ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
С того момента, как в 1954 г была произведена первая успешная пересадка почки, трансплантация органов позволила значительно увеличить продолжительность жизни и повысить качество жизни больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности. Сегодня в мире ежегодно производится около 25 тыс. пересадок почки [Шумаков В.И.,1999г].
До внедрения в клиническую практику иммунодепрессивных препаратов трансплантацию органов проводили очень редко в связи с острым отторжением трансплантата в первые дни и недели после пересадки. Начало применения циклоспорина (CsA) 1983 г. произвело революцию в трансплантологии: выживаемость трансплантатов почки в первый год после операции повысилась на 30-35%. Несмотря на появление в 90-х годах новых иммунодепрессантов, препараты циклоспорина продолжают оставаться ключевым звеном в проведении иммуносупрессивной терапии при трансплантации органов [Danovitch G., 1997].
На фармацевтическом рынке России в настоящее время присутствуют как оригинальный препарат "Сандиммун - Неорал" ("Новартис", Швейцария), так и его дженерики - "Панимун - Биорал" ("Панацея", Индия) и "Консупрен" ("Галена", Чехия). При несомненных достоинствах давно применяемого оригинального препарата у него есть один существенный недостаток - высокая стоимость. Поэтому все большее распространение в клинической практике получают дженериковые препараты на основе циклоспорина (CsA). Применение данной группы ЛС не только необходимо, но и жизненно важно для больных после трансплантации органов. В связи с этим перед фармацевтической химией и фармакологией стоит задача оценки эффективности и безопасности дженериковых препаратов на основе CsA.
В последнее время на российском рынке фармацевтических препаратов одной из самых серьезных проблем стало появление большого числа фальсифицированных лекарственных средств. В области трансплантологии жизненно важных органов, в том числе и почек, необходимым условием успешного функционирования трансплантата и выживания пациента является медикаментозное проведение иммунодепрессивной терапии. Поэтому проблема некачественных препаратов представляет реальную угрозу для жизни людей. Актуальной задачей фармацевтической химии является адаптация упоминаемых в НТД методик к реальным условиям идентификации и количественного определения циклоспорина в ЛП.
Появление клинических симптомов повреждения печени, почек и других органов-мишеней характеризуется значительной индивидуальной вариабельностью и продолжительным индукционным периодом проявления токсических повреждений, вызванных высокими начальными дозами CsA [Keown P.A., 1992]. Это создает значительные трудности при оценке адекватности проводимой терапии. В связи с этим поиск новых диагностических маркеров и их кинетических характеристик для выявления ранней, бессимптомной токсичности является чрезвычайно актуальной проблемой.
Известно, что интенсификация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) является одним из основных проявлений нарушений обменных процессов и повышений эндогенной интоксикации организма [Karatas F., 2002]. Поэтому среди маркеров токсичности могут быть продукты ПОЛ, в частности, малоновый диальдегид (МДА).
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является оценка безопасности и эффективности применения нового препарата "Консупрен" на основе циклоспорина А в течение шести месяцев у больных после аллогенной трансплантации почки.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести терапевтический лекарственный мониторинг нового лекарственного препарата "Консупрен" (Чехия) в капсулах у больных после аллогенной трансплантацией почки методом ФПИА.
2. Определить изменение биохимических показателей крови у больных на фоне приема препарата «Консупрен» - нефротоксичности (креатинин, мочевина), гепатотоксичности (ACT, AJIT), липидного обмена, водно-электролитного баланса, общего клинического анализа крови и мочи.
3. Провести оценку биокинетических параметров (k)5 t1/2, Co, CL, D/C) отдельных биохимических констант и общеклинических показателей крови для прогнозирования правильности лечения.
4. Провести сравнительный анализ биохимических и фармакокинетических показателей препарата "Консупрен" с препаратом "Панимун-Биорал" (Индия).
5. Подтвердить впервые обнаруженную возможность использования МДА в крови в качестве диагностического маркера для выявления ранней, бессимптомной токсичности организма при иммунодепрессивной терапии СуА.
6. Адаптировать к условиям основного эксперимента методов идентификации и количественного определения CsA, которые упоминаются в зарубежной НТД без детализации.
Научная новизна
Впервые проведена оценка эффективности и безопасности нового на отечественном фармацевтическом рынке препарата "Консупрен", как основного иммунодепрессивного средства при аллогенной трансплантации почки.
Определено влияние CsA на биохимические и общеклинические показатели крови у больных в пост трансплантационный период (шесть месяцев) после АТП.
Разработаны кинетические подходы для прогнозирования изменений биохимических и общеклинических показателей, позволившие оценивать правильность проведения терапии.
