ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Наиболее интересными и до настоящего времени малоизученными как в экологии, так и микробиологии являются проблемы, связанные с воздействием высших растений на окружающих их членов биоценоза. Поскольку растения не способны перемещаться в пространстве, то они должны обеспечить оптимальные условия для своего существования на одном месте: должны обладать способностью защищаться, привлекать необходимых для их жизнедеятельности организмы, ликвидировать конкурентов, активизировать и регулировать некоторые процессы метаболизма с помощью других организмов, обитающих в почве.
Под корневыми выделениями понимают выделения из живых и неповрежденных корней растений (Vancura V., 1972; Гродзинский A.M., 1991; Наумов Г.Ф., 1995; Minggang L., 1997; Головко Э.А. и др., 1999). В их состав входят разнообразные соединения: сахара (в основном моно-, дисахариды и олигоса-хариды), аминокислоты, пептиды, ферменты, витамины, органические кислоты, спирты, алкалоиды, глюкозиды, полифенолы, фитогормоны, углекислота, а также другие минеральные вещества. Микрофлора использует многие из них как источники питания, поэтому их концентрация на поверхности корней снижается, что изменяет условия корневого питания растений (Головко Э.А., 1984).
Метаболиты могут оказывать влияние на другие организмы, в том числе и на почвенную микрофлору, в виде ингибирования и токсического действия, в виде селекционирующего действия, в виде агентов, стимулирующих рост и развитие компонентов ризопланы и ризосферы (например, микоризообразующих грибов), в виде индукторов морфогенеза у грибов и прокариот и др. Метаболиты корневой системы растений имеют основополагающее значение в формировании микробных комплексов ризосферы (Широких И.Г., 2003).
Большинство из этих функций растения выполняют с помощью корневых выделений. В настоящее время известны три основных типа азотфикси-рующих симбиозов микроорганизмов с растениями: симбиоз цианобактерий с
ловиях; 2) изучение динамики содержания веществ в корневых выделениях облепихи, инокулированной различными штаммами актиномицетов рода Frankia; 3) изучение биометрических показателей растений облепихи в процессе эксперимента; 4) определение влияния корневых выделений облепихи на различные группы микроорганизмов с целью формирования симбиотических отношений лежду макро- и микросимбионтом.
Научная новизна. Автором впервые разработана и использована методика выращивания древесных растений в стерильных условиях и установлен химический состав корневых выделений стерильно выращенных растений облепихи, а также показана динамика содержания и биологическая активность некоторых из этих веществ в течение шести недель эксперимента (после инокуляции акти-номицетами рода Frankia). Получены новые данные, позволяющие установить основы химического контакта макро- и микросимбионтов. Проведены уникальные исследования по изучению избирательности действия различных химических компонентов корневых выделений облепихи на различные виды микроорганизмов. Впервые проведено исследование по избирательности влияния веществ корневых выделений облепихи на различные таксономические группы микроорганизмов.
Теоретическое значение работы. Материалы, отраженные в диссертации, могут быть использованы для развития представлений о механизме формирования симбиотических отношений в природе, в частности, между небобовыми древесными растениями и актиномицетами рода Frankia. Результаты диссертационной работы позволяют объяснить возможность высокоспецифического отбора необходимых для роста и развития растений микроорганизмов с помощью химических веществ корневых выделений.
Практическая значимость работы. Материалы диссертации, сформулированные в ней научные положения и выводы, показывают, что корневые выделения облепихи обладают бактериостатическим воздействием на ряд патогенных микроорганизмов и, следовательно, их можно использовать при разработке новых нехимических (биологических) средств в качестве фитодобавок в
голосеменными, ризобий с бобовыми и симбиоз актиномицетов с небобовыми покрытосеменными растениями. Однако в литературе имеется весьма ограниченная и разрозненная информация о возможных механизмах установления симбиотических отношений между древесными небобовыми актиноризными растениями и микросимбионтами.
