ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................6
1. АНАЛИТРТЧЕСКРШ ОБЗОР..............................................................................10
1.1. Характеристика исследуемых ферментов рыб и других
позвоночных животных...............................................................................10
1.1.1. Пепсины...............................................................................................11
1.1.2. Трипсины.............................................................................................25
1.1.3. Химотрипсины....................................................................................39
1.1.4. Эластазы...............................................................................................47
1.1.5. Аминопептидазы.................................................................................53
2. МАТЕРР1АЛ И МЕТОДЫ...................................................................................59
2.1. Материал и реактивы.....................................................................................59
2.2. Очистка ферментов........................................................................................59
2.2.1. Приготовление водных экстрактов, определение инактивации исследуемого материала при обработке ацетоном..........................60
2.2.2. Осаждение белков сульфатом аммония, диализ, концентрирование растворов.............................................................61
2.2.3. Гель-хроматография, обессоливание препаратов............................63
2.2.4. Ионообменная хроматография...........................................................64
2.2.5. Изоэлектрофокусирование, определение изоэлектрических точек ферментов..................................................................................65
2.3. Определение активности ферментов............................................................66
2.3.1. Определение активности протеиназ по природным
субстратам............................................................................................66
2.3.2. Определение активности протеиназ по синтетическим субстратам............................................................................................69
2.4. Определение количества белка....................................................................71
2.5. Изучение физико-химических свойств ферментов....................................71
2.5.1. Определение диапазонов pH стабильности и активности..............72
2.5.2. Определение температурного оптимума действия..........................73
2.5.3. Определение влияния ионов металлов и ингибиторов....................73
2.5.4. Определение молекулярных масс......................................................74
2.6. Статистическая обработка результатов......................................................75
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................76
3.1 Анатомо-гистологические особенности пищеварительного
тракта сома....................................................................................................76
3.2. Выделение и очистка протеолитических ферментов сома европейского.................................................................................................81
3.2.1. Определение содержания протеиназ в желудочно-кишечном тракте и влияние обработки ацетоном на их активность................81
3.2.2. Осаждение исследуемых ферментов сульфатом аммония..............84
3.2.3. Разделение и обессоливание водорастворимых белков слизистой оболочки желудка гель-хроматографией.........................................87
3.2.4. Определение изоэлектрических точек протеиназ слизистой оболочки желудка................................................................................91
3.2.5. Разделение ферментов слизистой оболочки желудка ионообменной хроматографией.........................................................94
3.2.6. Разделение и обессоливание водорастворимых белков поджелудочной железы гель-хроматографией.................................99
3.2.7. Определение изоэлектрических точек протеиназ поджелудочной железы................................................................................................101
3.2.8. Разделение ферментов поджелудочной железы ионообменной хроматографией.................................................................................105
3.3. Свойства протеолитических ферментов сома европейского.................115
3.3.1. Пепсины.............................................................................................115
3.3.2. Трипсины...........................................................................................122
3.3.3. Химотрипсины..................................................................................129
з
3.3.4. Эластазы.............................................................................................134
3.3.5. Аминопептидазы...............................................................................138
ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................142
ВЫВОДЫ.................................................................................................................146
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................148
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Б АПНА - К-бензоил-О,Ь-аргинин-р-нитроанилид
ЛИНА - L-лейцин-р-нитроанилид
MAC - молочно-ацетатная смесь
СФПНА - Ы-сукцинил-Ь-фенилаланин-р-нитроанилид
СТАПНА -М-сукцинил-три-Ь-аланин-р-нитроанилид
ТХУК - трихлоруксусная кислота
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид
ЭДТА ' - этилендиаминтетраацетат
УБС - универсальная буферная смесь
назы, но исследование этих ферментов было не достаточно подробным. Кроме этого, сом европейский является ценным объектом прудового рыбоводства [Петрушин А.Б. и соавт., 1999]. В настоящее время, промысловый вылов этого вида в крупных масштабах ведется в дельте р. Волги в районе г. Астрахани. По требованиям санэпиднадзора выловленная рыба перед замораживанием потрошится, а большое количество потенциального сырья используется малоэффективно: только в качестве добавок в рационы птиц в сыром виде и частично перерабатывается на рыбную муку. Поэтому протеиназы пищеварительного тракта сома являются интересным и перспективным объектом исследования.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение спектра протеиназ желудочно-кишечного тракта сома с высокой удельной активностью и установление особенностей их физико-химических свойств.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделение и очистка протеолитических ферментов из слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского (пепсина, трипсина, химотрипсина, эластазы и аминопептидазы).
