ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В последние годы повысилось внимание исследователей к процессам, происходящим в апопласте растений. Во многом это объясняется появлением новых методов извлечения содержимого этого компартмента путем центрифугирования инфильтрированных водой объектов. Использование данного метода позволило получать апопластную жидкость в больших количествах и изучать как ее катионный состав (Muhling, Sattelmacher, 1995) и величину рН (Muhling et al., 1995), так и концентрацию метаболитов (Lohaus et al., 1995). В апопласте были обнаружены многие белки-ферменты (Ogawa et al., 1996; Kronfuss et al., 1996).
В кинетических опытах с меченым углеродом было показано (Minchin, Me Naughton, 1987; Чиков и др., 1998), что ассимиляты выходят во внеклеточное пространство не только листьев, но и стеблей, где они уносятся транспирационным током воды вверх. Таким образом, в верхней части побега листья для своего метаболизма имеют, как минимум, два пула используемых фотоассимилятов: «собственные» (образовавшиеся в ходе фотосинтеза ССЬ) и «чужие» (транспортированные из других листьев-доноров).
Можно предполагать, что эти фонды различаются не только по составу и каналам их утилизации, но и по соотношению образующихся конечных продуктов. Изучение особенностей постфотосинтетического использования «собственных» и «чужих» ассимилятов может позволить более полно понять механизмы формирования составных частей урожая и найти пути к управлению как их количественным, так и качественным составом. Постфотосинтетические процессы с точки зрения различного использования «собственных» и «чужих» ассимилятов практически не описаны в литературе.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является выяснение особенностей постфотосинтетических превращений фотоассимилятов,
образовавшихся в ассимилирующей клетке и транспортированных из других фотосинтезирующих органов.
Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Проследить метаболизацию меченой глюкозы, подаваемой в побег растения с транспирационным током воды, в различных тканях льна-долгунца.
2. Изучить распределение 14С-углерода в 14С-донорных и 14С-акцепторных тканях побега через различный постфотосинтетический период после 30-минутной ассимиляции ССЬ целыми растениями льна-долгунца.
3. Выяснить роль света как в синтезе, так и в распаде конечных продуктов фотосинтеза.
Научная новизна. При исследовании распределения 14С среди меченых соединений, образовавшихся в ходе фотосинтеза 1 СОг, впервые обнаружено, что радиоактивность белковых веществ, синтезированных в листьях в процессе фотосинтеза, значительно уменьшается, и в последствии они активно (особенно водорастворимые) гидролизуются. Происходит отток продуктов гидролиза к органам-акцепторам ассимилятов.
Впервые установлено, что, в отличие от белков, содержание 14С в ацетоновой фракции меченых продуктов фотосинтеза (липиды и пигменты) 14С-донорных листьев незначительно снижается в постфотосинтетическом периоде. В результате, по мере возрастания времени постфотосинтетического периода, доля радиоактивности этой фракции среди меченых высокомолекулярных соединений листа возрастает. Сделан вывод, что пигменты при своей деградации распадаются на достаточно большие "блоки", которые повторно используются в синтезе аналогичных веществ.
Практическая значимость работы. Полученные данные об утилизации «собственных» и «чужих» ассимилятов в различных органах льна-долгунца могут иметь большое значение для поиска механизмов управления качеством
сельскохозяйственной продукции. Установление факта преимущественного синтеза нерастворимых полисахаридов волокна из «свежих» ассимилятов позволяет понять природу большой чувствительности качества льноволокна к стабильности погодных условий (Большакова, 2000) и может быть использовано в селекционной работе и при разработке агротехники выращивания льна-долгунца.
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на 2-ой Международной конференции по анатомии и морфологии растений (Санкт-Петербург, 2002), на конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), на итоговой научной конференции 2000 года КНЦ РАН (Казань, 2001), на итоговой научной конференции 2002 года КНЦ РАН (Казань, 2003), на 6-ой Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 2001), на Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке» (Сыктывкар, 2001), на 5 съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003), на международной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003).
Благодарности. Считаю своим приятным долгом поблагодарить д.б.н., профессора Владимира Ивановича Чикова за постоянное внимание и поддержку, а так же за ценные советы и замечания в период постановки экспериментов и при обсуждении полученных результатов на всех этапах работы.