Актиноризные азотфиксирующие растения могут быть использованы в народном хозяйстве при рекультивации и мелиорации земель, создании лесозащитных полос, в пищевой промышленности и медицине. К таким растениям относятся многолетние древесные и кустарниковые растения (облепиха, лох, ольха), образующие азотфиксирующие клубеньки в симбиозе с актиномицета-ми рода Frankia. При этом актиноризные растения увеличивают содержание азота и активируют его круговорот в почве. Клубеньковые микроорганизмы могут проявлять антагонистический эффект против многих патогенных бактерий и грибов. Значительную роль в описанном выше процессе играют/корневые выделения растений. Следует отметить, однако, что практически ничего не известно о тех химических веществах, которые выделяются растениями в почву и способствуют установлению контактов макросимбионта с микросимбионтом. Кроме того, необходимо четко представлять, существует ли у растений видовая специфичность по отношению к различным видам и штаммам актиномицетов, а также - могут ли растения (благодаря химическому составу корневых выделений) избирательно ингибировать рост и развитие одних почвенных микроорганизмов (в том числе и патогенных), и активировать рост и развитие других (например, актиномицетов).
Все вышесказанно^ и обусловливает безусловную актуальность настоящей работы.
Цель и задачи исследований. Цель работы — разработка технологии получения корневых выделений стерильно выращенной облепихи и изучение их воздействия на различные таксономические группы микроорганизмов. В задачи исследований входило: 1) получение и установление спектра биологически активных веществ корневых выделений облепихи, выращенной в стерильных ус-
медикаментозные средства и применяться в ветеринарной практике для лечения животных.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В корневых выделениях облепихи выявлены органические вещества (фенольные соединения и фитогормоны), которые во многом определяют характер взаимодействия между макро- и микросимбионтом, а также способствуют образованию симбиотических клубеньков на корнях облепихи.
2. Вещества фенольной природы и фитогормоны, выделенные из корневых выделений облепихи, стимулируют рост и развитие актиномицетов рода Frankia и угнетают рост и развитие других изученных в эксперименте микроорганизмов.
3. Изученный сильноинфицирующий штамм актиномицетов способствует более сильной экспрессии биологически активных веществ облепихой.
ш ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РАСТЕНИЙ С
ПОЧВЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ (Обзор литературы)
1.1. Корневые выделения растений и их биологическая роль
Одной из основных проблем современной биологии и, в частности, экологии, является изучение факторов и механизмов, регулирующих формирование структуры экосистем, их функционирование и динамику. Химические метаболиты и биохимические процессы, в которые они вовлечены и результатом которых являются, играют основополагающую роль в опосредовании и регуляции межорганизменных отношений.
Любой живой организм, являясь открытой системой, способен обмениваться с окружающей его средой, в том числе и с другими живыми организмами, веществом, энергией и информацией. В целом, взаимодействия между живыми организмами (членами биоценозов) можно разделить на два основных
* типа: 1) взаимодействия, основанные на использовании живыми организмами веществ, служащих источниками энергии для них, или выполняющих роль строительных компонентов, без которых невозможен рост и развитие любого организма; 2) взаимодействия с участием молекул, обеспечивающих регуляцию отношений членов биоценоза, или обеспечивающих передачу информации от одного организма к другому.
Биохимические взаимодействия в биоценозе весьма разнообразны. Это
• объясняется различиями физиолого-биохимических процессов, лежащих в основе функционирования представителей различных царств живых организмов, а также той средой обитания, экологическими нишами, которые занимают эти организмы. Вещества, продуцируемые организмами, могут служить в качестве аттрактантов, факторов защиты и атаки, для регуляции взаимодействий внутри популяции или внутри биоценоза, для сдерживания конкурентов, за те или иные ресурсы, а, порой, одно и тоже вещество может выполнять различные функции в зависимости от микроокружения данного организма.
В выделениях растений имеются компоненты, которые позволяют этим организмам выполнять разнообразные функции: 1) подвижные, которыми растения обмениваются с окружающей средой; 2) балластные, от которых растения освобождаются; 3) привлекающие полезных и отпугивающие вредных для растений организмов; 4) вещества, полученные от симбионтов (Головко Э.А., 1997). Из корней в почву выделяются разнообразные органические вещества, благодаря широкому спектру которых растения способствуют круговороту физиологически активных соединений в фитоценозах и в биоценозах в целом.