Доказана возможность использования содержания малонового диальдегида в сыворотке крови как нового диагностического маркера для выявления ранней бессимптомной токсичности организма при применении препаратов на основе циклоспорина.
Методики определения подлинности и количественного определения CsA, упоминаемые в зарубежной НТД без детализации, адаптированы к условиям основного эксперимента.
Научно-практическая значимость результатов исследования
Представленный в работе материал позволяет использовать новый на российском фармацевтическом рынке препарат "Консупрен" в качестве основного иммунодепрессивного средства при проведении трансплантации органов.
Выявленные изменения биохимических и общеклинических показателей крови позволят врачам быстро и безошибочно осуществлять коррекцию нежелательных побочных эффектов при проведении терапии данным ЛС.
Используемые кинетические подходы по контролю изменений биохимических и общеклинических показателей крови позволят прогнозировать состояние больных в первые 6 месяцев после проведенной трансплантации.
По изменению содержания биохимических маркеров, в частности, впервые использованному нами МДА, осуществлять оптимальное
дозирование препарата в соответствии с индивидуальными возможностями организма.
Адаптированные к условиям основного эксперимента методики идентификации и количественного определения CsA в препарате "Консупрен" позволят контролировать качество, проводить фармацевтический анализ ЛС и воспрепятствовать использованию фальсифицированных лекарственных препаратов.
Внедрение в практику
Заключительные результаты проведенного исследования об эффективности и безопасности нового препарата "Консупрен" были направлены в Научный центр экспертизы и государственного контроля лекарственных средств (приложение к письму - от 26.07.2001 №291-22/91).
Результаты исследования внедрены в учебный процесс (специальность фармацевтическая химия) кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН:
1. Акт внедрения в учебный процесс №3 методики определения критериев качества ЛС - безопасности и эффективности препаратов на основе циклоспорина, от 21.03.2003.
2. Акт внедрения в учебный процесс №4 методики математического моделирования эффективности фармакотерапии при лечении препаратами на основе циклоспорина, от 21.03.2003.
3. Акт внедрения в учебный процесс №5 методики идентификации и количественного определения препаратов на основе циклоспорина, от 21.03.2003.
Положения, выносимые на защиту
• Результаты терапевтического лекарственного мониторинга нового препарата "Консупрен" (Чехия) в капсулах на основе циклоспорина
(с использованием метода ФПИА) у больных после аллогенной трансплантации почки;
• Результаты контроля изменений биохимических показателей крови у больных на фоне приема препарата "Консупрен" нефротоксичности (креатинин, мочевина), гепатотоксичности (ACT, АЛТ), липидного обмена (холестерин, триглицериды, ЛПВП, ЛПОНП, ЛПНП, холестериновый индекс атерогенности), водно-электролитного баланса (Na+, K+, Mg~+, СГ, Са +), общеклинического анализа крови;
• Результаты оценки биокинетических характеристик процессов восстановления значений до физиологической нормы для биохимических и общеклинических показателей;
• Результаты сравнительного анализа биохимических и фармакокинетических показателей дженериковых препаратов "Консупрен" (Чехия) и "Панимун-Биорал" (Индия);
• Обоснование возможности использования МДА в крови как нового диагностического маркера для выявления ранней, бессимптомной токсичности организма при применении иммунодепрессивной терапии циклоспорином у больных после аллогенной трансплантации почки;
• Результаты адаптации к условиям основного эксперимента методик идентификации (ИК-спектрофотометрия) и количественного определения (ВЭЖХ) CsA в препарате "Консупрен".
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на межкафедральной конференции (кафедры биохимии, фармацевтической и токсикологической химии) медицинского факультета РУДН; на II Всероссийском съезде по трансплантологии и разработке искусственных органов (Москва 2002); на IX и X Российском конгрессе «Человек и
10
лекарство» (Москва 2002, 2003 гг.); на ежегодной конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва 2002). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 10 работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 150 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 170 источников. Работа иллюстрирована шестью рисунками и 35 таблицами.
11
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Иммунологические аспекты трансплантации органов
Трансплантация почки является наиболее эффективным методом лечения пациентов в терминальной стадии хронической почечной недостаточности. К настоящему времени благодаря совершенствованию хирургической техники и успехам, достигнутым в области трансплантологии, выживаемость в ранний послеоперационный период составляет 90-95%. Качество жизни и степень реабилитации, достигаемые у пациентов с пересаженной почкой намного выше, чем у пациентов находящихся на гемодиализе [37]. Поэтому наиболее распространенной операцией в отечественной и зарубежной трансплантологии является пересадка трупной почки. К 1994 году в мире было произведено около 250 тысяч трансплантаций почки [17].
