СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВИЧ 1(2) Вирус иммунодефицита человека первого (второго)
типа
СПИД Синдром приобретенного иммунодефицита
ИФА Иммуноферментный анализ
тИФА Твердофазный иммуноферментный анализ
А1а(А) Алании
Arg(R) Аргинин
Asn(N) Аспарагин
Asp(D) Аспарагиновая кислота
Cys(C) Цистеин
Gln(Q) Глютамин
Glu(E) Глютаминовая кислота
Gly(G) Глицин
His(H) Гистидин Пе(1) • Изолейцин
Leu(L) Лейцин
Lys(K) Лизин
Met( M) Метионин
Phe(F) Фенилаланин
Рго(Р) Пролин
Ser(S) Серии
Thr(T) Треонин
Trp(W) Триптофан
Tyr(Y) Тирозин
Val(V) Валин
- 5 -
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы.
В условиях развития пандемии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), важное значение для организации эпиднадзора и проведения противоэпидемических мероприятий, а также для постановки индивидуального диагноза приобретает своевременная диагностика случаев заболевания. В настоящее Бремя ВИЧ-инфекция распространяется на территориях, ранее считавшихся свободными от данной инфекции (страны Восточной Европы, Азия). Характер распространения может приобретать формы вспышек, госпитальной инфекции с формированием целой сети вторичных очагов, как это было установлено в СССР (Элиста, Ростов, Волгоград) и Румынии.
Помимо инфекции, вызываемой ВИЧ 1, в последнее время все более широкое распространение получает вирус иммунодефицита человека второго типа (ВИЧ 2). Несмотря на то, что в СССР выявлено только несколько случаев инфекции ВИЧ 2, большой поток иностранных студентов из регионов эндемичных по ВИЧ 2, может привести к широкому распространению этого вируса в нашей стране. В связи с этим разработка диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ 2 является актуальной.
Большинство методов диагностики ВИЧ -инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в крови или других биологических жидкостях. С этой целью чаще всего используются различные методики, основанные на принципах иммуноферментного анализа (ИФА). С целью исключения возможных ложноположительных реакций, полученных на первом этапе исследования сыворотки, про-
- 6 -
водится подтверждение этого результата с помощью иммунного блоттинга. Однако применение подтверждающих тестов значительно повышает стоимость обследования и интерпретация результатов иммунного блоттинга представляет определенную сложность и требует специальной подготовки. Избежать большого количества лож-ноположительных реакций можно повышая качество тест-систем, применяемых на первом этапе обследования.
Эффективность диагностики зависит от качества и специфичности антигенов, используемых в тест -системе, ее оптимизации и стандартизации.
В первых диагностических тест-системах использовались антигены ВИЧ, полученные из культуры клеток, зараженных ВИЧ. Недостатками таких тест систем являются: 1) недостаточно высокая специфичность; 2) низкая стабильность антигенов в процессе хранения; 3) недостаточная стандартность и . воспроизводимость результатов 4) необходимость соблюдения особых мер безопасности в процессе производства и использования тест -систем. Кроме того в СССР отсутствуют клеточные линии - продуценты ВИЧ.
Одним из путей совершенствования диагностических тест -систем является использование пептидных аналогов основных им-мунодоминантных эпитопов ВИЧ, полученных методом химического синтеза (синтетические пептиды) и генной инженерии (рекомби-нантные белки). Достоинствами таких тест -систем являются: 1) высокая специфичность; 2) возможность проведения дифференциации между двумя типами ВИЧ; 3) более высокая стандартность и воспроизводимость теста; 4) невысокая стоимость; 5) отсутствие необходимости в особых мерах безопасности.
- 7 -
Однако при разработке и оценке качества диагностикумов на основе пептидных аналогов эпитопов ВИЧ, необходимо использовать достаточное количество образцов сывороток крови, полученных из различных географических зон, в связи с возможными вариациями антигенов вируса, а соответственно и специфичности антител. Кроме того в состав панели необходимо включать сыворотки крови от лиц, инфицированных ВИЧ, находящихся на разных стадиях заболевания, а именно, период ранней сероконверсии, развернутую клиническую и терминальную стадии, а также образцы сывороток от детей, инфицированных ВИЧ.
Несмотря на то, что качество используемых тест-систем постоянно повышается, избавиться от всех недостатков пока не удалось. Недостаточная чувствительность тест -систем снижает эффективность обследования населения, а большое количество ложноположительных реакций приводит к значительной затрате средств на проводимое обследование. Применение тест -систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью позволило бы избавиться от перечисленных недостатков. Таким образом разработка и внедрение диагностических тест-систем, обладающих такими качествами и позволяющих выявлять антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2, является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы является совершенствование серологической диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, путем разработки диагностической тест -системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.