Хочу выразить благодарность коллегам по работе за их помощь и участие в проделанной работе.
1. Обзор литературы
1.1. Фотосинтетический метаболизм углерода
К настоящему времени можно считать установленным, что у всех без исключения высших растений основу фотосинтетического метаболизма углерода составляет цикл Кальвина и фиксация СОг при участии РДФ-карбоксилазы.
Как известно, процесс фотосинтеза связан с хлоропластами, в мембранах которых осуществляются световые процессы. Кванты света поглощаются молекулами пигментов, при этом происходит трансформация энергии света в химическую энергию АТФ и восстановленного НАДФН. Эти конечные продукты световой стадии фотосинтеза используются в темновой фазе, где СОг восстанавливается до углеводов. Сз-путь (цикл Бенсона - Кальвина) фотосинтеза состоит из 3 этапов: карбоксилирования, восстановления и регенерации. В первой стадии молекулы рибулозо-5-фосфата фосфори-лируются с участием АТФ и соответствующего фермента, затем происходит присоединение углекислого газа с образованием 2 триоз - 3-фосфоглицери-новой кислоты (3-ФГК). Ответственен за этот шаг фермент рибулозо-дифосфаткарбоксилаза - оксигеназа (РДФ-КО). Во второй стадии осуществляется восстановление 3-ФКГ до 3-фосфоглицеринового альдегида. В результате фиксации 3 молекул СОг образуется 6 фосфотриоз, 5 из которых используются для регенерации рибулозо-5-фосфата, а одна - на синтез глюкозы. В цитоплазме 2 фосфотриозы конденсируются в фруктозо-1,6-дифосфат, из которого пройдя цепь превращений, образуются глюкоза и сахароза.
Разнообразие растений проявляется в способе подачи СОг в пентозо-фосфатный цикл. У Сз-растений, доминирующих в растительном мире, СО2 прямо включаются в цикл Кальвина. Разные экологические и систематические группы растений могут сильно отличаться по соотношению альтернативных путей синтеза углеводных и неуглеводных продуктов.
Можно выделить несколько специфических вариантов синтеза первичных продуктов фотосинтеза у С3-типа растений.
1. Растения с абсолютным преобладанием синтеза сахарозы и крахмала, у которых до 90-95% СОг вовлекается в эти соединения. При этом «сахарозный» тип характерен для растений, у которых ассимиляты интенсивно экспортируются из листа и накапливаются в запасающих органах, составляющих значительную долю относительно массы растений (картофель, сахарная свекла, многие виды арктических и альпийских гор, криофильные ранневесенние эфемеры). «Крахмальный» тип нетипичен для однодольных растений, а у двудольных накопление крахмала служит мерой временного депонирования в хлоропласте избыточных ассимилятов. Известны случаи, когда при фиксации 4СОг в крахмале локализовано 90% метки, например, у подсолнечника и редиса (Мокроносов, 1981).
2. Растения, образующие в составе фотоассимилятов раффинозу, стахиозу, вербаскозу и другие галактозосодержащие олиго- и полисахариды. Например, практически у всех растений сем. Cucurbitaceae олигозы составляют 30-40 % (Федосеева, 1970) от общей суммы ассимилятов. Эти же соединения у тыквенных являются основной транспортной формой ассимилятов (Приступа, 1957).
3. Растения, у которых наряду с образованием сахарозы и крахмала фосфогексозы частично восстанавливаются в сахароспирты - маннит и сорбит. Накопление в составе продуктов фотосинтеза, маннита и сорбита, найдено у растений различных систематических групп. Например, маннит образуется в листьях сельдерея, сирени, ясеня, дуба, в талломах бурых водорослей и др. Сорбит, как продукт фотосинтеза и транспортная форма ассимилятов, обнаружен у яблони и других древесных розоцветных. Восстановление фосфогексоз в сахароспирты обеспечивается как НАДФ*!^, так и НАД*FT -специфичными манитолдегидрогеназами и происходит в цитоплазме на свету
и в темноте, но свет усиливает этот процесс (Trip et ah, 1964; Федосеева и др., 1976).
