СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АХР - ацетихолиновыи рецептор
нАХР - никотиновый ацетихолиновыи рецептор
АХЭ — ацетилхолинэстераза
НКИ - неконкурентный ингибитор
ТКП - ток концевой пластинки
мТКП- миниатюрный ток концевой пластинки
9 6
1.ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность исследования
В нервно-мышечном соединении постсинаптические токи, возникающие в ответ на нервный импульс, могут угнетаться биологически активными веществами, имеющими различные механизмы действия. Как правило, самого факта влияния вещества на параметры постсинаптического тока недостаточно для определения конкретного механизма. Ситуация осложняется еще и тем, что многие биологически активные вещества обладают сразу целым спектром механизмов действия (Colquhoun, 1981; Ralevic, Bumstock, 1998; Chiodini et al., 2001).
Прежде всего, вещества, уменьшающие амплитуду постсинаптических токов, могут действовать или на процесс выброса агониста из нервного окончания, или непосредственно на постсинаптические рецепторы, или сочетать оба этих действия. Одним из подходов к решению вопроса о пре-или постсинаптическом механизме действия вещества является исследование его влияния на постсинаптические токи, возникающие при вызванном и спонтанном квантовом освобождении медиатора. Спонтанная квантовая секреция агониста является довольно стабильным процессом и сравнение действия вещества на спонтанные и вызванные постсинаптические токи позволяет судить о соотношении его пре- и постсинаптических эффектов.
Если говорить о веществах, уменьшающих амплитуду постсинаптических токов за счет влияния непосредственно на
постсинаптические рецепторно-канальные холинорецепторы, то их можно разделить на три класса: блокаторы, аллостерические модуляторы и ускорители десенситизации (Cockroft et al., 1990; Conley, Brammar, 1996; Changeux et al., 1998; Arias, 1998; Jackson, 1999; Krusek et al., 2004). Блокаторы можно подразделить на конкурентные, занимающие на рецепторе посадочные места для агониста и тем мешающие его посадке и последующему открытию канала, и неконкурентные, взаимодействующие с ионным каналом (Colquhoun, 1981). Неконкурентные блокаторы делят на три подгруппы - блокаторы закрытого канала, блокаторы открытого канала и блокаторы открытого канала ловушечногФ типа, которые впервые были описаны для глутаматных рецепторов (Lingle, 1983; Gurney, Rang, 1984). Различают медленные, быстрые и средние блокаторы открытого канала; медленные ускоряют спад постсинаптических токов, быстрые — замедляют, средние делают его двухфазным. Аллостерические модуляторы взаимодействуют со специфическими участками рецепторно-канального комплекса и меняют кинетику его работы; ускорители десенситизации повышают вероятность перехода рецепторно-канального комплекса в десенситизированное непроводящее состояние, являясь фактически специализированной разновидностью аллостерических модуляторов.
Большой интерес с практической и теоретической точки зрения представляют вещества, способные оказывать длительное ингибирующее воздействие на синаптическую передачу (такого рода воздействие необходимо при некоторых заболеваниях), однако сейчас известно немного
8
таких веществ. Блокаторы ловушечного типа могут длительное время оставаться в закрытом канале ионотропного рецептора, но только в отсутствие агониста, то есть в неактивном синапсе (Blanpied et ah, 1997; Giniatullin et al., 2000). Длительное воздействие на ионотропные рецепторы могут оказывать некоторые токсины (Уткин и др., 1999; Bambrick, Gordon, 1994; Tsetlin, Hucho, 2004; Lewis, 2004), но их эффект обусловлен необратимостью связывания с рецептором или каналом, что сильно ограничивает возможности их применения и делает их веществами, опасными для жизни. Вещества же безопасные и способные при этом оказывать длительное воздействие на активно работающий синапс до сих пор известны не были.
Ранее были получены данные о слабообратимом ингибирующем действии нетоксичного и широко применяемого в клинической практике амфифильного антисептика хлоргексидина на постсинаптические токи в нервно-мышечном соединении (Соколова и др., 1998). Однако точный механизм и особенности действия этого вещества до сих пор не были исследованы и представляют собой актуальную, теоретически и практически значимую задачу. Для полного понимания механизма взаимодействия молекулы хлоргексидина и рецепторно-канального комплекса наряду с электрофизиологическими экспериментами необходимо было также провести модельные исследования, которые способны детально прояснить поэтапное развитие экспериментально наблюдаемых эффектов.
9 1.2. Цель и основные задачи исследования
Целью настоящего исследования было выяснение механизмов, посредством которых реализуется действие хлоргексидина на никотиновый рецептор мышечного типа.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Исследовать действие хлоргексидина на параметры вызванных и спонтанных постсинаптических токов в нервно-мышечном соединении лягушки.
2. Найти экспериментальные условия, позволяющие определить механизм действия хлоргексидина на ионотропный холинорецептор мышечного типа.