Выделение органических веществ в почву является активным физиологическим процессом. Некоторые вещества определяют аллелопатические отношения в фитоценозах, другие - играют важную роль во взаимодействиях растений с почвенной микрофлорой, в том числе и с микроорганизмами, способными вступать в симбиотические отношения с макросимбионтом.
Положительное влияние корневых выделений на микрофлору получило название ризосферного эффекта. Наряду с этим установлено и противоположное явление — ризосферный "антиэффект11, заключающийся в том, что корневые выделения угнетают или убивают некоторые существующие в среде микроорганизмы и тем самым формируют вокруг себя новый состав микрофлоры (Гродзинский A.M., 1991).
Взаимодействие корневых выделений с микрофлорой почвы очень сложно и неоднозначно. Корни растений, растущих в природных условиях, окружены определенными популяциями бактерий, грибов, актиномицетов, среди которых могут быть и симбиотрофные виды.
Взаимоотношение ризосферного растения с клубеньковыми бактериями начинается намного раньше, чем происходит непосредственный контакт между ними и осуществляется оно посредством химических веществ, источником которых могут быть корневые выделения, негумифицированное органическое вещество, продукты жизнедеятельности микроорганизмов (Головко Э.А., 1984). Наиболее подвижными фракциями негумицированного органического вещества являются углеводы, белки, низкомолекулярные органические кислоты и биоло-
10
гически активные вещества, такие как фенольные соединения, витамины, алкалоиды, гликозиды и фитогормоны. Эти соединения легко усваиваются почвенной микрофлорой и, в основном, сосредотачиваются в корнеобитаемом слое, т.е. в зоне его ризосферы.
Показано, что за счет продуктов минерализации пожнивно-корневых остатков люпина и его корневых выделений повышается биологическая активность почвы (Головко Э.А., 1997). Корневые выделения менее активны по сравнению с выделениями листьев и стеблей растений (Головко Э.А., 1997; Головко Э.А., 1999). В целом объем корневых выделений высших растений составляет 8-25% фотосинтетической продуктивности растений (Головко Э.А., 1999).
Наибольший интерес представляют вещества фенольной природы, которые принимают участие в важнейших физиолого-биохимических процессах. Они тесно связаны с процессами роста и развития. По мнению Л.В. Рункова (1980) содержание фенольных веществ в растении, их распределение по отдельным органам может указывать на интенсивность протекающих в них процессов роста, степень онтогенетического развития, старения тканей. Известно, что вещества именно этой группы, синтезируемые высшими растениями, являются наиболее распространенными токсинами (Горобец С.А. и др., 1982), обладают физиологической активностью и могут выступать активаторами или ингибиторами многих обменных процессов (Пшеничная Л.А. и др., 2000).
По данным И.М. Лиморовой и др. (2000) защитный эффект фенольных соединений, синтезируемых растениями против бактериальной инфекции, по-видимому, реализуется через ингибирование факторов вирулентности патогенов.
Некоторые растительные флавоноиды являются хемоэффекторами для клубеньковых бактерий, активными в очень низких концентрациях. Так, геспе-ридин и кверцетин задерживали, а в некоторых вариантах подавляли рост клубеньковых бактерий гороха со слабо выраженной пектиназной активностью и
И
стимулировали рост ризобий с высокой пектиназной активностью (Антипчук А.Ф., 1997).
Фенольные соединения корневых выделений растений могут выступать также в роли индукторов (сигнальных веществ) во взаимосвязях растения и микроорганизма (Запрометов М.Н.,1993). Установлено, что соединения фе-нольной природы являются активирующим компонентом экссудата корня и обладают способностью экспрессировать гены, необходимые для осуществления последовательных стадий взаимодействия растения-хозяина с микросимбионтом (Hartwig U.А., 1991; Penarie J., 1993; Hopper W., 1995). Подобная функция флавоноидов описана для бактерий Risobium, имеющих nod-гены, ответственные за процессы формирования клубеньков на корнях растения-хозяина и экс-прессируемые веществами фенольной природы (Запрометов М.Н., 1993; Макарова Л.Е., 1999).
Фенольные соединения обнаружены в прижизненных корневых выделениях высших растений и значительное количество их поступает в субстрат с корневыми и послеуборочными остатками.
