ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Фотодинамический (ФД) эффект лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ), успешно применяемой в онкологии для разрушения злокачественных опухолей, в том числе опухолей головного мозга (Dougherty et al., 1998; Popovic et al, 1996; Friesen et al., 2002). Однако, в ходе ФДТ могут повреждаться и здоровые ткани, окружающие опухоль, включая периферические нервные элементы. Поэтому важно изучать реакции здоровых, неопухолевых клеток на ФД воздействие. Особую актуальность имеет исследование механизмов и закономерностей ФД воздействия на нейроны и глиальные клетки (ГК), поскольку утрата нервных клеток невосполнима, а для их нормального функционирования необходима поддержка окружающей глии (Николлс и др., 2003). Отдельные стороны ФД воздействия на нейроны исследованы сравнительно подробно (Pooler, Valenzeno, 1979; Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al., 1992a; Uzdensky, Mironov, 1999; Uzdensky et al., 2000). Был проведен ряд исследований ФД воздействия на глиомы - злокачественные опухоли глиального происхождения (Muller, Wilson, 1990; Popovic et al., 1996; Madsen et al., 2003). Однако, изучению ФД воздействия на нормальные, неопухолевые глиальные клетки посвящены лишь единичные работы (Yoshida et al., 19926; Jou et al., 2002).
В последнее время появилось множество данных указывающих на тесное взаимодействие между нейронами и глиальными клетками (Coles, Abbott, 1996; Haydon, 2000). Несмотря на то, что многие аспекты нейроглиальных взаимодействий остаются невыясненными, известно, что при различных повреждающих воздействиях ГК способны поддерживать выживаемость нейронов, и наоборот - нейроны могут поддерживать выживаемость окружающей глии (Largo et al., 1996; Kopp et al, 1997). Это может быть
существенным фактором, определяющим реакцию нейронов и ГК на ФД воздействие и ранее остававшимся без внимания исследователей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение фотодинамического повреждения нейронов и окружающих их глиальных клеток и выяснение роли происходящих при этом нейроглиальных взаимодействий.
Основные задачи исследования заключались в следующем:
1. Изучить гибель нейронов и глиальных клеток при ФД воздействии.
2. Выяснить роль нейроглиальных взаимодействий в выживаемости ГК.
3. Исследовать участие аденилатциклазного и тирозинкиназного сигнальных путей в реакциях нейронов и глиальных клеток на ФД воздействие.
4. Сравнить ФД эффективность разных фотосенсибилизаторов.
Научная новизна. Впервые изучено ФД воздействие на нормальные, неопухолевые глиальные клетки, поддерживающие естественные связи с нейронами. Установлено, что в фотосенсибилизированном механорецепторе речного рака сенсорный нейрон участвует в поддержании выживаемости окружающих ГК: избирательная инактивация нейрона усиливает ФД-индуцированный апоптоз глии. Показано, что импульсная активность нейрона не влияет на выживаемость ГК, тогда как ферменты аденилатциклазного и тирозинкиназного сигнальных путей участвуют в ФД-индуцированной инактивации механорецепторных нейронов и сателлитных ГК. Обнаружено, что следствием ФД воздействия является не только гибель глиальных клеток, но и глиоз - увеличение относительной численности ГК вокруг тела нейрона.
Практическая значимость. Данные о реакциях глиальных клеток на ФД воздействие могут учитываться при оптимизации методов ФДТ опухолей мозга и других онкологических заболеваний. Сведения о том, что фармакологические модуляторы ряда сигнальных ферментов усиливают или ослабляют ФД повреждение нейронов и ГК могут использоваться при
7
разработке методов повышения эффективности ФДТ или защиты здоровых нейронов и ГК. Материалы работы используются в учебном процессе при чтении курса лекций по фотобиологии на кафедре биофизики физического факультета РГУ. Результаты работы использованы при выполнении грантов РФФИ№ 02-04-48027 и 03-04-06101.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. ФД воздействие вызывает гибель глиальных клеток, окружающих механорецепторный нейрон речного рака, в результате некроза или апоптоза; вместе с этим увеличивается численность глиальных клеток, окружающих тело фотоповрежденного нейрона.