Впервые пересадку ткани в эксперименте осуществил в 1824 году Рейзингер, трансплантировавший роговицу. Впервые пересадку почки у животных осуществил в 1902 австрийский исследователь Ульман. И лишь в конце 50-х - начале 60-х прошлого века было сформировано новое направление в медицине - трансплантология, изучающая в числе других вопросов причины и механизмы приживления и отторжения пересаженных органов и тканей. Инициирующим фактором явилась операция по трансплантации почки, которую впервые провел американский хирург из Чикаго — Ричард Лоулер — в 1950 году. Но по праву датой рождения данной науки следует считать 3 декабря 1967 года, когда кейптаунский хирург Кристиан Барнард в больнице Хроте Схюр впервые в мире произвел пересадку сердца [38].
В 1954 году Джозеф Мюррей пересадил почку между однояйцовыми близнецами - почка продолжала хорошо работать в течение многих лет. Это событие было очень важным для развития трансплантологии, доказывая полную работоспособность пересаженного органа. Работа продолжалась в Бостоне, Париже, Великобритании, с использованием облучения в целях
12
уменьшения риска отторжения трансплантата, что обеспечивало хороший результат в течение даже нескольких месяцев. При этих первых операциях почку пересаживали на бедро (гетеротопная трансплантация), но затем были разработаны способы трансплантации в более естественное для нее место — в полость таза. Эта методика общепринята и сегодня [3].
1.1.1. Отбор донора и реципиента
В настоящее время под термином «трансплантация» понимают пересадку тканей или органов, хирургически изъятых из одного организма (донора), во внутреннюю среду другого организма (реципиента). Ткани от доноров, генетически идентичных реципиенту (от однояйцевых близнецов, у животных - от представителей той же линии) называют сингенными, ткани от генетически неидентичных представителей того же вида - аллогенными, от представителей другого вида - ксеногенными. Пересадки органов и тканей от самого реципиента называют аутотрансплантацией, а пересадки при двух последних типах несовместимости - соответственно аллотрансплантацией и ксенотрансплантацией (рис.1) [39].
аутогенная
от одной
части тела
в другую
(донор и
реципиент
одно и то же
лицо)
мзогеннйи
между
генетически
идентичными
особями.
(например,
однояйцовыми
близнецами)
аллогенная
донор
и реципиент принадлежат одному виду
с-';
4 I
ксеногенная
донор
и реципиент
принадлежат
к разным
Рис. 1.1.
Виды трансплантаций [144].
13
Пересадка органов требует наличия здорового донорского органа. То обстоятельство, что человеку природой даны две почки, позволяет пересадить примерно одной трети реципиентов почку от живого донора. Для других пересадок требуется трупный орган. Нехватка трупных органов сильно ограничивает пересадку органов и тканей, так как приемлемы только доноры со смертью мозга (с работающим сердцем), и только около 1% умирающих пациентов соответствуют существующим критериям отбора доноров. При трансплантации почки необходимо учитывать такие критерии, как нормальная функция почек, исходя из показателей креатинина плазмы, анализа мочи, диуреза, а также проведение массивной регидратации для купирования преренальной азотемии [3].
В большинстве центров предпочитают выполнять пересадку почки в течение ишемического периода (периода, в который почка выключена из кровотока), составляющего 24—36 ч. В тех случаях, когда имеются трансплантаты от живых доноров, хирургическое вмешательство у донора и реципиента выполняется одновременно, и ишемический период редко превышает несколько часов. Успешная пересадка почки может быть выполнена и после ишемического периода длительностью 48-60 ч, но вероятность нарушения и даже отсутствия функции почки увеличивается, если его продолжительность превысила 24-36 ч [37].
Для реципиентов единственными абсолютными противопоказаниями к пересадке являются активный инфекционный или злокачественный процессы, которые невозможно адекватно контролировать, тяжелое расстройство питания, тяжелое системное заболевание или тяжелое сердечно-сосудистое заболевание, особенно у больных диабетом.
Обычным материалом для трансплантации служат криоконсервированные органы, полученные вскоре после смерти. В передовых странах существуют межнациональные банки органов, и при возникновении необходимости в пересадках на основании компьютерного анализа подбирается донор с максимальной степенью совместимости. При
14
этом учитываются антигены основных HLA-локусов - DR, DP, DQ, А, В, С. Установлено, что решающее значение для достижения успеха трансплантации играет совместимость по генам HLA I класса, особенно DR-генам. Среди продуктов генов I класса наибольшее значение имеют антигены HLA-B. Показано, что при полной совместимости по генам DR и В и применении адекватной иммуносупрессии приживление трупной почки в течение года наблюдается в 90% случаев, тогда как при максимальной несовместимости по этим генам (различие по 4 аллелям) и той же иммуносупрессивной терапии - в 70% случаев [144].
