Список сокращений
AM - альвеолярные макрофаги
АОА - антиоксидантная активность
АОЗ - антиоксидантная защита
АОС - антиоксидантная система
АФК - активные формы кислорода
БАВ - биологически активные вещества
ВСНММ - вещества средней и низкой молекулярной массы
ГПО - глутатионпероксидаза
ИСЭ - интервал стойкости эритроцитов
КУЭ - кислотная устойчивость эритроцитов
МДА - малоновый диальдегид
МКК - малый круг кровообращения
МПА - мясопептонный агар
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
ОРЭ - осмотическая резистентность эритроцитов
ПВП - поливинилпирролидон
ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты
ПОЛ — перекисное окисление липидов
СОД - супероксидцисмутаза
ССЭ - сорбционная способность эритроцитов
ТБК - тиобарбитуровая кислота
ТХУ - трихлоруксусная кислота
цАМФ - циклическая аденозинмонофосфорная кислота
цГМФ - циклическая гуанозинмонофосфорная кислота
ЦНС - центральная нервная система
5 ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Сохранение и выращивание здорового поголовья животных является важнейшей задачей ветеринарной службы. Выявление патогенетических механизмов развития бронхопневмонии у телят в условиях сельскохозяйственного производства и разработка на этой основе терапии является актуальной научно - практической проблемой ветеринарии, не решенной в достаточном объеме до настоящего времени. Бронхопневмония в Пермской области продолжает занимать ведущее место среди незаразных заболеваний молодняка, приводящая к торможению роста и развития телят и потере ими в дальнейшем высокой продуктивности, а следовательно, увеличению затрат на лечение и кормление заболевших животных.
Бронхопневмония характеризуется не только воспалительным процессом в легких, но и изменением функционирования нейроэндокринной, сердечно-сосудистой, иммунной, желудочно-кишечной и других систем организма. В результате поступления из очага воспаления токсинов, и не только медиаторов воспаления, в организме накапливаются многие биологически активные метаболиты, которые могут легко встраиваться в биомембранные структуры клеток, нарушая их функцию.
Установлено, что у животных разного возраста при бронхопневмонии изменяется количество эритроцитов (Р.З. Курбанов, 1991; В.И. Федюк, А.С. Лысухо, 1997; А.И. Пахмутов, 2000; А.И. Молев с соавт., 2003). Лишь единичные работы посвящены исследованию качественного состава этих клеток. Отсутствует оценка функционального состояния эритроцитов в зависимости от степени тяжести бронхопневмонии телят.
В последние годы доказано, что любой воспалительный процесс в организме связан со структурными и функциональными изменениями клеточных мембран и сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Показано, что в плазме животных при бронхопневмонии возрастает уровень первичных и вторичных продуктов
6
ПОЛ и угнетается активность ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ) организма (0.3. Нагашян, А.В. Манасян, 1991; М.В. Степаненко, P.P. Фархутдинов, 2001; Н.М. Сухов, 2002; И.А. Пахмутов, Л.С. Межевов, 2003; М. Phillippo et al., 1997). Накопление продуктов ПОЛ при бронхопневмонии позволяет судить не только о состоянии мембран клеток крови, но и о развитии токсемии на уровне целостного организма. В отечественной литературе данных о состоянии процессов ПОЛ-АОЗ в эритроцитах больных бронхопневмонией животных мы не обнаружили.
В настоящее время при различных патологических состояниях организма уделяют большое внимание синдрому эндогенной интоксикации. Важной причиной интоксикации являются интенсификация тканевого катаболизма, повреждение барьерных систем и образований, которые в нормальных условиях препятствуют проникновению токсических веществ в межклеточную жидкость и клетки (М.Л. Уманский с соавт., 1979; Н.И. Габриэлян с соавт., 1985; МЛ. Малахова, 1995). Субстратом, ответственным за возникновение многих патологических эффектов эндогенной интоксикации, считают вещества средней и низкой молекулярной массы (ВСНММ), уровень которых в крови отражает выраженность метаболических расстройств. Доказано диагностическое значение этих веществ при воспалениях разного характера. Показано, что даже незначительный избыток или дефицит этих веществ может вызвать изменения в процессе развития организма.
В ветеринарии оценку эндогенной интоксикации организма по содержанию в крови ВСНММ проводят редко. В доступной нам литературе данные о концентрации ВСНММ в крови и эритроцитах животных больных бронхопневмонией не найдены.