4.Растения с большими фондами серина, глицина и глицерата. Например, у большинства бобовых, которые отличаются интенсивным фотодыханием, высоким эффектом Варбурга, глицин, серии и глицерат при фиксации 14СО2 метятся значительно интенсивнее, чем у растений с «углеводной» направленностью первичного биосинтеза (Мокроносов, 1981)
5. Большое внимание при изучении фотоассимилятов в Сз-растениях уделяется анализу крахмала и растворимых Сахаров. Однако, есть работа, которая показывает, что некоторые Сз растения, включая популярные модельные организмы Arabidopsis thaliana (L.) Heynh и важное сельскохозяйственное растение соя Glycine max (L.) Merr., содержат значительное количество фумаровой кислоты. По данным (Chia et al., 2000) фумаровая кислота может накапливаться до нескольких милиграмм на грамм свежего веса в листьях Arabidopsis, часто превышая по весу крахмал и растворимые сахара. Фумаровая кислота - компонент цикла трикарбоновых кислот, также как крахмал и растворимые сахара, может метаболизироваться для выделения энергии и для образования углеродного скелета других компонентов. Количество фумаровой кислоты в растении увеличивается в зависимости от возраста растения и интенсивности света. Кроме того, эксудат флоэмы Arabidopsis содержит значительное количество фумаровой кислоты, повышая вероятность функционирования фумаровой кислоты в углеродном транспорте.
Таким образом, фотосинтетический метаболизм углерода разнообразен как по первичным соединениям фиксации СОг, так и по конечным продуктам фотосинтеза. Далее мы будем рассматривать только Сз-тип растений с конечным продуктом в виде сахарозы.
10
1.2. Транспорт ассимилятов в растении
В целом растении транспорт ассимилятов от донора к акцептору состоит из ряда последовательно расположенных систем переноса, каждая из которых, начиная от первичных датчиков ассимилятов - хлоропластов и заканчивая вакуолями клеток запасающей паренхимы, подвергаются индивидуальной эндогенной регуляции. Все системы связаны в единую последовательность событий, которая осуществляет снабжение ассимилятами органов акцепторов, реагирует на изменения окружающей среды, вместе с тем обладает относительно высоким гомеостазом.
На начальном этапе изучения движения ассимилятов в растении основным вопросом, интересовавшим исследователей, был дальний транспорт по флоэме. За короткий промежуток времени (Курсанов, 1976) был накоплен значительный материал, касающийся ее ультраструктурной организации. Сложилось представление, что процессы, происходящие на старте - в доноре и на его финише - акцепторе, направляют и контролируют дальний транспорт веществ.
А.Л. Курсановым (Курсанов, 1984) была предложена схема эндогенной регуляции транспорта ассимилятов от донора к акцептору (рис.1). На рисунке вертикальными линиями изображены мембраны компартментов, через которые двигаются ассимиляты, в частности сахароза. Первые две зоны соответствуют фотосинтезирующей клетке, а именно хлоропласту и цитоплазме, за пределами клетки мезофилла - зона апопласта, который передает ассимиляты в сопровождающую клетку, а затем в ситовидную трубку. Наконец, завершается этот путь зоной, примыкающей к ситовидной трубке снизу, что соответствует зоне акцептора.
1.2.1. Транспорт ассимилятов внутри ассимилирующей клетки
Начальный этап транспорта ассимилятов состоит в переносе диоксиацетонфосфата и фосфоглицеринового альдегида через мембраны
11
хлоропласта в цитоплазму. Триозофосфатам принадлежит важная роль в регуляции отношений между хлоропластами и цитоплазмой. Вынос триоз осуществляется с помощью специального переносчика, расположенного на внутренней мембране хлоропласта, и он сопряжен с адекватным импортом внутрь неорганического фосфата. Современные исследования направлены на детальное изучение механизма действия вышеназванных транслокаторов.
КЛЕТКА-ДОНОР
ДАЛЬНИЙ ТРАНСПОРТ
\ { цикл \ Калвина
]ПППГ
Рис.1. Схема эндогенной регуляции транспорта ассимилятов от донора к акцептору (Курсанов, 1984).