2. Механорецепторный нейрон поддерживает выживаемость глиальных клеток при ФД воздействии: его избирательная инактивация усиливает ФД-индуцированный апоптоз глиальных клеток.
3. Импульсная активность нейрона не влияет на выживаемость ГК, тогда как ферменты аденилатциклазного и тирозинкиназного сигнальных путей участвуют в ФД-индуцированной инактивации механорецепторных нейронов и сателлитных ГК.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на ряде всероссийских и международных конференций: 13th, 14th International Congress on Photobiology (San Francisco, 2000; Jeju, 2004); 3rd European Biophysics Congress (Munich, 2000); VI, VII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Moscow-Pushchino, 2000; Kaliningrad, 2003); 29th-32nd Annual Meeting of the American Society for Photobiology (Chicago, 2001; Quebec, 2002; Baltimore, 2003; Seattle, 2004); 9th, 10th Congress of European Society for Photobiology (Lillehammer, 2001; Vienna, 2003); III Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); 10th Annual International Laser Physics Workshop (Moscow, 2001); Saratov Fall Meeting IV-V "Optical Technologies in Biophysics and Medicine" (Saratov, 2002,2003); IX International Conference "Laser Applications in Life Sciences" (Vilnius, 2002);
Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2002); VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease (Berlin, 2003). Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в реферируемых журналах, 7 статей в сборниках и 19 тезисов.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Фотодинамическое действие света
1.1.1 Механизмы фотосенсибилизированных реакций
Фотодинамический (ФД) эффект заключается в повреждении клеток, окрашенных фотосенсибилизаторами (ФС) - акцепторами излучения, под действием света. Впервые ФД эффект наблюдал в 1900 году О. Рааб, обнаружив зависимый от освещения токсический эффект производных акридина на простейшие. В 1904 году Von Tappeiner и Jodblauer обнаружили, что для фотодинамического повреждения клеток необходим кислород (Daniel, Hill, 1991). Таким образом, для ФД повреждения клеток необходима триада: "краситель - свет - кислород". Рассмотрим основные фотохимические процессы, лежащие в основе фотосенсибилизированных реакций.
Фотосенсибилизатор при поглощении кванта света (hv), переходит из основного состояния (So) в синглетное ('S*):
S0 + hv-> 'S*.
Это состояние является короткоживущим (10"9-10~8 с) и вероятность взаимодействия молекулы ФС в этом состоянии с субстратом невелика. Из синглетного возбужденного состояния молекула ФС может перейти в основное состояние So, испустив квант света флуоресценции:
или безизлучательно в результате внутренней конверсии:
'S* -> So.
Кроме того, возможен безизлучательный переход (интеркомбинационная конверсия) молекулы ФС в возбужденное триплетное состояние (3S*)\
'S* -> 3S*.
10
В легких атомах и двухатомных молекулах синглет-триплетные переходы обычно не происходят. Однако в тяжелых атомах и многоатомных органических молекулах, к которым относятся ФС, запрет на синглет-триплетные переходы снимается благодаря спин-орбитальному взаимодействию (Конев, Волотовский, 1971). Время жизни молекулы ФС в триплетном состоянии (10-4-10+2 с) намного больше, чем в синглетном. Поэтому ФД действие осуществляется в основном через триплетное состояние красителя, а наиболее эффективными ФС являются молекулы с высоким квантовым выходом образования триплетов (Черницкий, 1986).
Выделяют два типа реакций, в которые вовлекаются возбужденные в триплетное состояние фотосенсибилизаторы. В реакциях I типа взаимодействие молекулы ФС с близлежащими молекулами биологического субстрата (R) приводит к переносу электрона или атома водорода (Владимиров, Потапенко, 1989):
3S* + R -* ST + R'+
•?O*_|_ n . C" -L. DZJ° О ¦ l\. —> О т^ IS.11
3S* + RH-+SIT + R'.