Для достижения поставленной цели предстояло решить следу-
- 8 -ющие задачи:
1. Охарактеризовать антительный ответ к отдельным антигенным структурам ВИЧ и сформировать панель сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ.
2. Изучить антигенные свойства синтетических пептидов с помощью созданной панели сывороток.
3. Подобрать оптимальный состав смеси антигенов на основе синтетических антигенных детерминант для иммуноферментной тест-системы, выявляющей антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.
4. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест -системы и сравнить ее с другими диагностикумами.
Научная новизна полученных данных.
Научная новизна представляемой работы заключается е том, что дается характеристика синтетических антигенных детерминант, аналогов различных участков белков ВИЧ, по их способности взаимодействовать с антителами к ВИЧ, что позволило оценить роль различных участков белковых молекул в развитии иммунного отгета и выбрать иммунодоминантные эпитопы ВИЧ.
Учет штаммоспецифических различий в сиквенсе эпитопов поверхностных гликопротеинов позволил разработать оптимальный сорбент для ИФ тест-системы.
Предложен метод сорбции биотинилированных синтетических антигенных детерминант на твердую фазу с использованием стреп-тавидина в качестве носителя, что привело к повышению чувствительности реакции и сокращению количества антигена при сорбции.
Практическая ценность работы.
Практическая значимость работы заключается в том, что на
- 9 -
основании полученных материалов была разработана тест -система "Пептест", предназначенная для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2. В настоящее время разработанная тест-система внедряется в НПО "Вектор" г.Новосибирск под названием "ВИЧ-тест 1+2".
Используя данные, полученных при создании панели сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ, разработан критерий оценки результатов тестирования сывороток крови методом иммунного блоттинга, а также схема проведения серологической диагностики. Данные материалы учитывались при разработке методических рекомендаций "Серологическая диагностика инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека, иммуноферментными методами".
- 10 -I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Антигенные структуры вируса иммунодефицита человека и гуморальный иммунитет.
Вирус иммунодефицита человека является этиологическим агентом, вызывающим у человека заболевание иммунной системы, приводящее к развитию синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - это ретровирус, который поражает преимущественно клетки, имеющие рецептор CD4.
На рисунке 1 схематически приведен геном вируса и его основные антигены. Ген gag кодирует р55 - полипротеин предшественник. При его расщеплении образуются меньшие структурные белки р17 и р24. Ген env кодирует высоко иммуногенный предшественник гликопро-теин - gpl60. При его расщеплении образуются гликопротеины gpl20 и gp41. Ген pol кодирует фермент обратную транскриптазу (р66/р51) и белок эндонуклеазу р31.
Исследования, проведенные с помощью методов иммунного блот-тинга и радиоиммунопреципитации, показали, что антитела против gpl60, gpl20, р24 и р17 при инфекции ВИЧ появляются первыми, через 2-4 недели выявляются антитела к gp41 и антигены молекул, Еесом от 50 до 65 кД (2-8). Антитела к р31 формируются в период от 3 до 6 недель, после появления самых ранних антител (2,5,8). Титр всех антител продолжает нарастать в течение нескольких месяцев и затем стабилизируется у бессимптомных носителей. У пациентов с прогрессирующим заболеванием по мере приближения к СПИД, продукция антител к р24 ослабевает и они исчезают у 2/3 пациентов (9,10), а антитела к поверхностным антигенам - gp41, gp!20 и gp 160 остаются
vif
[fttf
tat
LJR 909
vpr
vpu
LTR
p55
POL
p2A p15
P7 p9 p22 p66/p5t
env nef
gP460
Рисунок 1. Строение генома и основные антигены ВИЧ 1.
(2,8,11-13). Антитела к р31 также исчезают при приближении к СПИД, но не в тот период, когда исчезают антитела к р24, а позже(13). Также важно наличие антител к р17, т. к. антитела к этому белку появляются одними из первых и пропадают при ухудшении состояния пациента раньше, чем антитела к р24, что позволяет назначить необходимое лечение своевременно. Кроме того, в ряде случаев антитела к р24 исчезают и появляется антиген р24, но этот процесс бывает не связан с ухудшением состояни пациента, а изучения уровня антител к р17 и р24 позволяет повысить надежность предсказания течения инфекции (14).