Обозначения: Тр-Ф - триозофосфат, ПТ- переносчик триозофосфатов, ПС - переносчик сахарозы, ПГ - переносчик гексоз, ИНВ - инвертаза, В - вакуоль, КР - крахмал, Гл — глюкоза, М - мембрана, КС - клеточная стенка, СП - свободное пространство, Фн - фосфор неорганический.
V.
Болтер с соавторами (Bolter et al., 1999) установили, что каналы, формируемые белком ОЕР21 внешней мембраны хлоропласта, выборочно облегчают перемещение триозофосфатов, 3-фосфоглицератов и фосфата. Анионная избираемость и ассиметричные транспортные свойства
12
модулируются соотношениями между АТФ и триозофосфатами, 3-фосфоглицератами и фосфатом в межмембранном пространстве. Условия, которые ведут к экспорту триозофосфатов из хлоропластов, то есть фотосинтез, приводят к внешнему изменению канальных ОЕР21 белков, тогда как отношение АТФ к триозофосфату, то есть темновой метаболизм, приводит к внутреннему изменению белков ОЕР21 каналов с менее выраженной анионной избирательностью.
В случае нарушения эквимолярного возврата неорганического фосфата в хлоропласт его собственный запас фосфата быстро иссякает, поскольку каждая молекула триозы, выходя из хлоропласта, уносит с собой в цитоплазму одну фосфатную группу. Питере с соавторами (Pieters et al., 2001), изучая роль запроса углеводов в регуляции фотосинтеза в ответ на фосфатный дефицит в табаке (Nicotiana tabacum L.), показали, что низкая сила акцептора накладывает первичное ограничение на фотосинтез в Фн-дефицитных растениях, которое уменьшает сахарозный экспорт и синтез сахарозы, навязывая ограничение фотосинтеза синтезом конечных продуктов. В этих условиях переносчик триоз перестает функционировать, а избыток триозофосфатов превращается в самих хлоропластах в гексозофосфаты и далее в крахмал.
Хауслер с соавторами (Hausler et al., 2000) исследовали трансгенные растения табака с различной емкостью хлоропластного триозофосфат/фосфат переносчика для определения влияния его на изменение направления биосинтеза в сторону сахарозы или крахмала в связи с ассимиляцией СО2 и низкой концентрацией О2. Переносчик имел строгий контроль над уровнем ассимиляции. Включение в крахмал при высоком Ог увеличивалось в растениях табака с уменьшенной активностью переносчика и уменьшалось в растениях с суперэкспрессией этого белка. Таким образом, переносчик триоз осуществляет контроль по типу обратной связи над уровнем синтеза крахмала и позитивный контроль над биосинтезом сахарозы. Недостаток
13
триозофосфатного экспорта компенсируется процессами деградации крахмала и утилизации глюкозы. Также исследуемый белок-переносчик чувствителен к содержанию метаболитов в воздухе.
Таким образом, крахмал играет важную роль регулятора экспорта подвижных ассимилятов в цитоплазму (Мокроносов, 1981). Поскольку в фотосинтезирующей клетке весь крахмал локализован в строме хлоропласта, то его ингибиторное влияние должно быть связано непосредственно с хлоропластом. Депрессия фотосинтеза может развиваться по нескольким направлениям: 1) накапливаясь в хлоропласте, крахмальные линзы уменьшают свободный объем стромы, механически воздействуют на тилакоиды. Избыток крахмала ухудшает так же и световой режим в хлоропласте; 2) возможна адсорбция ферментов на зернах хлоропластов, следствием чего могут быть конформационные изменения и изменение субстратной специфичности ферментных белков; 3) крахмал может сорбировать ионы, особенно Mg2+, это ведет к снижению активности Mg -зависимых ферментов, например РДФ-КО, или даже нарушение четвертичной структуры олигомерных белков; 4) накопление крахмала увеличивает сопротивление диффузии СО2 на всем пути - устьичное, мезофильное, сопротивление карбоксилирования; 5) включение процесса гидролиза крахмала ведет к увеличению концентрации глюкозы в пластиде, что может вызвать глюкозное ингибирование.