2. Исследование физико-химических свойств этих протеиназ (молекулярная масса, значения изоэлектрических точек, оптимумы pH стабильности и активности, ингибиторный анализ).
3. Сравнение свойств протеиназ сома европейского с аналогичными ферментами других рыб и позвоночных животных других классов.
Научная новизна. При изучении протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского впервые установлено, что исследуемые протеиназы представлены несколькими изоформами, определены значения изоэлектрических точек этих протеиназ. Впервые определены молекулярные массы исследуемых протеиназ. Выяснены диапазоны pH стабильности и активности протеолитических ферментов с использованием природных и синтетических субстратов, с определением pH оптимумов.
Впервые у сома выделена и исследована аминопептидаза, обладающая свойствами сближающими ее с трипептид аминопептидазами больше, чем с лейцил аминопептидазами.
Впервые исследовано влияние синтетических ингибиторов на протеиназы слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы. Проведено сравнение молярной активности протеиназ пищеварительного тракта сома европейского и пищеварительных протеиназ млекопитающих. На основании ингибиторного анализа сделан вывод о строении активных центров исследуемых протеиназ.
Проведено сравнение протеолитических ферментов сома европейского с аналогичными ферментами других видов рыб и позвоночных животных других классов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют сведения о физико-химических свойствах протеолитических ферментов рыб и выявляют особенности в свойствах протеиназ сома европейского. В работе показано, что одна из трех изоформ пепсинов слизистой оболочки желудка сома европейского по свойствам и молярной активности ближе к пепсинам млекопитающих, чем рыб. Протеолитические ферменты сома европейского, также как и других видов рыб, в сравнении с аналогичными протеиназами других позвоночных животных имеют как сходство, так и отличия.
Благодаря высокой удельной активности протеолитических ферментов сома европейского слизистая оболочка желудка и поджелудочная железа могут служить недорогим источником ферментных препаратов с широким спектром применения.
Основные полоснсения, выносимые на защиту:
1. Распределение протеолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте сома неравномерно. Большая часть протеиназ секретируется в слизистой оболочке желудка и поджелудочной железе.
2. В слизистой оболочке желудка обнаружено три изоформы пепсина, из которых две являлись пепсинами типа II, характерными для многих хищных рыб, а одна обладала свойствами близкими к пепсинам млекопитающих.
3. В поджелудочной железе сома обнаружено по три изоформы трипсина и хи-мотрипсина, а также эластазы I и II типа.
4. Одна изоформа пепсина и две изоформы трипсина сома имеют молярную активность выше, чем соответствующие ферменты млекопитающих.
5. Протеолитические ферменты поджелудочной железы сома и соответствующие ферменты позвоночных животных других классов обладают, как общими свойствами, так и отличительными особенностями.
1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Характеристика исследуемых ферментов рыб и других позвоночных животных
Из обширной группы пищеварительных ферментов, относящихся к клас-^ су гидролаз, нами были выбраны для исследования: пепсин, трипсин, химот-
рипсин, эластаза и аминопептидаза, которые являются протеолитическими ферментами.
По строению активного центра, выбранные протеиназы, относятся к трем группам: пепсины - к аспартильным протеиназам (ЕС 3.4.23), трипсины, хи-мотрипсины, эластазы - к сериновым протеиназам (ЕС 3.4.21) и аминопептида-зы (ЕС 3.4.11), выделенные в отдельную группу [Webb E.S., 1992]. Специфичность действия протеиназ, обусловленная строением активного центра, позво-
О
ляла идентифицировать отдельные ферменты в неочищенных препаратах при
использовании специфических синтетических субстратов. Влияние ингибиторов на активность протеиназ, также обусловлено специфичностью ферментов. Пепстатин, взаимодействуя с активным центром пепсина, содержащим два> аминокислотных остатка аспарагиновой кислоты, обратимо угнетал его активность. Фенилметилсульфонилфторид, реагируя с серином и гистидином активного центра, угнетал активность трипсина, химотрипсина и эластазы. Этилен-0 диаминтетраацетат, связывая ионы металлов, подавляет активность металлосо-
держащих ферментов, к которым относится аминопептидаза.