3. С помощью математического моделирования проверить гипотезы о механизмах действия и определить константы в кинетической схеме взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорецептором мышечного типа.
1.3. Положения, выносимые на защиту
1. В действии хлоргексидина на никотиновый холинорецептор мышечного типа присутствуют два компонента: блокада открытого канала медленного типа и аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса.
2. Аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса
10 преобладает в действии хлоргексидина и обеспечивает 70% общего эффекта.
Как аллостерический модулятор хлоргексидин снижает сродство холинорецептора к агонисту и вероятность нахождения канала в открытом состоянии.
1.4. Научная новизна
Впервые для никотиновых холинорецепторов мышечного типа показано существование вещества, имеющего двухкомпонентный механизм действия - блокирование открытого канала и аллостерическую модуляцию кинетики рецепторно-канального комплекса. Причем наличие и преобладающая роль механизма аллостерической модуляции для хлоргексидина показаны как экспериментально, так и с помощью математического моделирования.
Впервые показана теоретическая возможность существования нового механизма пролонгированного действия для аллостерических модуляторов, связанного со способностью вещества растворяться в липидах мембраны и оказывать модулирующее действие через специализированные места посадки, находящиеся в зоне липид-белкового взаимодействия. В этом случае обратный выход из липида в водную фазу будет сильно затруднен и эффект вещества долго не будет "отмываться", несмотря на обратимое связывание этого вещества с рецепторно-канальным комплексом.
Впервые найдены функции, описывающие динамику изменения концентрации ацетилхолина и активности ацетилхолинэстеразы в
11 синаптической щели нервномышечного соединения холоднокровных.
Впервые построена и исследована математическая модель, описывающая кинетику взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорецептором мышечного типа.
1.5. Научно-практическая ценность
Полученные в данной работе результаты вносят вклад в понимание механизмов функционирования синаптического аппарата скелетных мышц и углубляют наши представления о работе никотинового рецептора мышечного типа. Одновременное экспериментальное и модельное исследование тонких механизмов, обусловливающих особенности действия слабообратимых ингибиторов ионных токов, является новым методическим подходом, позволяющим приблизиться к пониманию принципов модуляции работы ионотропных рецепторов. Эти данные помогут понять механизм действия некоторых лекарств с пролонгированным синаптическим эффектом, а также могут лежать в основе создания новых лекарственных средств, мишенями для которых являются синаптические структуры. Полученные зависимости, описывающие динамику изменения концентрации ацетилхолина и активности ацетилхолинэстеразы в синаптической щели, можно использовать при моделировании кинетики процессов в нервно-мышечном соединении холоднокровных.
12
1.6. Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (Казань, 2003, 2004, 2005), 6-й, 7-й, 8-й международных пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2002, 2003, 2004), VI Всероссийском симпозиуме и школе-семинаре молодых ученых и учителей (Набережные Челны, 2004), XI Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, 2004), международном симпозиуме "Neuron differentiation and plasticity - Regulation by intracellular signals" (Москва, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной школе-конференции "Intematioanl workshop in cell physiology" (С-Петербург, 2004).
13 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Никотиновый холинорецептор
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор (нАХР) является подтипом холинергических рецепторов, наиболее давно известного и наиболее изученного типа клеточных рецепторов. В 1914 году Dale обнаружил, что два алкалоида, никотин и мускарин, могут частично воспроизвести физиологические эффекты, вызываемые ацетилхолином (Dale, 1914). Впоследствии было выяснено, что никотин и мускарин специфически активируют два разных подтипа холинорецепторов, которые стали называть никотиновым и мускариновым холинорецепторами. нАХР является ионотропным рецептором, то есть его активация непосредственно ведет к открытию трансмембранного ионного канала. Мускариновый холинорецептор является метоботропным, его активация не приводит непосредственно к открытию канала, а активирует цепочки внутриклеточных вторичных посредников, вызывающих в разных клетках различные эффекты. нАХР входит в семейство лиганд-активируемых каналов, которое включает в себя также 5-НТ3, глициновые и ГАМК рецепторы типа А и С. Эти рецепторы известны как Цис-петлевые рецепторы, так как все они содержат последовательности, содержащие пару цистеиновых остатков, разделенных 13 другими остатками и связанных дисульфидным мостиком. Все эти рецепторы имеют по пять субъединиц, каждая из которых имеет по четыре трансмембранных домена.