В итоге образуются высоко реакционноспособные радикалы биологических молекул. Они могут, присоединяя кислород, образовывать перекисные радикалы:
R' + О2 ^ RO/, инициирующие цепное перекисное окисление:
RO2" + RjH —* R + R]O2 , R]O2' + R2H -> Ri + R2O2', и т.д.
Также возможно образование супероксид-анион радикала (О2'~) и других активных форм кислорода (АФК):
R" + O2 -> R + O2" O2" + it -> HO2' + O2'- + H+->H2O2+O2 H2O2+ O2" -> Off + О/Г + О2,
где (0/Г) - гидроксил радикал, (Н2О2) - перекись водорода. Эти АФК при взаимодействии с ненасыщенными жирными кислотами биологических мембран инициируют цепное перекисное окисление липидов, повреждение биомембран и нарушение их функций (Girotti, 1990).
В реакциях II типа происходит перенос энергии электронного возбуждения от сенсибилизатора к соседней молекуле. В таких реакциях при энергии триплетного состояния ФС, превышающей 94 кДж, сенсибилизатор обычно взаимодействует с молекулой кислорода, переводя ее в синглетное возбужденное состояние ( О2):
3s* + o2^s + 'о2.
Образовавшийся синглетный кислород примерно в 100 раз эффективней невозбужденного О2 окисляет липиды, белки и другие биомолекулы (Владимиров, Потапенко, 1989).
Реакции обоих типов (I и Н-го) ведут к повреждению клеточных структур и, как правило, гибели клетки. Они могут протекать одновременно, конкурируя друг с другом. Эффективность каждого типа зависит от конкретного ФС, субстрата, концентрации кислорода, а также сродства ФС к субстрату (Посудин, 1987). Некоторые классы фотосенсибилизаторов (например, флавины, кетоны) участвуют в ФД реакциях I типа (Girotti, 1990). Флавины являются эффективными фотогенераторами супероксид-аниона (Schmidt, Butler, 1976; Schmidt, 1984).
При облучении фотосенсибилйзаторы обычно не претерпевают химических превращений, а выступают в роли триплетных фотокатализаторов, возвращаясь в основное состояние в конце реакции (Черницкий, 1986).
12 1.1.2 Гибель клеток при ФД воздействии
Фотодинамическое воздействие, генерируя различные цитотоксические АФК, может вызывать гибель клеток, как в результате развития некроза, так и апоптоза (Не, Oleinick, 1994). Эти два основных типа клеточной гибели были дифференцированы в 70х годах (Кегг, 1971; Kerr et al., 1972; Willie et al., 1980). Они различаются как инициирующими факторами, так и морфо-биохимическими изменениями, происходящими при клеточном коллапсе (Новиков, 1996).
Смерть некротического типа, как правило, является результатом интенсивного повреждающего воздействия, вызывающего развитие универсальной неспецифической реакции, ведущей к гибели клетки. При этом повышается проницаемость ПМ, клетка набухает за счет обводнения, происходит закисление ее цитоплазмы, разрыв мембранных компонентов клетки и ее лизис за счет высвобождения лизосомальных гидролаз. Одновременно с этими изменениями в цитоплазме изменяются и клеточные ядра: сначала они компактизируются (пикноз), затем по мере набухания ядра и разрыве его оболочки пограничный слой хроматина распадается на мелкие массы (кариорексис), далее происходит кариолизис - растворение ядра (Ченцов, 2003).