Выходя из хлоропласта в цитоплазму (вторая зона на рисунке 1), триозофосфаты быстро претерпевают ряд промежуточных превращений, образуя сахарозу. Именно здесь впервые возникает сахароза - основной транспортный дисахарид. Ее образование связано с наличием целой системы ферментов, которая формируется в листе к периоду его созревания для экспорта ассимилятов. В частности, как показал Жиаквинта (Giaquinta,1978), к этой системе относится сахарозофосфатсинтетаза, катализирующая образование сахарозофосфата из фруктозо-6-фосфата и
14
УДФГ. Указанный фермент играет ключевую роль в цепи превращений триозофосфатов в сахарозу.
Другим ферментом, исполняющим важную регуляторную роль в той же системе, является фруктозо-1,6-бифосфатаза. Она осуществляет отщепление от фруктозо-1,6-бифосфата фосфатного остатка из положения 1. В результате этой реакции осуществляется одновременно 2 цели: 1) освобождается молекула неорганического фосфата (рис.1), которая может войти обратно в хлоропласт взамен экспортируемого триозофосфата и 2) образуется фруктозо-6-фосфат, который в отличие от фруктозо-1,б-бифосфата более стабилен, так как не может непосредственно вновь распадаться на триозофосфаты. Он дает начало образованию целого ряда гексозомонофосфатов, ведущих к синтезу сахарозы. Как и сахарозофосфатсинтетаза, фруктозо-1,6-бифосфатаза также отзывчива на донорно-акцепторные отношения, активизируясь при усилении запроса со стороны тканей акцептора и делаясь менее активной при ограничении запроса. Существенно также, что при ограничении экспорта триозофосфатов из хлоропластов, например, при понижении концентрации СОг в цитоплазме мезофильных клеток, значительно уменьшается активность и сахарозофосфатсинтетазы, и фруктозо-1,6-бифосфатазы. В результате путь к образованию сахарозы оказывается перекрытым дважды, чем обеспечивается необходимый уровень первичных продуктов фотосинтеза в цитоплазме фотосинтезирующих клеток.
Мы еще недостаточно знаем те принципы, которые лежат в основе подобной эндогенной регуляции ферментов. Тем больший интерес представляет исследование Ститт с соавторами (Stitt et al., 1983), которым удалось обнаружить в листьях шпината необычный гексозофосфорный эфир, аналог фруктозо-1,6-бифосфата - фруктозо-2,6- бифосфат, который, как оказалось, ингибирует фермент фруктозо-1,6-бифосфатазу. Этот двойной эфир фруктозы практически целиком сосредоточен в цитоплазме клеток мезофилла
15
и может в различных условиях фотосинтеза появляться в большем или меньшем количестве. Однако, за прошедшие 20 лет этот механизм так и не получил своего дальнейшего развития и подтверждения. Хамборгом и Ститтом (Hamborg and Stitt, 2001) было показано, что уровень фруктозо-2,6-бифосфата был одинаков и в пластинке, и в основании листа в темноте. Свет стимулировал уменьшение содержания этого соединения на конце листовой пластинки и увеличивал его концентрацию в основании листа. Роль фруктозо-2,6-бифосфата была изучена относительно растений, которые предпочтительнее запасают крахмал в листьях. Для растений с другим типом метаболизма его роль была не выяснена. Треванион (Trevanion, 2002) исследовал значение фруктозо-1,6-бифосфата в регуляции углеродного метаболизма в листьях пшеницы - растении, которое предпочтительнее накапливает сахарозу. Было показано, что образование фруктозо-2,6-бифосфата регулируется теми же путями, что в шпинате, и является одним из факторов, включающихся в координацию синтеза сахарозы и фотосинтеза: Однако, по мнению авторов, в заданных экспериментальных условиях фруктозо-1,6-бифосфат не включается в регуляцию распределения ассимилированного углерода между сахарозой и крахмалом.