В литературный обзор были включены сведения о протеолитических ферментах не только рыб, но и позвоночных животных других классов, с целью выяснения особенностей данных протеиназ в эволюционном аспекте. Описывались преимущественно свойства, которые мы изучали у протеиназ сома европейского: молекулярная масса, изоточки, оптимумы pH стабильности и активен ности, влияние ингибиторов.
10
1.1.1 Пепсины
Пепсины представители аспартильных протеиназ, являются эндопептида-зами и относятся к классу гидролаз. Впервые пепсин (ЕС 3.4.23.1) [Webb E.S., 1992] был получен в кристаллическом виде Д. Нортропом и М. Кунитцем в 1929 - 1930 гг., а Tang et al. в 1973 г. первыми расшифровали его полную аминокислотную последовательность.
Пепсины в своем составе не имеют простетической группы небелковой природы и состоят из одной полипептидной цепи, так как молекула содержит одну С- и одну N-концевую группы. J. Tang и R. Wong в 1987 г., сравнивая структуру и функции аспартильных протеиназ различного происхождения, пришли к выводу, что пепсины различных животных схожи молекулярной протяженностью (имеют около 330 аминокислотных остатков). Канадские, британские и российские ученые [Abad-Zapatero С. et al., 1990; Andreeva N.S. et al., 1984; Bateman K.S. et al., 1998; Kageyama T. et al., 1990; Sanchez-Chiang L. et al., 1987] своими исследованиями показали, что молекулы пепсинов различного происхождения имеют одинаковые формы и упаковки цепи, тождественную структуру активного центра. Молекула пепсина состоит в основном из ?-слоев. В двумерной симметрии пепсинов принимают участие остатки с 1 по 175, образующие N-конец и остатки от 176 до 326, принадлежащие С-концу [Kageyama Т., Takahashi К., 1986; Kageyama Т. et al. 2002]. Аминокислотная последовательность С-конца пепсина и пепсиногена одинакова, то есть разрыв связей происходит в N-концевом сегменте пепсиногена. Структура молекулы пепсиногена стабилизируется электростатическими, водородными и гидрофобными взаимодействиями между Туг 37, Lys 36, Туг 9 и двумя каталитическими аспар-татами [Kageyama Т., 2002; Richter С. et al. 1999]. Активация пепсиногена происходит или одностадийно, или в несколько этапов. Одностадийная активация заключается в отщеплении N-концевого сегмента из 47 аминокислотных остатков, в положении Leu 47-Val 48. Активация в несколько стадий идет с образо-
и
ванием промежуточных продуктов расщепления (псевдопепсина и пептидов различной величины). Псевдопепсин образуется при разрыве связей на участке между 16-м и 26-м аминокислотными остатками. Эти два вида активации, как правило, идут одновременно и происходят в результате внутримолекулярных изменений и межмолекулярного взаимодействия. При значениях pH 3,0 и ниже активация преимущественно идет за счет внутримолекулярных изменений, а при слабокислых значениях pH (около pH 4,0) - преимущественно за счет межмолекулярного взаимодействия [Kageyama Т., 2002]. Активный центр пепсина содержит два остатка аспарагиновой кислоты в положениях 32 и 215 [Мосолов В.В., 1971; Tang J. et al., 1973; Kageyama Т., 2000]. Аминокислотный остаток Lys 36 имеет важное значение для правильной укладки активного центра, так как при его замещении на один из аминокислотных остатков Arg, Glu или Met происходило существенное изменение положения Asp 215, что значительно снижало каталитическую активность пепсинов-мутантов [Richter С. et al., 1998; 1999]. Важный вклад в подвижность петли активного центра вносит Gly 76 [Okoniewska M. et al., 2000]. Пепсин гидролизует только пептидные связи, не действуя на сложноэфирные связи коротких пептидов. Для действия пепсина на пептидные связи характерна строгая стереоспецифичность аминокислотных остатков по обе стороны от гидролизуемой связи. Особенно чувствительны к действию пепсина пептидные связи образованные аминокислотными остатками с гидрофобными боковыми цепями, такие как фенилаланин, лейцин и тирозин [Мосолов В.В., 1971; Попов Е.М. и соавт., 1996]. Оптимум pH каталитического действия пепсина в желудке находится около pH 2, при слабощелочных и щелочных значениях pH молекула пепсина денатурируется. При исследовании механизма денатурации было обнаружено, что очевидно важное значение для стабильности укладки молекулы пепсина имеет Gis 53 [Konno Т. et al., 2000; Campos L., Sancho J., 2003].