Однако поиск универсального критерия, отражающего глубину и возможный прогноз развития эндогенной интоксикации при бронхопневмонии, является актуальной проблемой при лечении данного заболевания. В связи с этим представлял интерес изучение некоторых
7
факторов эндогенной интоксикации и функциональной активности эритроцитов телят при бронхопневмонии разной тяжести.
Традиционные методы лечения бронхопневмонии часто мало эффективны, что приводит к затягиванию периода выздоровления, переходу острой формы болезни в хроническую. В связи с этим включение в традиционную терапию иммуномодуляторов и лекарственных растений, обладающих отхаркивающими, противовоспалительными,
спазмолитическими свойствами может быть патогенетически обосновано.
В последнее время на промышленных комплексах недостаточно внимания уделяется профилактическим мероприятиям, при проведении которых можно значительно уменьшить заболеваемость молодняка бронхопневмонией. Использование препаратов из растительного сырья позволяет сократить расходы предприятий на проведение профилактики.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение распространенности бронхопневмонии у телят в хозяйствах Пермской области, клинико-биохимических особенностей ее развития, оценка возможности использования показателей свободнорадикального окисления, активности АОЗ и уровня эндогенной интоксикации для определения степени тяжести бронхопневмонии, разработка терапии с оценкой эффективности разных схем лечения больных бронхопневмонией телят и собак, внедрение плана профилактических мероприятий бронхопневмонии.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) выяснить распространенность бронхопневмонии телят в хозяйствах Пермской области;
2) изучить клинические особенности бронхопневмонии у телят в хозяйствах Пермской области в зависимости от тяжести заболевания;
3) выявить особенности структурно-функциональной организации эритроцитов и состояние ПОЛ-АОЗ у телят больных бронхопневмонией;
8
4) определить уровень эндогенной интоксикации по содержанию ВСНММ и у телят при бронхопневмонии;
5) дать комплексную оценку эффективности разных схем лечения бронхопневмонии телят и собак;
6) разработать план профилактических мероприятий при бронхопневмонии телят.
Научная новизна работы
Впервые изучены физико- химические свойства эритроцитарных мембран телят при бронхопневмонии. Установлено, что у телят больных бронхопневмонией происходит активация процессов ПОЛ и угнетение АОЗ как в мембранах эритроцитов, так и в плазме крови по сравнению со здоровыми животными. В острую фазу болезни изменения уровня МДА и каталазы были более выражены в плазме, чем в эритроцитах. При исследовании уровня эндогенной интоксикации по содержанию ВСНММ в эритроцитах и плазме у телят при бронхопневмонии, выявлено более резкое снижение содержания этих веществ в эритроцитах и повышение их уровня в плазме у телят с тяжелой степенью бронхопневмонии.
Разработана схема лечебных мероприятий, которая кроме антибиотикотерапии включала настои лекарственных трав (багульника болотного, первоцвета весеннего, мать-и-мачехи обыкновенной) или тимоген в дозе 2 мкг/кг. Показана эффективность включения антиоксидантов витаминной природы в комплексное лечение бронхопневмонии у собак. Для профилактики бронхопневмонии телят отмечена эффективность использования настоев лекарственных растений (зверобоя продырявленного, ромашки пахучей, щавеля конского, тысячелистника обыкновенного) и аэрозолей пихтового масла. Данные схемы лечебно-профилактических мероприятий не требуют значительных денежных вложений.
9
Практическая ценность
Полученные данные расширяют и углубляют имеющиеся сведения о патогенезе бронхопневмонии животных. С помощью разработанных лабораторных и клинических методов можно определить выраженность дисгомеостаза организма телят при бронхопневмонии и проводить контроль эффективности применяемой терапии. Результаты исследований могут быть использованы при разработке методов лечения и профилактики бронхопневмонии животных.
Положения, выносимые на защиту:
1. У больных бронхопневмонией телят наблюдается изменение
структурно-функционального состояния эритроцитов: увеличение минимальной осмотической резистентности, кислотной устойчивости и сорбционной способности эритроцитов. Кроме того, происходит активация процессов ПОЛ и угнетение АОЗ в эритроцитах и плазме у телят при бронхопневмонии. Степень изменения состояния мембран эритроцитов зависит от тяжести заболевания.
2. Уровень токсемии у больных бронхопневмонией телят зависит от степени тяжести заболевания. У всех телят при бронхопневмонии наблюдается снижение уровня ВСНММ в эритроцитах. При тяжелой степени бронхопневмонии в острый период в плазме отмечено увеличение содержания среднемолекулярных пептидов.