Многие фенольные вещества, идентифицированные в растениях, накапливаются в почве под ними в довольно значительных количествах. Даже связываясь с почвой, они сохраняют свою биологическую активность (Райе Э., 1978).
Кроме того, при выращивании растений в нестерильных условиях источником фенольных соединений могут служить метаболиты микроорганизмов. Микроорганизмы также способны превращать некоторые неактивные продукты жизнедеятельности высших растений в соединения, которые оказывают инги-бирующее действие на растения (Boner H., 1960).
В корневых выделениях растений обнаружены органические кислоты, которые кроме токсинов, ингибиторов и ферментов играют немалую роль в защите растений от различных организмов, в частности, грибов и микроорганизмов. Поскольку органические кислоты изменяют рН среды, то в результате сдвига рН в область, где токсичность грибов понижается, растения уменьшают
12
эффективность воздействия этих токсинов на корневую систему и все растение в целом.
Обнаруженные в корневых выделениях белки и вещества пептидной природы, в частности, ферменты, могут выступать в роли химических модификаторов токсичных для растений веществ, выделяемые патогенными для растений микроорганизмами или грибами. Некоторые ферменты наоборот — способны изменять вещества, находящиеся в почве таким образом, что они становятся весьма полезными для растений и микросимбионтов. Среди экскретируемых ферментов есть такие, которые катализируют перекисное окисление липидов в почве. В результате этого процесса образуется активная форма кислорода, являющаяся токсичной для некоторых микроорганизмов, окружающих растения.
Фитогормоны, обнаруженные в корневых выделениях высших растений, по-видимому, могут в какой-то степени принимать участие в конкурентных отношениях данного растения с другими членами фито- и биоценоза. Выделенные растением фитогормоны являются экзогенными регуляторами роста других растений. Известно, что вещества с физиологической активностью фитогормо-нов (например, гиббереллинов) обнаружены среди продуктов жизнедеятельности разнообразных почвенных обитателей (водорослей, актиномицетов, бактерий) (Муромцев Г.С. и др., 1984). Однако в литературе практически нет данных о влиянии экскретируемых растением фитогормонов на рост и развитие почвенных микроорганизмов.
Роль гиббереллиноподобных веществ, активно синтезируемых клубеньковыми бактериями, во взаимоотношениях с бобовыми растениями мало изучена. С.А. Варфоломеев (1992) отмечает, что гиббереллин снижает степень образования клубеньков, что вызвано его действием на растение-хозяина. Показано, что содержание гиббереллинов в клубеньках бобовых растений на несколько порядков выше, чем в корнях. Обнаружено также, что в листьях и корнях инокулированных растений содержание гиббереллиноподобных веществ и активность их выше по сравнению с неинокулированными.
13
Накопление гиббереллиноподобных веществ в тканях растений связывают с регуляцией скорости деления, роста и развития клеток. Гиббереллин специфически повышает в тканях активность гидролаз, способствует высвобождению ИУК из связанных форм (Полевой В.В., 1982).
Не исключено, что некоторые химические вещества могут нести несколько экологических функций.
Вещества, выделяемые растениями в почву в составе корневых выделений, могут играть важную роль в регуляции направления потока энергии через экосистему, где происходит разделение энергетического потока на пастбищную и детритную трофическую цепи. Та часть растительной биомассы, которая окажется доступной для редуцентов (грибов, бактерий) и усвоенной ими, идет по детритной трофической цепи. Та часть растений, которые окажутся недоступными (в значительной мере благодаря химическим средствам защиты растений) для бактерий и грибов, наоборот, становятся потенциальным энергетическим ресурсом для консументов 1-го порядка и может использоваться далее для пастбищной трофической цепи.
Важную роль в направлении энергии по пастбищно-трофическом направлении играют симбиотические отношения, возникающие между макро- и микросимбионтами. Растение, получающее больше азота за счет симбиоза с микросимбионтом, обладает повышенной устойчивостью к действию патогенных для него грибов и микроорганизмов.
