда адекватно отражает функциональную значимость данного гена.
Показано также, что система глутаредоксин 1/GSH играет регуляторную роль в активации OxyR, транскрипционного регулятора генов, откликающихся на пероксидный стресс (Zheng and Storz, 2000; Pomposiello and Demple, 2001b). Многие виды бактерий, не имеющих GSH, синтезируют другие низкомолекулярные тиолы, по-видимому, заменяющие глутатион в функциональном отношении (Sundquist and Fahey, 1989; Newton et al., 1996).
9
А ряд бактерий, в том числе патогенных, не содержащих глутатиона, способны поглощать GSH из среды, используя его как антиоксидант и источник органической серы (Sherrill and Fahey, 1998; Vergauwen et al., 2003). Совокупность этих данных свидетельствует о том, что GSH может играть важную роль не только в эукариотических, но и в прокариотических клетках, и изучение функций глутатиона у бактерий является актуальной проблемой.
В ранних работах нашей исследовательской группы было показано, что различные стрессовые воздействия на бактерии, растущие в аэробных т условиях, вызывают быстрые сдвиги редокс-потенциала среды (скачки Eh),
которые связаны с изменением количества низкомолекулярных тиолов в среде и внутри клеток (Октябрьский и др., 1981; 1984а,б; Октябрьский, Смирнова, 1986а,б; 1988; Октябрьский, Пшеничнов, 1982; Oktyabrsky, Smirnova, 1989; Смирнова, Октябрьский, 1990). Наблюдалась корреляция между изменениями уровней низкомолекулярных тиолов, калия и внутриклеточного рН, что позволило высказать гипотезу о взаимосвязи этих .ч параметров и их влиянии на редокс-чувствительные элементы клеточного
метаболизма (Oktyabrsky, Smirnova, 1993a,b; Oktyabrsky et al., 1993; Smirnova, Oktyabrsky, 1994; 1995). Поскольку в клетках Е. coli основным низкомолекулярным тиолом является GSH, представлялось важным изучить изменения статуса внутриклеточного и наружного глутатиона и их роль при различных стрессовых воздействиях. В аэробных условиях многие стрессы в клетках эукариот и прокариот сопровождаются усилением продукции активных форм кислорода (АФК), что диктовало необходимость изучения антиоксидантных функций GSH в комплексе с другими антиоксидантными системами клетки.
Цели и задачи исследований. Основной целью данной работы было изучение статуса и роли глутатиона и его взаимодействия с другими •ф антиоксидантными системами клетки при ответе бактерий Е. coli на
различные стрессовые воздействия.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
10
1. Изучить изменения концентраций восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона, а также соотношения GSH/GSSG внутри и снаружи клеток в процессе аэробного роста периодических культур Е. coli.
2. Исследовать зависимость уровней и редокс-статуса глутатиона от наличия мутаций в генах, продукты которых являются компонентами клеточных редокс-систем или участвуют в детоксикации активных форм кислорода.
3. Изучить изменения уровней наружного и внутриклеточного глутатиона и соотношения GSH/GSSG при окислительном стрессе, связанном с добавлением перекиси водорода или генератора супероксида менадиона, при исчерпании глюкозы, при температурных стрессах, при гиперосмотическом шоке и при быстром снижении рН среды и цитоплазмы.
4. Используя слияния промоторов антиоксидантных генов с геном р-галактозидазы, изучить изменения экспрессии антиоксидантных генов в указанных выше ситуациях и установить их связь со статусом глутатиона.
5. Исследовать процесс выхода GSH из клеток Е. coli и его связь с клеточным метаболизмом и изменениями компонентов электрохимического градиента протонов.
6. Изучить взаимосвязь уровня и редокс-статуса наружного и внутриклеточного глутатиона с трансмембранными потоками К+.
Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование изменений уровней и редокс-статуса глутатиона в аэробно растущих культурах Е. coli при различных стрессах. Обнаружено, что окислительный стресс, связанный с воздействием низких и средних доз Н2О2, не вызывает повышения концентрации внутриклеточного GSSG и сопровождается увеличением соотношения GSH/GSSGjn. Генератор супероксида менадион, напротив, приводит к возрастанию уровня GSSG, снижению GSH и значительному падению редокс-статуса глутатиона внутри и снаружи клеток. Одновременное присутствие в среде цистина и Н2О2
11
многократно усиливает гибель бактерий, препятствует разложению Н2Ог клетками Е. coli, вызывает значительное повышение наружного GSSG и ингибирует индукцию каталазы HPI и SOS-системы репарации ДНК. Впервые показано, что транспорту цистина в клетки предшествует его внеклеточное восстановление с участием наружного GSH. Бактерии, дефектные по синтезу и восстановлению глутатиона (gshA и gor), медленнее восстанавливают цистин во внеклеточной среде и более устойчивы к действию цистина и Н2О2.