Во многих исследованиях, проведенных различными авторами, дату инфицирования установить не удалось, но сероконверсия с характерной картиной антительного ответа имела место во время или вскоре после развития острого симптомакомплекса, вызываемого ВИЧ. Эти случаи описаны для групп реципиентов крови, наркоманов, вводящих наркотик внутривенно и гомосексуалистов (4, 15-17). Сероконверсия наблюдается у большинства лиц в течение 2-3 месяцев после первичных проявлений ВИЧ инфекции. Однако, данные, полученные в последнее время свидетельствуют о том, что вирус может находиться в латентном состоянии, сроки которого точно не определены (18). И только пременение метода PCR(polymerase chain reaction - реакция цепной полимеризации ) позволит установить длительность этого периода. Кроме того, по данным некоторых авторов, у этих лиц присутствуют антитела к,регуляторному белку, кодируемому геном nef
(19).
Из серологических методов при изучении сероконверсии лучше использовать те, которые обладают наибольшей чувствительностью при
- 13 -
определении антител р24 или к поверхностным гликопротеинам с еысо-ким молекулярным весом. Burke и др. (13) показали, что чувствительность комерческих наборов для определени антител к индивидуальным вирусным белкам значительно отличается, в частности, тест-система фирмы "Abbot" больше отражает уровень антител к gp41 и р31, тогда как другие тест-системы больше коррелируют с уровнем антител к р24, особенно наборы фирмы "Du Pont". Таким образом, данные о се-роконверсии будут различаться в зависимости от применяемой тест-системы (5).
Как и при других заболеваниях вирусной этиологии, невозможно определить антитела к ВИЧ на ранних стадиях. Кроме того описаны случаи, когда у пациентов выделяли вирус, но они при этом оставались ееронегативными(26,27). Такая ситуация встречается крайне редко, кроме периода в течение трех, а иногда больше месяцев, пока не образуются антитела к вирусу.
Данные, приведенные выше, относятся к ВИЧ 1, но в последнее время появилась информация о распространении ВИЧ 2 ео всем мире и в СССР (44-46). ВИЧ 1 и ВИЧ 2 различаются по молекулярному сиквен-су более чем на 55%, но они имеют много общих черт в морфологии, геномной организации, а также в биологии. Так же как ВИЧ 1, штаммы ВИЧ 2 обладают антигенной и биологической гетерогенностью (А7). Антитела в сыворотках крови, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ 2, могут перекрестно реагировать с антигенами ВИЧ 1 (48-50). Перекрестная реактивность наблюдается и при использовании метода им-муноблоттинга. Чаще всего такая перекрестная реактивность отмечается с белками, кодируемыми геном gag, хотя антитела к поверхностным белкам ВИЧ 2 также могут связываться, но в меньшей
- 14 -степени, с поверхностными белками ВИЧ 1 (51-54).
Использование очищенных белков из ВИЧ 1 и ВИЧ 2 при проведении иммуноблоттинга, а также синтетических пептидов из иммунодоми-нантных областей трансмембранных белков ВИЧ 1 и ВИЧ 2 показало, что некоторые сыворотки крови взаимодействуют и с белками из ВИЧ 1 и из ВИЧ 2 (46-60). В ряде работ было высказано предположение, что такие лица инфицированы и ВИЧ 1 и ВИЧ 2. У нескольких пациентов было проведено выделение обеих вирусов и определена их провирусная ДНК с помощью PCR (61,62).
Сравнение продуктов регуляторных генов из ВИЧ 1 и ВИЧ 2 показало, что белки из ВИЧ 1 nef, tat, rev и vpr имеют соответственно 34, 31, 36 и 35% идентичности по аминокислотам с ВИЧ 2, но ген vpu уникален для ВИЧ 1 (63,64), a vpx для ВИЧ 2 (65,66).
1.2. Лабораторная диагностика инфекции, вызываемой ВИЧ.
В СССР как и в США с 1985 года началось проведение массового обследования доноров и других групп населения на наличие антител к ВИЧ(20,21). Во всех странах был рекомендован к применению для контроля за эпидситуацией иммуноферментный метод. Применение имму-ноферментного анализа (ИФА) и его широкое распространение обусловлено тем, что при ИФА возможен контроль за качеством и стандартизация используемых реагентов (антигенов и антител), обладающих высокой специфичностью. Кроме того при ИФА используются меченные реагенты, позволяющие регистрировать образование комплексов антиген-антитело современными физико-химическими способами, обеспечивающими высокую чувствительность, точность и объективность учета
- 15 -
результатов. Инструментальное оснащение анализа позволяет использовать его для массовых обследований при решении проблем эпидемиологии, защиты банков крови, диспансеризации населения. Кроме того проведение ИФА гораздо дешевле, чем проведение других методов. Хотя теоретически окончательный ответ об инфицированности и инфекци-онности должен основывается на обнаружении вируса в тканях или жидкостях организма(22).