В заключение следует сказать, что взаимоотношения клубеньковых бактерий с растением-хозяином происходит на различных стадиях развития макросимбионта. На формирование эффективного симбиоза влияет биохимическая среда вокруг корней растения. Некоторые биологически активные вещества (ферменты, сахара, органические кислоты и др.), выделяемые растением, способны стимулировать размножение клубеньковых бактерий, повышать их активность и вирулентность. Однако, известен и ингибирующий эффект некоторых веществ (например, некоторых веществ фенольной природы) на ризобии растений.
14
Хемотаксис в значительной степени определяет способность микросимбионтов адсорбироваться корнями растения (этап непосредственного взаимодействия партнеров (Баканчикова Т.И. и др., 1989). На первых этапах растительно-микробного взаимодействия вещества, выделяемые корнями растений (органические кислоты, сахара и др.) выполняют роль хемоэффекторов, то на последующих они могут использоваться микроорганизмами как субстраты для процессов роста.
1.2. Симбиотические отношения между макро- и микросимбионтами
Известно, что корневые системы многих древесных растений вступают в тесную взаимосвязь с мицелием некоторых высших грибов, образуя микоризу. Между растением-хозяином и бактериями-симбионтами происходит обмен разнообразными химическими соединениями — продуктами обмена веществ. Микробы при этом получают питание (главным образом, сахара) и энергию для собственной жизнедеятельности, отдавая взамен растению азотные соединения и физиологически активные вещества, стимулирующие его рост и развитие.
Рост-стимулирующие ризобактерии - универсальные симбионты высших растений, повышающие адаптивный потенциал своих хозяев за счет механизмов фиксации молекулярного азота, мобилизации труднодоступных питательных веществ почвы, защиты корней от патогенов, синтеза фитогормонов и витаминов (Lugtenberg B.J.j., 1991;Weller D.M.,1994).
Среди этих эффектов наиболее изучена способность рост-стимулирующих бактерий ингибировать развитие почвенных патогенов, связанная с синтезом антифунгальных метаболитов, конкуренцией за питательные субстраты и поверхность корней, а также с индукцией защитных систем растений (Кравченко Л.В. и др., 2002).
Почвенные микроорганизмы стимулируют выделение органических веществ корней, т.е. влияют на выделительную функцию растений; при этом усиливается метаболизм корней; микроорганизмы нейтрализуют вещества, входя-
15
щие в состав корневых выделений и выделяют биологически активные вещества, являющиеся уже продуктами жизнедеятельности микроорганизмов.
Одним из важных свойств микроорганизмов является их способность к таксису, благодаря чему они находят специфические экологические ниши обитания - микрониши (Родынюк И.С. и др., 1982). Своеобразной нишей обитания клубеньковых бактерий является корень ризосферного растения. Различают три зоны активного взаимодействия микроорганизмов с корнем растения (Головко Э.А., 1984) — корневая, прикорневая и зона ризосферы.
Хемотаксис клубеньковых бактерий к корневым выделениям растения является, пожалуй, одним из первых этапов взаимодействия симбионтов, осуществляемого ими на доконтактном уровне (Armitage J.P., 1997; Vande Broek A., 1998; Legtenberg B.J.j., 1999). В тоже время происходит распознавание потенциальных симбионтов в форме обмена специфическими сигнальными молекулами, которые присутствуют в выделениях корней.
Результатом обмена специфическими сигналами между партнерами является биохимические, морфологические, физиологические изменения в ответной реакции каждого из симбионтов, направленные на подчинение членов межвидового сообщества функционированию его как единого организма.
Указывая на роль хемотаксиса в распознавании бактериями растений-хозяев, считают, что таксисная реакция бывает двух типов: 1) таксис бактерий к простым молекулам (сахарам, органическим кислотам, аминокислотам), следствием которого является неспецифическое привлечение широкого круга микроорганизмов в ризосферу корня; 2) таксис к более крупным молекулам, выделяемым растительной тканью (флаванам, гормонам, ферментам и др.), осуществляемый в пределах самой ризосферы, в основе которого лежит обмен специфическими сигналами между микро- и макросимбионтом (Баканчикова Т.И. и др., 1989).
Биологическая фиксация атмосферного азота небобовыми растениями может иметь большое экономическое значение как потенциальный источник азота для сельского хозяйства.