Апоптоз, называемый также физиологической или программированной гибелью клетки, осуществляется с помощью набора специфических ферментов. Это контролируемый тип клеточной гибели, управляемый различными вне- и внутриклеточными сигналами. Гибель клеток в результате апоптоза наблюдается в ходе эмбриогенеза при формировании органов, замене одних тканей на другие и т.д. Во взрослом организме апоптоз является неотъемлемым компонентом поддержания гомеостаза, выполняя комплементарную митозу функцию в регуляции клеточных популяций (Уманский, 1996). Запуск апоптоза может быть инициирован как
13
физиологическими сигналами, так и повреждающими агентами (Хансон, 1998). Основным исполнительным механизмом апоптоза является система гидролитических ферментов (протеаз, нуклеаз, липаз), осуществляющих разборку клеточных структур. Эта система запускается специальным каскадом каспаз - протеиназ, расщепляющих белки между аспарагиновой кислотой и цистеином. Результатом апоптоза является межнуклеосомная фрагментация ДНК, осуществляемая эндонуклеазами, фрагментация ядра и распад клетки на фрагменты, ограниченные ПМ (апоптозные тельца), которые в последствии поглощаются соседними клетками (Ченцов, 2003). Характерные для апоптоза фрагментация ядра и целостность ПМ, окружающей апоптозные тельца, являются важными критериями для морфологической идентификации этого типа клеточной гибели.
Решающими факторами в развитии того или иного типа клеточной гибели - некроза или апоптоза - являются целостность плазматической мембраны и уровень АТФ. Для реализации апоптоза необходима целостность плазматической мембраны (Dellinger 1996; Luo, Kessel, 1997). Если она повреждена, то клетки погибают от некроза. Также для развития апоптоза необходимо большое количество АТФ. Если уровень АТФ низкий, то происходит некроз (Nicotera, Leist, 1997; Nicotera et al., 1999; Tsujimoto, 1997).
Внутриклеточная локализация ФС оказывает существенное влияние на тип ФД-индуцированной гибели клеток. Так, в большинстве случаев, фотосенсибилизация ПМ вызывает некроз, тогда как локализация ФС в митохондриях чаще вызывает апоптоз (Dellinger, 1996; Luo, Kessel, 1997; Kessel, Luo, 1998). Отмечают и другую общую закономерность, в соответствии с которой увеличение дозы ФД воздействия, которая пропорциональна концентрации ФС, интенсивности и продолжительности облучения, переключает преобладающий тип гибели клеток с апоптоза на некроз (Oleinick et al., 2002). Индукция апоптоза предпочтительна при ФД
14
терапии опухолей, поскольку при апоптозе, в отличие от некроза, в тканях не развивается воспалительная реакция и не формируется рубец (Новиков, 1996).
Активация протеолитического каспазного каскада, запускающего и выполняющего основные процессы апоптоза, может инициироваться при ФД воздействии на лизосомы, эндоплазматическии ретикулум или митохондрии (Рис. 1.1). Фотосенсибилизаторы, локализующиеся в этих органеллах сенсибилизируют повреждение их мембран и высвобождение факторов, активирующих каспазу-3 - центральное звено каспазного каскада. Каспаза-3 активирует "нижележащие" эффекторные каспазы -6, и -7, которые расщепляют множество клеточных белков, включая ламины ядерной оболочки, нуклеазы, белки цитоскелета, клеточной адгезии и т.д. ( Oleinick et al., 2002, Рис. 1.1).
Фотосенсибилизаторы, локализующиеся в лизосомах, при облучении могут вызывать как некроз, так и апоптоз (Luo, Kessel, 1997; Woodburn et al., 1997). При фотодинамическом повреждении лизосом могут высвобождаться катепсины, расщепляющие прокаспазу-3 и превращающие ее в активную каспазу-3, запускающую апоптоз. Катепсины могут запускать апоптоз, расщепляя и другие белки, например, проапоптозный белок Bid (Oleinick et al., 2002, Рис. 1.1).
ФС, локализующиеся в митохондриях, особенно эффективно индуцируют апоптоз (Kessel, Luo, 1997, 1998, Oleinick et al., 2002). Фотоповреждение митохондрий приводит к высвобождению в цитозоль цитохрома С (Kessel, Luo, 1999; Vames et al., 1999). Цитохром С образует комплекс с цитоплазматическим белком Apaf-1, называемый "апоптосомой", и активирует протеолитический каскад, включающий расщепление прокаспазы-9 (Рис. 1.1). Образующаяся каспаза-9 активирует каспазу-3, которая активирует каспазы 2,6,7 и 8 (Не et al., 1998; Chan et al., 2000). Это приводит к быстрому развитию апоптоза (Kessel, Luo, 1998, 1999).