Пепсины обнаружены в слизистой желудка всех исследованных в этом плане позвоночных животных. Несмотря на различную видовую принадлеж-
12
ность, они имеют сходное строение, катализируют реакции одного типа, но отличаются друг от друга по некоторым свойствам.
Пепсины рыб. У большинства видов рыб классов костистые (Osteichthyes) и хрящевые (Chondrichthyes) в желудках обнаружена высокая протеолитическая активность ферментов. Для желудочных протеиназ рыб, также как и других позвоночных животных характерна максимальная активность при кислых значениях pH и в этой же среде pH они являются наиболее стабильными, но в отличии от пепсинов высших животных они проявляют более высокую активность и стабильность при сравнительно низких температурах.
Пепсин II, выделенный из слизистой оболочки желудка акулы Scyliorhinus canicula был максимально активен при переваривании гемоглобина при pH 2,5. Интересной особенностью этого фермента являлась способность створаживать молоко при pH 6,8 и выше. Активность акульего пепсина полностью подавлялась пепстатином до концентрации 6 • 10'7 М. Исследователи Guerard F. и Le Gal Y. (1987) отнесли этот фермент к химозинам, так как свойства акульего пепсина были близки к свойствам химозина теленка, в параллельных опытах. Температурный оптимум действия этих двух ферментов совпадал в диапазоне температур от 35° до 55°С, пепсин акулы был более стабилен при температурах 30-40°С, а химозин теленка оставался стабильным до температуры 50°С.
В слизистой оболочке желудка дискуса Symphysodon aequifasciata был обнаружен пепсин обладающий способностью гидролизовать казеин с максимальной активностью при pH 2,0 [Chong А. et al., 2002 (1)].
У японского угря Anguilla japonica из слизистой оболочки желудка взрослых и ювенильных особей были выделены и частично очищены две протеина-зы: пепсин I и пепсин П. Эти пепсины незначительно отличались друг от друга по своим свойствам. Пепсин I, выделенный из желудка ювенильных рыб, проявлял максимальную активность в гидролизе гемоглобина при pH 1,5. Эта же протеиназа выделенная из желудка взрослых угрей была оптимально активна при pH 2,0 (субстрат - гемоглобин). Оптимум pH активности пепсина II при пе-
13
реваривании гемоглобина у взрослых и ювенильных особей не отличался и был определен при значении pH 3,5. Кроме того, эти протеиназы отличались своей чувствительностью к присутствию соли NaCl. Концентрация ионов NaCl в экстракте от 0,14 до 0,21 мМ оказывала активирующее влияние на пепсин I взрослых и ювенильных особей угря. Активность пепсина II в присутствии NaCl не изменялась [Chiu S.-T., Pan В., 2002]. Пепсины, находящиеся в грубом экстракте из слизистой оболочки желудка взрослых угрей, были наиболее стабильны при pH 5,2 [Takii К. et al., 1985]. Вероятно, это значение pH стабильности не является общим для пепсина I и пепсина II угря, так как без разделения этих про-теиназ нельзя судить о вкладе каждого из них в остаточную активность при этом значении pH.