3. Продолжительность течения бронхопневмонии у телят при включении в традиционную схему лечения настоев лекарственных трав (багульника болотного, мать-и-мачехи обыкновенной, первоцвета весеннего) сокращается в среднем в 1,5 раза, а тимогена в дозе 2 мкг/кг - в 2 раза по сравнению с животными с традиционной терапией.
4. Включение антиоксидантов в комплексное лечение бронхопневмонии собак имеет патогенетическое обоснование.
'v*
10
5. Применение настоев лекарственных растений (тысячелистника обыкновенного, ромашки пахучей, зверобоя продырявленного, щавеля конского) в схеме профилактических мероприятий способствовало уменьшению заболеваемости телят бронхопневмонией в среднем на 25 %, а обработок помещения профилактория аэрозолями пихтового масла -в 2 раза по сравнению с контрольными животными.
Внедрение результатов исследования
Разработаны и внедрены схемы лечения и профилактики бронхопневмонии телят в хозяйствах Пермской области. Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по курсу: «Внутренние незаразные болезни сельскохозяйственных животных» в ВГСХА, УГСХА и ПГСХА.
Апробация работы
Основные результаты исследований доложены на 1-й Международной конференции «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии» (Уфа, 2000); научной конференции, посвященной 85-летию высшего образования на Урале (Пермь, 2001); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2001); 3-ем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Пермской областной научной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов (Пермь, 2002); Международной научно-производственной конференции по актуальным проблемам Агропромышленного комплекса (Казань, 2003); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской государственной
сельскохозяйственной академии (Ульяновск, 2003) и научно-производственной конференции «Эффективность адаптивных технологий» (Ижевск, 2003).
11 Публикации
По материалам диссертации опубликованы 12 работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических предложений. Работа изложена на 16f страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 249 источников, в том числе 26 на иностранном языке.
12 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Патогенетические аспекты развития бронхопневмонии
А
Развитие бронхопневмонии обусловлено поражением организма бактериальной или вирусной микрофлорой в сочетании с факторами, ослабляющими иммунитет. Формирование этого патологического процесса тесно связано с состоянием защитных систем бронхов и легких. В начале несколько слов о структуре и функции легких.
Легкие представляют собой сложный и очень важный орган, в котором
& •
различают альвеолярную паренхиму, разветвленную систему бронхиального дерева и кровеносных сосудов, богатую сеть лимфатических сосудов, нервные волокна, окончания и ганглии, относящиеся как к симпатической, так и к парасимпатической системе, соединительную ткань (А.И. Струков, ч* И.М. Кодолова, 1970; Г.Б. Федосеев с соавт., 1984; А.Г. Чучалин, 2004).
. Специфической и наиболее важной функцией легких является внешний
газообмен. Легкие обеспечивают постоянство состава крови, выполняя фильтрирующую функцию, роль стабилизатора системы свертывания крови, поддерживают постоянство состава некоторых форменных элементов крови и активно регулируют наполнение камер левого отдела сердца, выравнивая объем притока крови по венам и сердечного выброса. Установлено влияние
« органа на жировой, белковый, углеводный, водно-минеральный обмены.
Легкие животных и человека принимают участие в поддержании температуры тела, в частности в регуляции влагоотдачи испарением с поверхности слизистой оболочки воздухоносных путей (И.К. Есипова, 1975; Н.В. Сыромятникова с соавт., 1987; СВ. Ширинкин, 2003).
Система органов дыхания осуществляет постоянное приспособление
fc организма животных и человека к изменяющимся условиям внешней среды,
что обусловило выработку в процессе эволюции сложного комплекса защитно-приспособительных механизмов. Условно они подразделяются на три линии защиты. Первая из них состоит из мукоцилиарного аппарата и
13
секрета слизистой оболочки. Мукоцилиарный аппарат выполняет механическую очистку бронхиального дерева, а секреты содержат факторы специфической (иммуноглобулины различных классов) и неспецифической (лизоцим, интерферон, комплемент, лизосомальные ферменты и др.) защиты. Нейтрофилы и макрофаги представляют клеточный компонент этой первой линии (О.В. Крячко, 1999).
Вторая линия защиты — эпителиальные клетки, выполняющие чисто механическую роль, а также они поглощают крупномолекулярные белки. Известны три вида альвеолярных эпителиальных клеток. Наиболее популярны у исследователей - альвеолоциты 2 типа, которые покрывают всего 3 % поверхности альвеол. Эти клетки богаты органеллами и в них выявляется активность ряда ферментов. Показана высокая активность маркеров цикла трикарбоновых кислот, аэробного и анаэробного гликолиза, ,, пентозофосфатного шунта и челночного механизма. Кроме активности
окислительно-восстановительных ферментов, в них выявлена активность неспецифических эстераз, относительно высокая активность щелочной фосфатазы, низкая активность кислой фосфатазы (В.В. Ерохин, 1996).