16
За последнее десятилетие установлено существование гораздо большего, чем предполагалось ранее, числа семейств растений, вступающих в эндогенный и экзогенный симбиоз с почвенными азотфиксирующими микроорганизмами. Определена способность к усвоению атмосферного азота в ризосфере производственно ценных сельскохозяйственных растений, обладающих значительной нитрогеназной активностью в зоне корней (Калининская Т.А. и др., 1975). По данным О.А. Берестецкого (1986) азотфиксирующая способность отмечена в ризосфере риса, величина которой в 10 раз ниже по сравнению с азотфикси-рующей активностью бобовых растений. Связывание азота атмосферы происходит в результате жизнедеятельности микроорганизмов, обитающих в почве ризосферы, населяющих поверхность и внутренние сферы корней, стеблей, листьев и использующих в качестве энергетического материала углеродные соединения, которые образуются растениями в процессе фотосинтеза.
Азотфиксирующие бактерии обнаружены в ризосфере риса, тропических трав, сахарного тростника, кукурузы, пшеницы, овсяницы, полевицы (Бе-рестецкий О.А. и др., 1986).
Наиболее хорошо изученными являются взаимоотношения бобовых растений и клубеньковых бактерий.
Бобовые растения, благодаря симбиозу, т.е. взаимовыгодному сожительству с азотфиксирующими бактериями рода Rhizobium, обогащают почву азотными соединениями за счет фиксации атмосферного азота. А. Хелльригель в 1886 году объяснил подобную способность бобовых растений наличием на их корнях клубеньков, развитие которых вызывается микроорганизмами. Вывод немецкого ученого был подтвержден через несколько лет, когда голландскому бактериологу Мартину Бейеринку удалось выделить азотфиксирующий микроорганизм из клубеньков в чистой культуре. В дальнейшем была показана способность ризобий инфицировать корни бобовых и вызывать образование на них клубеньков, в которых собственно и протекает азотфиксация.
Бобово-ризобиальная система — межвидовое сообщество, образуемое высшими растениями (бобовыми) и микроорганизмами (клубеньковыми бакте-
17
риями) (Brewin N.J., 1991; Hirsch A.M., 1992). В симбиотическом сообществе бактерии фиксируют азот атмосферы и передают его растению в доступной для него форме, а сами получают защиту от неблагополучных условий окружающей среды (клубенек — растительное образование, содержащее бактерии) и источник питания (поступающие в клубенек ассимиляты растения) (Кретович В.А., 1994).
Формирование азотфиксирующего клубенька на корне бобового растения представляет сложный многоэтапный процесс, в результате которого происходят глубокие структурные, физиологические, биохимические перестройки симбионтов (Spaink H.P., 1995; Литинская Т.К., 1996).
Некоторые авторы связывают успешное протекание процессов прикрепления бактерий к корням растений наличием комплементарно соответствующих друг другу поверхностно локализованных структур партнеров (Семак Н.Н., 1986; Haegi A., 1991; Егоренкова И.В., 2000). Выделяют следующие этапы образования клубенька: хемотаксис, индукция экспрессии nod-генов клубеньковых бактерий и выделение nod-фактора, скручивание корневых волосков, образование инфекционных нитей, деление клеток коры корня, морфогенез клубенька, проникновение бактерий в клетки растения с последующим их преобразованием в бактероиды, функционирование зрелого клубенька (Long S.R., 1987; Verma D.P.S., 1992; Hirsh A.M., 1992).
Клубеньки начинают образовываться на корнях после появления первых листьев, т.е. когда начинается фотосинтетическая деятельность растения. Наиболее интенсивно симбиотические клубеньки формируются в период активного роста и развития растения, когда формируется и начинает функционировать большая часть листьев. Листья являются одним из решающих факторов в процессе образования клубеньков, их развития и жизнедеятельности, поскольку они дают энергетический материал (глюкозу и другие органические вещества), необходимый как растению, так и микроорганизмам (Кириченко Е.В., 2002).
Предпосылкой образования симбиотической системы бобовых растений является присутствие в ризосфере корня свободноживущих клубеньковых бак- |