Применяемая в настоящее время, техника для культивирования вируса иммунодефицита человека громоздка и дорогостояща, методики выделения вируса продолжительны во времени и имеют недостаточную чувствительность (23,24). Учитывая все перечисленные недостатки, становится очевидным, что выделение вируса может применяться только в научных целях.
Альтернативный подход заключается в непосредственном определении антигенов ВИЧ. И хотя этот метод был многообещающим для применения в клинике, в настоящее время он широко не применяется, ввиду низкой эффективности 24,25). Поэтому определение антител к ВИЧ в настоящее время остается основой для скрининга банков крови и работ клинических лабораторий.
Несколько лабораторных методов применяется для определения антител к ВИЧ. В настоящее время твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) и иммунный блоттинг (Western blott) используются наиболее часто соответственно для скрининга сывороток крови и подтверждения, полученных положительных результатов. Другие методы, в основном используются в научно-исследовательской работе: радиоим-мунощэеципитация, непрямая иммунофлюоресценция и др. (36,37). Нес-мотря на то, что все используемые методы различаются по сложности
- 16 -
определения антител, цене, времени проведения анализа, специфичности и чувствительности, но все они нуждаются в специфических антигенах вируса, т. к. принцип этих методов основан на взаимодействии антиген-антитело. Качество проводимого анализа, как правило, определяется качеством используемого антигена.
Так при проведении иммуноферментного анализа большое количество ложноположительных реакций получают в тест-системах, где в качестве антигена используется вирус, выращенный на линии клеток Н9. Эта реактивность вызвана наличием антигенов II HLA класса, которые присутствуют в линии этих клеток, а у лиц с множественными переливаниями крови вырабатываются aHTHHLA-DR4 антитела, их взаимодействие и приводит к возникновению ложноположительных реакций. Однако антитела к ДИ4 элиминируются при соответствующей адсорбции. Для исключения этой группы ложноположительных реакций рекомендуется проведение контрольного теста с антигенами, полученными от неинфи-цированных клеток Н9. Однако, взаимодействие антител с чистыми клетками и с зараженными не освобождает от необходимости проведения подтверждающих тестов (33). Тест-системам, где используется вирус, выращенный на культуре клеток СЕМ (Genetic Systems Corp. , Seattl, Washington) присущь тот же недостаток, неизбавлены от него и технологии с использованием рекомбинантных антигенов(1).
Ложноположительные реакции встречаются часто также у пациентов с иммунологическими отклонениями : гематологическими злокачественными заболеваниями ( 7%), острыми ДНК-вирусными инфекциями (5%), и у лиц в сыворотках которых обнаруживали ревматоидный фактор, антитела к нуклеиновым кислотам и другие аутоантитела (17%), а также у реципиентов, получивших трансплантант (28- 30). Ретрос-
- 17 -
пективное исследование с помощью иммуноферментных тест-систем показало, что высокий уровень ложноположительных реакций дают паци-* енты с множественной миеломой(21%); первичным билиарным циррозом
(20%); первичным склерозивным холангитом (12%) (30) и обнаружены они также у 13% из 95 пациентов с алкогольным гепатитом (31).
Обнаружен высокий уровень ложноположительных реакций у лиц, подготовляемых к пересадкам почек - для них характерен высокий уровень реакций с панелью нормальных лимфоцитов. Получен также высокий процент ложноположительных реакций при постановке подтверждающего теста - иммуноблоттинга (5%) - в подобных популяци-ях(33,34,35).
Как основной метод для подтверждения положительных результатов, полученных на первом этапе обследования, используется иммунный блоттинг, хотя его чувствительность ниже, чем тИФА (38) и составляет иногда 88% (39). В качестве антигена в иммуноблоттинге используется смесь антигенов ВИЧ. Антигены ВИЧ, раделенные элект-
v чес*и
рофорети согласно молекулярному весу, переносятся на нитроцеллю-лозную мембрану, что позволяет в дальнейшем определить наличие антител к отдельным вирусным белкам. Состав антигена и качество связывания могут значительно варьировать в зависимости от источника антигена и метода приготовления.
Вначале исследований, проводимых с помощью иммуноблоттинга CDC (Center for Disease Control) рекомендовал считать результат положительным даже если выявлялись антитела только к р24, но в дальнейшем было показана неправильность данного утверждения (40). В настоящее время положительным принято считать результат в том случае, если присутствуют антитела не менее, чем к двум поверх- |