Установлено, что при всех изученных стрессах, не связанных с добавлением экзогенных оксидантов, наблюдаются реакции, характерные для окислительного стресса, и, наряду с изменениями статуса глутатиона, происходит индукция антиоксидантных генов. Впервые показано, что переход культуры Е. coli в стационарную фазу при исчерпании глюкозы сопровождается возрастанием уровня GSSG внутри и снаружи клеток и 10-кратным снижением соотношения GSH/GSSGjn при длительном голодании, что может рассматриваться как прямое доказательство окислительного стресса в стационарной фазе. Обнаружено, что гиперосмотический шок сопровождается повышением экспрессии генов soxS и sod А, кодирующих транскрипционный регулятор SoxRS регулона, отвечающего на супероксидный стресс, и Mn-зависимую супероксиддисмутазу, соответственно. Двойные мутанты sodAsodB по обеим цитоплазматическим супероксиддисмутазам проявляют повышенную чувствительность к гиперосмотическому шоку. Обнаружено, что температурные стрессы в аэробно растущих культурах Е. coli вызывают выход части GSH из клеток в среду. Установлено, что клетки, длительное время растущие при пониженной температуре 20°С, имеют низкий уровень GSHin и повышенную экспрессию генов katG, katE и soxS. У бактерий, адаптированных к температуре 42°С, возрастает скорость продукции супероксида, повышается уровень внутриклеточного GSH и увеличивается экспрессия генов soxS и gor. Показано, что резкое снижение рН среды или закисление цитоплазмы при
12
добавлении ацетата натрия сопровождаются снижением уровня внутриклеточного GSH.
Обнаружено существование взаимосвязи между статусом глутатиона и уровнем экспрессии антиоксидантных генов. Впервые установлено, что мутации в генах, продукты которых являются компонентами клеточных редокс-систем или участвуют в деструкции АФК, вызывают значительные изменения уровня и редокс-статуса глутатиона внутри и снаружи клеток. Показано, что снижение концентрации и редокс-статуса внутриклеточного глутатиона у Е. coli вызывает возрастание каталазной активности в результате активации транскрипции генов katG и katE. Установлено, что одной из причин повышенной экспрессии katG в мутантах Е. со И (gshA) может быть более высокая, чем у родительских клеток, внутриклеточная концентрация НгО2, которая достаточна для активации транскрипционного фактора OxyR, контролирующего экспрессию katG.
Впервые показано, что выход GSH из клеток Е. coli является редокс-чувствительным процессом, происходит с использованием энергии Д|Ш+, прекращается при ингибировании дыхания и ускоряется при дефиците АТФ. Обнаружена корреляция между физиологическими изменениями статуса глутатиона при стрессах и концентрацией калия в клетках.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные позволяют создать целостную картину, отражающую взаимосвязанные изменения редокс-статуса глутатиона и других антиоксидантных систем в бактериальных клетках при различных стрессовых воздействиях, что значительно расширяет представления о роли и функциях глутатиона у прокариот. Обнаружено существование связи между концентрацией GSHln и редокс-статусом глутатиона, с одной стороны, и экспрессией генов, находящихся под контролем глобальных ,ц, транскрипционных регуляторов OxyR и RpoS, с другой стороны. Способность GSH или его редокс-статуса оказывать регуляторное влияние на экспрессию OxyR и RpoS-контролируемых генов может иметь очень важное
13
физиологическое значение для адаптации бактериальных клеток к стрессовым условиям, когда наблюдаются значительные сдвиги уровня и редокс-статуса глутатиона.
Изучение причин, вызывающих изменения концентрации внутриклеточного GSH, позволило получить доказательства того, что эти изменения являются следствием резкого нарушения ионных потоков на цитоплазматической мембране. Предложена гипотеза, согласно которой непрерывная трансмембранная циркуляция GSH в аэробно растущих клетках Е. coli представляет собой элемент сенсорного и регуляторного механизма, откликающегося на изменение параметров внешней среды и осуществляющего тонкую координацию между потоками протонов и калия и уровнем внутриклеточного АТФ. Эта принципиально новая функция GSH может быть характерной для энергосопрягающих мембран, к числу которых принадлежат цитоплазматическая мембрана бактерий и внутренняя мембрана митохондрий.
Полученные результаты могут служить теоретической основой для разработки и совершенствования методов и приемов, позволяющих подавлять развитие патогенной и другой микрофлоры при хранении и консервации пищевых продуктов и обеззараживании различных сред. В биотехнологической промышленности эти данные могут быть использованы для оптимизации процессов культивирования различных генно-инженерных штаммов. Кроме того, на основе выполненных исследований могут быть разработаны оптимальные условия для промышленного получения глутатиона в целях изготовления косметических средств, пищевых добавок и лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В процессе аэробного роста в периодической культуре клетки Е. coli поддерживают постоянную концентрацию внутриклеточного и наружного глутатиона. Мутации по генам, продукты которых являются компонентами клеточных редокс-систем или участвуют в деструкции активных форм
14
кислорода, значительно модифицируют уровень и редокс-статус глутатиона внутри и снаружи клеток.