14
нАХР могут быть разделены на две группы: мышечные рецепторы, которые найдены в скелетном нервно-мышечном соединении, где они опосредуют нервномышечную передачу, и нейрональные рецепторы, которые найдены как в периферической, так и в центральной нервной системе. Наблюдаемые функциональные свойства этого семейства рецепторов могут быть описаны четырьмя основными атрибутами: 1) нАХР могут связываться только со своими специфическими медиаторами; 2) вслед за связыванием медиатора ионный канал, входящий в структуру нАХР, открывается на время порядка 1 мс; 3) после открытия канала через него могут проходить только катионы (большинство одно- и двухвалентных катионов, включая даже некоторые органические); 4) при длительной активации нАХР десенситизируются и в этом конформационном состоянии рецептор-ассоциированный ионный канал теряет временно способность открываться (Katz, Thesleff, 1957). Общая проводимость ионных каналов нАХР в нормальных условиях варьирует как в зависимости от субъединичного состава ИХР, так и для нАХР одного типа; прямые измерения для одиночных каналов дают величины проводимости от 5 до 60 nC(Brammar, 1996).
Ионные каналы разных типов нАХР имеют сильно различающуюся проницаемость для ионов Са2+; отношение проницаемости для Са2+ к проницаемости для Na+ варьирует от 0.2 для мышечных нАХР (Vernino et al., 1992) до 20 для нейрональных гомомерных а7 каналов (Seguela et al., 1993). Показано также, что повышение концентрации внеклеточного Са2+
15
увеличивает частоту открывания ионного канала для нейрональных, но не для мышечных нАХР (Brammar, 1996). Последний эффект не связан с входящим в клетку Са +, так как наблюдается и при полном связывании внутриклеточного Са +.
Ионные каналы нАХР мышечного типа имеют линейную вольтамперную характеристику и пропускают как входящий, так и выходящий ток. В отличие от них, ионные каналы нАХР нейронального типа пропускают лишь входящие токи и закрываются при деполяризации мембраны; показано, что причиной этого является внутриклеточный Mg (Ifune, Steinbach, 1990).
2.2. Субъединичный состав холинорецепторов
На сегодня идентифицировано 17 типов субъединиц, входящих в состав холинорецепторов. По молекулярной структуре они подразделяются на al — а 10, pi - р4, у, 5, 8 (Grutter, Changeux, 2001). Не любые комбинации субъединиц являются функционально активными; так, нАХР в развивающейся скелетной мышце состоят из двух al, pi, у и 8, а в развившейся скелетной мышце вместо субъединицы у появляется субъединица s (Mishina et al.,1986). В нейронах встречаются как гомомерные (а7 - а9), так и гетеромерные (из различных аир субъединиц) структуры (рис. 1). Сборка субъединиц, которые формируют пентамеры мышечного рецептора, очень плотная и имеет следующую последовательность а 1 га 1 р 1 у.
16
Сборка субъединиц в неирональных нАХР менее плотная, чем в мышечном рецепторе; субъединицы гетеромерных неирональных нАХР соединяются для формирования функциональных каналов со стехиометрией (а)2((3)3 (Anand et al., 1991), за исключением рЗ и а5, которые не формируют никаких
рецепторов.
А
Рис. 1. Организация и структура нАХР. А. Организация субъединиц в мышечном типе рецептора и в нейрональном гомомерном и гетеромерном рецепторах, показана локализация мест связывания АХ. В. Латеральный вид организации субъединиц и включение их в мембрану (из Le Novere et al., 1999).
Известно, что место связывания лиганда расположено на поверхности а субъединицы и смежных с ней субъединиц (Corringer et al., 2000). Таким образом, предсказуем тот факт, что разные комбинации субъединиц неирональных нАХР имеют различные фармакологические и биофизические свойства. Эта способность гетеромерных рецепторов приводит к различию свойств рецепторов и представляет собой прекрасный пример происхождения максимального количества функциональных различий из минимального количества генетической информации. Показано, что АХ
? 17
связывается с разной степенью аффиности с двумя различными сайтами.
Один из этих сайтов, высоко аффинный локус, находится между а и 8 субъединицами, а низкоаффинный сайт находится между а и у. В гомомерных холинорецепторах предположительно имеется пять посадочных
мест для АХ.
.»¦
2.3. Структурные компоненты нАХР
На основании анализа гидрофобности было выяснено, что нАХР имеет три хорошо различимых части: гидрофильную внеклеточную часть, гидрофобную часть, находящуюся в мембране, и гидрофильную внутриклеточную часть. Внеклеточный домен содержит как N- так и С-
* терминали. Известно, что место связывания агониста находится в N-терминали (Bertrand et al., 1995; Stephenson, 1995; Smith, Olsen, 1995). N-терминаль также имеет, в зависимости от субъединицы рецептора, один или более чем один предполагаемый центр гликолизирования (Hucho et al., 1996). Первичная последовательность каждой субъединицы рецептора пересекает липидную мембрану 4 раза формируя трансмембранные домены М1-М4 (рис.
* 2). М2 последовательность каждой субъединицы участвует в формировании стенки рецептор-ассоциированного ионного канала. В катион-селективных каналах М2 последовательность содержит отрицательно заряженные остатки, в то время как анион-селективные каналы, содержат положительно заряженные остатки. Внутриклеточный домен фомрируется гидрофильными участками трансмембранных доменов МЗ и М4. В свою очередь М1-М2 и |