[5
Лизосом
Поверхностные рецепторы Fas, TNFR____
Митохондрии
Рис. 1.1 Основные компоненты клетки, участвующие в апоптозе, и возможные точки приложения фотодинамического воздействия (Узденскии, 2004, модифицировано по Oleinick et al., 2002)
16
1.1.3 Фотодинамическая терапия
Фотодинамический эффект успешно используется для разрушения опухолевой ткани в онкологии. В основе метода фотодинамической терапии (ФДТ) рака, разработанного Т. Догерти (Dougherty et al., 1975, 1978), лежит тот факт, что после введения в организм некоторые нетоксичные красители-фотосенсибилизаторы селективно накапливаются в опухолевой ткани. При последующем лазерном облучении опухоли фотовозбужденные молекулы фотосенсибилизатора генерируют синглетный кислород 'Ог и другие цитотоксические продукты, которые инициируют разрушение опухолевой ткани.
Первым фотосенсибилизатором; использованным Догерти, было производное гематопорфирина. В качестве новых поколений ФС испытываются также хлорины, фталоцианины, пурпурины и другие классы соединений (Moan, Peng, 2003). Одним из разрешенных к применению и используемым в клинической практике в России ФС является-алюмофталоцианин Фотосенс (Соколов и др., 1995; Странадко, Иванов, 2004).
Селективность накопления ФС в опухолях связывают с рядом причин (Dougherty et al., 1998; Moan et al., 1998):
1. Благодаря утечке из сосудов опухоли, более проницаемых, чем сосуды нормальных тканей, в опухоли собирается больше ФС;
2. Слабый лимфатический дренаж ведет к задержке ФС в опухолях;
3. Многочисленные макрофаги в опухолевой ткани аккумулируют агрегированные и связанные с белками ФС;
4. Большое межклеточное пространство в опухолях способствует накоплению гидрофильных ФС;
17
5. Низкий pH внеклеточной жидкости в опухолях способствует связыванию ФС клетками, т.к. при снижении pH повышается липофильность порфиринов и облегчается проникновение их в клетки;
6. В опухоли много рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛНП), связывающих много гидрофобных молекул ФС.
Основными мишенями ФДТ при лечении рака являются опухолевые клетки, капиллярная сеть, периферические нервные элементы и иммунные клетки. ФД повреждение сосудов и нарушение кровотока, играет не менее важную роль, чем прямое фотоповреждение опухолевых клеток, вызывая сильную гипоксию, сохраняющуюся после воздействия (Dougherty et al., 1998; Hasanetal., 2000).
В ФДТ используют свет в диапазоне 600-800 нм, который, обладая достаточной энергией для возбуждения синглетного кислорода, имеет максимальную глубину проникновения в ткани. Клинические применения фото динамической терапии не ограничены поверхностно расположенными опухолями. Для облучения опухолей внутренних органов используют световоды. Достоинства ФДТ по сравнению с другими методами лечения рака (хирургией, радио- и химиотерапией) - локальность и селективность воздействия, возможность повторения процедур при послойной обработке опухолей, возможность сочетания с другими методами лечения, снижение метастазирования (Gomer et al., 1987). Недостатки ФДТ - трудность точной дозиметрии воздействия и медленное выведение красителя из организма, придающее организму нежелательную' фоточувствительность.
Отдельно рассмотрим применение ФДТ для лечения глиом - опухолей мозга глиального происхождения, которые трудно поддаются хирургическому лечению и могут быть устойчивы к радио- и химиотерапии. Исследования показали хорошие результаты ФДТ при лечении таких опухолей. Так, в работе Muller и Wilson (1990) выживаемость пациентов с рецидивами после радиотерапии составила в среднем 20 недель.
|