2. Резкие изменения условий культивирования (окислительный и температурные стрессы, гиперосмотический шок, снижение наружного и внутриклеточного рН и исчерпание глюкозы) сопровождаются изменениями уровней и редокс-статуса глутатиона внутри и снаружи клеток.
3. При всех изученных стрессовых воздействиях, не связанных с добавлением экзогенных оксидантов, наблюдаются реакции, характерные для окислительного стресса и происходят изменения экспрессии антиоксидантных генов.
4. Наблюдается связь между уровнем и редокс-статусом глутатиона и экспрессией генов katG и katE, кодирующих каталазы HPI и НРИ.
5. Выход глутатиона из клеток Е. coli является редокс-чувствительным процессом, он прекращается при ингибировании дыхания и усиливается при дефиците АТФ. Движущей силой транспорта является электрохимический градиент протонов. При аэробном росте бактерий скорость выхода GSH из клеток через неидентифицированную систему транспорта равна скорости его входа в клетки с участием у-глутамилтранспептидазы.
6. Существует корреляция между физиологическими изменениями уровня внутриклеточного GSH и концентрацией калия в клетках Е. coli.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертационных исследований докладывались и обсуждались на Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-95" (ISEP'95), С.Петербург, 1995; Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-98" (ISEP'98), Москва, 1998; V Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды-2001" (ISEP-2001), Пермь-Волгоград, 2001; II Съезде биохимического общества, Москва, 1997; Международной конференции "Биоантиоксидант", Москва, 2002; III Съезде биохимического общества, С.-Петербург, 2002.
15
По материалам диссертации опубликовано 62 работы, из них 11 статей в международных журналах, 18 статей в журналах РАН, 9 статей в научных сборниках и 24 тезиса.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 399 страницах машинописного текста, включая 82 рисунка и 12 таблиц. Список литературы содержит 743 источника, из них 29 отечественных и 714 зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение неспецифического отклика и адаптивных реакций клеток на различные стрессовые воздействия» (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305). Исследования поддержаны пятью грантами РФФИ: № 94-04-11327-а; № 95-04- 11182-а; № 98-04-49053; № 01-04-48129 и № 03-04-49137, грантом Президиума РАН (физико-химическая биология) и грантом Президиума РАН (молекулярная и клеточная биология).
(#
16 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
^ Изучение функций глутатиона (GSH), открытого еще в конце 19 века,
продолжает привлекать внимание многих исследователей. В базе данных «Медлайн» содержится более 40000 работ, относящихся к изучению роли и функций глутатиона. В их числе оригинальные статьи, обзоры и книги, посвященные исследованию биохимических, физиологических, токсикологических, а также медицинских и клинических аспектов
1^ глутатиона, включая канцерогенез, лекарственную устойчивость, нервно-
дегенеративные болезни, болезни сердца, ВИЧ, состояние иммунной системы и старение организма. В научных и научно-популярных изданиях глутатион называют самым мощным природным антиоксидантом, лучшим средством клеточной защиты и одним из гарантов здоровья индивида, а достижения последних двух десятилетий в изучении роли GSH в медицине приравнивают к настоящей «глутатионовой революции». Эти успехи относятся, в основном, к изучению функций глутатиона в клетках эукариот. Роль GSH у бактерий исследована в значительно меньшей степени. В большинстве живых клеток GSH выступает как важнейший антиоксидант при защите от окислительного стресса. В связи с этим окислительный стресс, антиоксидантные системы и редокс-регуляция клеточных функций также являются предметами данного обзора.
17
ГЛАВА 1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И МЕТАБОЛИЗМ ГЛУТАТИОНА
1.1 Распространение GSH среди живых организмов
Глутатион в относительно высоких концентрациях присутствует в клетках всех без исключения эукариот (Meister и Tate, 1976; Meister, 1989). Среди прокариот он встречается преимущественно у грамотрицательных бактерий, в том числе у Escherichia coli; в большинстве грамположительных бактерий GSH не обнаружен, за исключением некоторых видов Streptococcus и Enterococcus (Fahey et al., 1978; Newton et al., 1996). Однако некоторые грамположительные бактерии способны его синтезировать или поглощать из ростовой среды, причем эта способность варьирует не только у разных видов, но и у разных штаммов в пределах одного вида (Sherrill and Fahey, 1998; Vergauwen et al., 2003). Факультативные и аэробные прокариоты, не содержащие глутатиона, продуцируют другие низкомолекулярные тиолы, по-видимому, заменяющие GSH в функциональном отношении. Так, некоторые группы грамположительных эубактерий содержат необычно высокие уровни СоА (Sundquist and Fahey, 1989), галобактерии имеют миллимолярные уровни у-глутамилцистеина (Newton and Javor, 1985), а у актиномицетов основным тиолом является микотиол (Newton et al., 1996; Newton and Fahey, 2002).
1.2 Химическая структура и реактивность глутатиона
Глутатион является трипептидом (Ь-у-глутамил-Ь-цистеинилглицин, мол. вес 307), который при физиологических значениях рН имеет две отрицательно заряженных карбоксильных группы и положительно заряженную аминогруппу. С химической точки зрения особый интерес |