7.7.2. Реакция отторжения трансплантата
Участие иммунной системы в отторжении чужеродной ткани впервые продемонстрировал английский иммунолог П. Медавар в 1945 году. При пересадке кожного лоскута от одного кролика другому им были обнаружены антитела у реципиента, специфичные к антигенам донора. Эти первые наблюдения явились отправной точкой для формирования одного из разделов иммунологических исследований - трансплантационной иммунологии. В самом названии феномена - трансплантационный иммунитет - скрыты как иммунологическая природа явления, так и объект действия иммуных механизмов - трансплантируемый материал. Включение таких механизмов в реализацию феномена a priori определяет наличие антигенных различий между трансплантатом и хозяином, воспринявшим данный трансплантат [14].
При проведении традиционной иммуносупрессивной терапии к группе риска относятся больные с первым типом сахарного диабета, больные с повторным трансплантатом или с плохой совместимостью с почкой донора, а также больные старше 60 лет [5].
Для возникновения реакции отторжения требуется ряд условий. Во-первых, пересаженный орган должен быть антигенным для реципиента, т.е. обладать чужеродными для него антигенами HLA, стимулирующими
15
иммунный ответ. Во-вторых, иммунная система реципиента должна быть способна распознать пересаженный орган как чужеродный и обеспечить соответствующий иммунный ответ. Наконец, в-третьих, иммунный ответ должен быть эффективным, т.е. достигать пересаженного органа и каким-либо образом нарушать его структуру или функцию. Результатом иммунного воспаления являются локальные сосудистые изменения, сопровождающиеся стазом, тромбозами, что приводит к нарушению питания и некрозу трансплантированной ткани [7,11].
Несмотря на применение мощных иммуносупрессивных препаратов, практически каждый больной переносит один или несколько эпизодов отторжения, в основном в течение первых трех месяцев после операции [3].
Отторжение происходит за счет действия гуморального и клеточного звеньев иммунитета.
*': АРС
;. Тн ' (irnii tells
¦'
Г\ IL 7 "¦' lf;N--
. ч( ч !F\4 iL 4
.. ¦ r^-. '¦'¦- 5 . '"' " ¦
:пн \>. "'••.-. .-•¦ '
¦4'boflies \ .-¦' л ( complement
antibody dependent ytn; dainagtj /,
cell-rnficiiated ., , ¦ inMammatory
cpi и яг va^cu пг
cyloioxicity mecnalois
iiytotoxicity occlusion
effects in ihft
Рис. 2.2.. Реакция отторжения [140].
16
Антиген-презентирующие клетки (АРС) активируют Т-хелперы (Тн), которые в свою очередь высвобождают лимфокины (цитокины). Интерлейкин-2 (IL-2) и у-интерферон (IFNy) нужны для активирования Т-киллеров (Тс); ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5 участвуют в активировании В-клеток; лимфотоксин и у-интерферон совместно действуют как фактор активирования макрофагов (MAF). Совокупность этих клеток участвует в реакции отторжения (рис.3.) [140].
С клинической точки зрения выделяют три вида отторжения трансплантата:
1) Сверхострое отторжение происходит во время или вскоре после операции. При этом развивается окклюзия кровеносных сосудов, связывающих трансплантат с телом реципиента. Это случается, если организм реципиента уже был иммунизированантигенами донора или антигенами, перекрестно реагирующими с антигенами донора, и у реципиента в крови есть достаточное количество антител к тканевым антигенам стенок сосудов или клеток крови донора. Эти антитела немедленно адгезируются на стенки сосудов трансплантата, активируя комплемент и систему коагуляции крови, что влечет за собой быстрый тромбоз сосудов и отключение органа.
2) Острое отторжение - это первичный иммунный ответ на трансплантат при отсутствии медикаментозной иммуносупрессии. В деструкцию трансплантата могут быть вовлечены все известные эффекторные механизмы иммунного воспаления — антителозависимые (АЗКЦТ — антителозависимая клеточнаяцитотоксичность, активация комплемента иммунными комплексами) и антителонезависимые (CD8+ ЦТЛ -антигены кластеров дифференцировки клеток цитотоксического Т-лимфоцита, ТЫ — макрофаги/ГЗТ).
17 |