Альвеолоциты 1 типа покрывают более 90 % альвеолярной поверхности. Эти клетки имеют относительно слабо развитую систему органелл и микровезикулярные образования, локализованные преимущественно у апикальной и базальной плазмолеммы. У альвеолоцитов 1 типа выявлена низкая метаболическая активность (А.И. Пахмутов, 2000).
Описание эпителиального компонента было бы неполным, если не упомянуть об альвеолоцитах 3 типа. Эти клетки имеют щеточную каемку на поверхности, которые располагаются по две-три или большими комплексами. Они характеризуются развитой ультраструктурой, \$ отличительной чертой являются микрофибриллы и микротрубочки, сложное
строение эндоплазматической сети.
Третью линию защиты составляет базальная мембрана, где проявляют свои основные функции макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки,
14
взаимодействующие с Т- и В-лимфоцитами, которые секретируют иммуноглобулин A (Ig А). Цитоплазматические отростки альвеолярных макрофагов (AM) располагаются на поверхности альвеолярных клеток. Непосредственный контакт макрофагов с матриксом и другими элементами соединительной ткани определяет их особенности, благодаря чему эти клетки могут участвовать в процессе фагоцитоза. Фагоцитоз сопровождается изменением метаболического статуса AM (O.B. Крячко, 1999).
Для обеспечения клеток и тканей организма кислородом легкие пропускают большие объемы газа. Этот процесс обеспечивается огромной альвеолярной поверхностью. Для эффективности транспорта газов каждая альвеола ограничена тонкой стенкой с кровеносными капиллярами внутри, которая должна не только противостоять давлению вдыхаемого объема воздуха, но и обладать совершенной системой защиты от проникновения в легкие различных веществ и бактерий, препятствовать транссудации жидкости из капилляров. Многие из этих функций в настоящее время связывают с присутствием в альвеолах внеклеточного слоя поверхностно активного вещества - сурфактанта, расположенного на границе раздела фаз воздух-жидкость (В.В.Ерохин, 1996; О.В. Крячко, 1999).
Активное изучение сурфактанта легких началось около 40 лет назад и проводилось на разных биологических уровнях с использованием ткани легкого, бронхоальвеолярных смывов, поверхностно-активной фракции, получаемой методом дифференцированного центрифугирования, и конденсата выдыхаемого воздуха (СВ. Бестужева, 1995; Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000).
Сурфактант легочной ткани обладает более высокой поверхностной активностью по сравнению с другими биологически активными веществами организма и, снижая поверхностное натяжение в интерфазе, вода-воздух практически до нуля, обеспечивает растяжимость и эластичность легкого, улучшает транспорт кислорода через аэрогематический барьер, предупреждает спадание альвеол на выдохе (В.П. Верболович с соавт., 1985).
15
По своему химическому составу и строению сурфактант легких напоминает клеточные мембраны, так как имеет липидную природу и состоит из двух различных фаз. Первая фаза представляет собой мономолекулярный слой фосфолипидов в виде тонкой осмиофильной мембраны толщиной 8-10 нм, а также решетчатых мембранных образований, называемых «тубулярным миелином». Решетчатые и мембранные образования сурфактанта обычно располагаются в гипофазе, или второй фазе, представляющей собой жидкий выстилающий комплекс, состоящий из молекул полисахаридов, липопротеинов и липидов (И.К. Есипова, 1975; В.В. Ерохин, 1987, 1996; СВ. Бестужева, 1995). Большая часть протеинов сурфактанта характеризуется высокой молекулярной массой. Обнаружено, что липидные и протеиновые фракции находятся в относительно постоянной пропорции.
Сурфактант может перемещаться, «дрейфовать» вместе с жидкой гипофазой до бронхиол, вынося из альвеол обломки разрушенных клеток. Важную роль в элиминации отработанного сурфактанта играют альвеолоциты 2 типа, которые реутилизируют часть секретируемого ими сурфактанта (В.В. Ерохин, 1996). По крайней мере, 50% тотального альвеолярного клиренса «отработанного» сурфактанта обеспечивается альвеолярными макрофагами (Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000).
Ряд исследователей отмечают снижение поверхностно-активных свойств сурфактанта у людей, больных неспецифическими заболеваниями легких (Н.В. Сыромятникова с соавт., 1987; Г.Б. Федосеев, 1995; В.В. Ерохин, 1996; Е.Н. Нестеров, Г.Н. Паневская, 2000).