В желудке атлантической трески Gadus morhua исследователями Lied E. и Solbakken R. (1984) была обнаружена значительная активность протеолитиче-ских ферментов. Для этих протеиназ трески была характерна сравнительно высокая активность при низких температурах, как и у большинства видов рыб холодных и умеренно-холодных вод [Brewer P. et al., 1984]. Haard N.F. (1986) определил, что эти протеиназы гидролизовали гемоглобин с максимальной активностью при pH 1,9 и температуре 35°С. Позже, в 1988 году Bjelland S. et al. Опубликовали данные о том, что протеиназы слизистой оболочки желудка трески представлены двумя пепсинами, с различными свойствами. Пепсин I трески при гидролизе гемоглобина был максимально активен в диапазоне pH от 3,0 до 4,0, с оптимумом активности при pH 3,5. Пепсин II трески проявляющий наибольшую активность в широком диапазоне pH от 1,5 до 3,5 имел оптимум активности при pH 2,5. Кривые зависимости активности пепсина II и пепсина свиньи, которые были получены в параллельном опыте, были близки. Пепсин I трески по характеру зависимости активности от pH был ближе к катепсинам морских беспозвоночных [Gildberg А., 1988].
У радужной форели Salmo gairdneri японскими исследователями [Kitamikado M., Tachino S., 1960 (1)] в экстракте, приготовленном из желудков взрослых особей, были обнаружены протеиназы проявляющие максимальную
14
активность при гидролизе казеина в диапазоне pH от 2,0 до 3,5, с оптимумом активности при pH 2,8. Температурный оптимум действия этих протеиназ был определен при 30-40°С. Высокая протеолитическая активность ферментов желудка была характерна для всех стадий развития форели. Американские ученые [Twining S. et al., 1983] выделили из слизистой оболочки желудка форели пеп-синоген. Наиболее благоприятное значение pH для его активации было определено ими при pH 2,0. Полученный пепсин форели гидролизовал гемоглобин при кислых значениях pH от 1,5 до 3,3, с оптимумом активности при pH 3,0. Температурный оптимум действия этого пепсина был определен при значении 15°С. В параллельных опытах эти исследователи определили температурные опти-мумы действия для пепсинов свиньи и собаки при значении 37°С, что явно не типично для пепсинов млекопитающих. Torrissen K.R. (1984) определила, что пепсины желудка форели наиболее активны при pH 2,0 и температуре 35°С.
В экстрактах из слизистой оболочки желудка лосося Salmo salar были обнаружены пепсины проявляющие максимальную протеолитическую активность при pH 2,0. Температурный оптимум действия был найден при 37,5°С [Torrissen K.R., 1984]. Следует отметить, что материал для этих исследований заготавливался в период активного питания лосося. В период нереста у лосося, также как и у осетровых рыб, в желудках активности пепсинов обнаружено не было. Очевидно, это было вызвано голоданием рыб при икрометании [Пятницкий Н.П., 1947].
У окуня Sparus aurata в экстракте из слизистой оболочки желудка были найдены пепсины проявляющие высокую активность в кислой области pH от 2,0 до 3,0, с оптимумом действия при pH 2,5. Активность протеиназ окуня и пепсина свиньи в равной степени угнеталась пепстатином. Наибольшую протеолитическую активность эти ферменты проявляли при температурах от 35° до 55°С. Эти пепсины были стабильны в довольно широком диапазоне pH, после 1 часа инкубации при температуре 40°С и при значениях pH от 2,0 до 12,0. Так в области pH от 2,0 до 7,0 они сохраняли 100% активности [Munilla-Moran R., Saborido-Rey F., 1996; Alarcon FJ. et al., 1998]. Эти исследователи предположи-
15
ли, что такая необычная стабильность пепсинов окуня связана с их аминокислотным составом. В составе пепсина окуня содержится больше основных аминокислотных остатков, чем в пепсинах млекопитающих. Такие же высокие значения pH стабильности пепсинов были обнаружены и у других видов рыб. Например, у окуня Dicentrarchus labreax наибольшая стабильность была при pH 4,3 [Eshel А. et al., 1993], у желтохвоста Seriola dumerilli - при pH 4,0 [Caruso G., Genovese L., 1992], у японского угря Anguilla japonica - при pH 5,2 [Takii K. et al., 1985]. Высокие значения pH стабильности пепсинов этих видов, вероятно, являются биохимической адаптацией организма рыб к проглатываемой воде вместе с пищей, что позволяет полнее переваривать белок.