Действие фруктозо-2,6-бифосфата на развилку метаболизма между синтезом сахарозы и крахмала в фотосинтезирующих клетках может быть истолковано различно. С одной стороны, кажется вероятным, что, усиливая превращение фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-бифосфат, этот эфир способствует компенсации встречного процесса, то есть превращения фруктозо-1,6-бифосфата во фруктозо-6-фосфат, играющего столь важную роль в альтернативе между сахарозой и крахмалом в фотосинтезирующих клетках. С другой стороны, по мнению Курсанова (Курсанов, 1984) не исключено, что фруктозо-2,6-бифосфат играет роль «фальшивого жетона», который в силу своего стереохимического подобия с фруктозо-1,6-бифосфатом легко совмещается с фруктозо-1,6-бифосфатазой, но не может дефосфорилироваться
16
ею, так как не имеет фосфатного остатка в положении 1, к которому специфичен указанный фермент. В результате фосфатаза оказывается блокированной этим эфиром, что и ограничивает возможность ее реагирования с фруктозо-1,6-бифосфатом. Это предположение с течением времени не утратило актуальности, оставаясь интересным вопросом изучения современных авторов (Scott et al., 2000).
Таким образом, на этапе первичного синтеза сахарозы в цитоплазме фотосинтезирующих клеток происходит сложная эндогенная регуляция с помощью системы ферментов, определяющих альтернативу между образованием транспортной сахарозы и временным отложением крахмала. Образующаяся сахароза обычно не накапливается в цитоплазме фотосинтезирующих клеток, а экспортируется из них или временно аккумулируется в вакуолях, образуя резервный пул, с помощью которого регулируется концентрационный градиент транспортной сахарозы.
1.2.2. Флоэмная разгрузка
Механизм разгрузки флоэмы менее охарактеризован, чем механизм загрузки ассимилятов. Предполагается, что этот механизм может варьировать не только среди видов, но и различается в зависимости от ткани и даже регулируется способом, зависимым от этапа развития растения (Turgeon, 1989). Сосуществование нескольких разгрузочных механизмов в одном организме (или в одном органе-акцепторе) обсуждается. В плодах томатов, вероятно, существует переключатель с симпластного типа разгрузки на апопластный (Miron and Schaffer, 1991; Offler and Horder, 1992; Ruan and Pattrick, 1995). Эффективность флоэмной разгрузки зависит также и от силы акцептора соответствующих тканей. Сила его определяется активностью ферментов, включенных в катаболизм сахарозы и/или синтеза крахмала. В органах-акцепторах концентрации ассимилятов выше во флоэме, чем в окружающих тканях, таким образом, облегченная диффузия по
17
концентрационному градиенту может быть одним из вероятных способов разгрузки.
Чтобы использовать постоянный концентрационный градиент, сахароза может и конвертироваться в осмотически менее действенные запасные молекулы, такие как аминокислоты или крахмал, а также разрушаться или запасаться в вакуолях. После апопластной, опосредованной переносчиком разгрузки сахароза выходит из флоэмы, и апопластная инвертаза может быть включена в деградацию сахарозы, а продукты гидролиза могут быть импортированы в клетку через моносахаридный транспортер (Turgeon, 1989; Wright and Oparka, 1989). Моносахаридные транспортеры, которые специфично экспрессируются в тканях-акцепторах, были выделены из Arabidopsis и табака (Sauer et al., 1990; Sauer and Stolz, 1994). Однако, активный моносахаридный транспорт был так же определен в пузырьках плазматической мембраны из листьев сахарной свеклы (Tubber and Buckhout, 1992). Функции этих транспортеров могут предотвратить накопление моносахаридов в апопласте. Более того, в этих условиях ткани-акцепторы могут переключаться на донорную функцию.
1.2.3. Способы загрузки флоэмы
В течение длительного времени ведется дискуссия: экспортируется ли сахароза из клеток мезофилла во флоэму проводящих пучков листа через плазмодесмы, то есть симластно, или через свободное пространство, то есть апопластно. На данном этапе изучения транспорта ассимилятов предполагается существование двух механизмов флоэмной загрузки: 1) симпластный путь через плазмодесмы, соединяя мезофильные клетки и сопровождающие элементы флоэмы; 2) путь через апопласт, в котором сахароза сначала экспортируется в апопласт, а потом проникает в комплекс ситовидного элемента и клетки-компаньона посредством энергозависимой транспортной системы. Полагают, что растения имеют предпочтение к |