При бронхопневмонии животных показаны качественные и количественные изменения в сурфактантной системе легких (СМ. \# Сулейманов с соавт., 1990; N. Gross, 2001). При этом нарушаются синтез и
секреция сурфактанта альвеол оцитами 2 типа, его целостность на поверхности альвеол и механизмы его утилизации. Это усугубляет тяжесть патологического процесса в легких и способствует его прогрессированию.
16
По мнению большинства исследователей, решающим фактором в возникновении неспецифической пневмонии является снижение резистентности организма к неблагоприятным воздействиям внешней среды. Среди внешних факторов наиболее опасными являются переохлаждение, сырость, грязь, повышенная концентрация вредных газов (особенно аммиака и сероводорода). Так, переохлаждение молодого организма приводит к нарушению кровообращения, к расстройствам терморегуляции, к появлению застойных явлений в легких, что создает условия для возникновения бронхопневмонии (Н.В. Сыромятникова с соавт., 1987; A. Settler, 1998). В то же время огромное значение у телят в нарушении функции легких имеют скудное или неполноценное кормление (недостаток в рационе белка, углеводов, минеральных веществ, витаминов и воды), отсутствие прогулок, недостаток естественной ультрафиолетовой радиации, а также некоторые другие стрессовые воздействия. Например, уменьшение содержания витамина А в молоке, которым питается молодняк, способствует снижению сопротивляемости организма и появлению бронхопневмонии (Б.М. Анохин, 1980; Л. Зиновьева, 2001).
Кроме того, предрасполагает к развитию заболевания физиологическая недоразвитость животных. У таких животных в бронхах отсутствуют реснички мерцательного эпителия, бокаловидные клетки, бронхиальные железы недоразвиты, что обуславливает крайне слабые защитные дренажно-очистительные функции бронхов. Это способствует беспрепятственному проникновению инфекционного агента в глубокие отделы дыхательной системы (П.Н. Кориков, 1974). У телят — гипотрофиков недостаточное развитие дыхательного центра не обеспечивает активную вентиляцию дыхательных путей. Это ведет к появлению ателектазов и способствует \i> преодолению защитных барьеров организма условно патогенными
бактериями. Установлено, что у животных, родившихся с массой менее 25-27 кг (гипотрофики) патология органов дыхания регистрируется в 1,5-2 раза чаще, чем у телят - нормотрофиков. У 75-80 % таких телят также отмечены
17
признаки гиповитаминозов А и С и в возрасте 15-20 дней у них возникают симптомы воспаления легких (Р.П. Пушкарев, Я.Н. Глухов, 1991; Г.А. Пахомов, 2003).
По мнению некоторых исследователей предпосылкой развития бронхопневмонии являются анатомоморфологические особенности молодняка: короткая трахея и узкие бронхи, богатство кровеносными сосудами слизистой оболочки, выстилающей дыхательные пути, слабость эластичной ткани стенок альвеол. Бронхи и альвеолы новорожденных и молодых животных легко закупориваются слизью, так как эластичная ткань легких развита недостаточно. Кроме того, слизистая оболочка бронхиол лишена мерцательного эпителия. Через нее возбудители могут свободно проникать в альвеолы и вызывать воспаление с образованием серозного или фибринозного экссудата (М.А. Сидоров, 1989; Л. Зиновьева, 2001; Р. Reinhold, 1997).
Показано, что в носовой полости нормально развитого молодняка значительно чаще формируется постоянное носительство сапрофитной микрофлоры по сравнению со слаборазвитыми животными, и реже -патогенных и условно - патогенных микроорганизмов. При изучении формирования носительства установлено, что микрофлора поселяется на слизистых оболочках животных в первые часы жизни, независимо от их физиологического развития (В.В. Палунина, 2004; I. F. Porter et al., 2000).
Для возникновения бронхопневмонии важно не только снижение резистентности молодого организма, но и достаточно высокая вирулентность этиопатогенетической микрофлоры (Р.В. Душук, 1982; СВ. Ширинкин, 2003; N.W. Dyer, A.C.S. Ward, 1998). Микрофлора может быть представлена как экзогенной — проникающей в легкие с воздухом из внешней среды, так и эндогенной - в виде аутоинфекции, связанной с ассоциациями микробов, обитающих на слизистых оболочках дыхательных путей и в кишечнике животного (пневмококки, стрепто- и стафилококки, пастереллы, сарцины, микоплазмы и др.). Общее количество микроорганизмов, выделенных из |