Протеиназы, обнаруженные в слизистой оболочке желудка зубана Dentex dentex, обладали максимальной протеолитической активностью в сравнительно узком диапазоне pH, с оптимумом при pH 2,0. Наибольшую протеолитическую активность эти ферменты проявляли при температурах 30-40°С, также как и у других видов рыб. Диапазон стабильности этих протеиназ был определен при pH от 2,0 до 5,0, после 1 часа инкубации при температуре 40°С. Пепстатин обратимо ингибировал активность желудочных протеиназ зубана. По чувствительности к действию ингибитора пепсины зубана и пепсин свиньи не отличались друг от друга. Эти протеиназы исследователи отнесли к пепсинам II рыб [AlarconFJ. etal., 1998].
Три пепсиногена, выделенные из слизистой оболочки желудка тунца Thunnus thynnus, при pH 2,0 активировались в соответствующие пепсины. Активация двух пепсиногенов шла с образованием промежуточных форм, а пеп-синоген III превращался в соответствующий пепсин в одну стадию, не образуя промежуточных форм. Максимальную протеолитическую активность эти пепсины проявляли при pH 2,5 (субстрат - гемоглобин) [Tanji M. et al., 1988]. Температурный оптимум протеолитической активности был определен при 25°С [Norris E.R., Mathies J.C., 1953]. Аминокислотная последовательность N-конца, определенная для каждого из пепсиногенов тунца, позволила предположить о существовании общего предка пепсинов тунца и млекопитающих только на
16
ранних этапах эволюции [Tanji M. et al., 1988]. Исследование полной аминокислотной последовательности одного из пепсиногенов тунца, проведенные позднее, подтвердили это предположение [Tanji M., Yakabe E., 1996].
У сардины Sardina pilhardus из слизистой оболочки желудка были выделены два пепсина с молекулярными массами 35 000 Да. Эти пепсины обладали высокой протеолитической активностью при различных значениях pH. Один из них гидролизовал гемоглобин с максимальной активностью при pH 2,0, другой - при pH 4,0. Высокие концентрации соли NaCl (18-20%) оказывали ингиби-рующее влияние на активность этих протеиназ [Noda M, Murakami К., 1981].
Пепсины I и II были выделены и частично очищены из слизистой оболочки желудка взрослых особей кеты Oncorhynchus keta. Наибольшую активность при переваривании гемоглобина эти пепсины проявляли при pH 3,0. Молекулярная масса пепсина I была равна 32 000 Да, а пепсина II — 27 000 Да. Оба пепсина у взрослых особей кеты были представлены в значительном и примерно равном количестве. В слизистой оболочке желудка ювенильных особей был обнаружен только пепсин П. Ионы соли NaCl при незначительной концентрации от 0,1 до 0,2% оказывали активирующее влияние на пепсин I. Активность пепсина II в присутствии ионов NaCl не изменялась [Sanchez-Chiang L. et al., 1987].
Из слизистой оболочки желудка гренландской трески Gadus ogas были выделены и очищены три пепсиногена, которые при активации превращались в соответствующие пепсины. При pH 2,5 эти ферменты проявляли максимальную протеолитическую активность. Значения pH, которые благоприятно влияли на сохранение активности этих ферментов, определяли после 96 часов инкубации при температуре 5°С. Наибольшей стабильностью пепсин 1 обладал в диапазоне pH от 2,0 до 5,0. Для пепсина 2 благоприятные значения pH находились в области от 2,5 до 7,0. Диапазоны pH стабильности пепсина 3 трески и пепсина свиньи совпадали при значениях pH от 3,0 до 6,0. Пепсины трески были более стабильны при низких температурах: пепсин 1 при 5—20°С, пепсины 2 и 3 при 10-30°С. Пепсин свиньи, в параллельных опытах, был стабилен при температуре 57°С, что характерно для пепсинов млекопитающих. Протеиназы слизистой
17

 Часть из работы     Получить работу