Введение
Актуальность исследований. Метод абсорбционного спектрального анализа широко используется в науке и технике. Преимуществами данного метода являются оперативность, высокая воспроизводимость, малый объем пробы, неинвазивность, возможность реализации мониторинга состава среды в проточном режиме, сравнительно невысокая стоимость используемой аппаратуры, отсутствие необходимости в использовании реактивов, низкая трудоемкость и возможность автоматизации. Особое место спектральные методы анализа занимают в биомедицинских исследованиях, где в более чем 30% аналитических методик используется оптическая регистрация. Отметим лишь несколько основных направлений этих исследований - контроль экологического состояния среды обитания человека, клинико-лабораторные биохимические исследования нативных жидких биологических сред (ЖБС) организма, мониторинг процессов при проведении эфферентной терапии, фармакологические исследования, контроль качества пищевых продуктов.
Наиболее информативной для спектрального анализа ЖБС является ультрафиолетовая (УФ) область, где, с одной стороны, лежат электронные полосы поглощения многих хромофорных групп, а с другой, располагается «окно прозрачности» воды, которая является растворителем во всех жидких средах естественного происхождения. Современные УФ спектрофотометры построены на основе многоэлементных приемников излучения, полностью автоматизированы, передают спектры непосредственно на компьютер, что дает возможность проводить анализ в реальном масштабе времени.
Количественный абсорбционный анализ базируется на законе Бугера-Ламберта-Бера, устанавливающем линейную зависимость спектрального показателя поглощения однородной среды от концентрации, и принципе аддитивности, согласно которому показатель поглощения смеси равен сумме показателей поглощения отдельных компонентов. Многими исследователями показано, что закон Бера и принцип аддитивности соблюдаются лишь для
6
слабоконцентрированных сред. Кроме того, обычно анализ проводится на одной или нескольких дискретных длинах волн, как правило, соответствующих максимумам характеристических полос поглощения компонентов среды, в то время как информация о составе ЖБС рассредоточена в широком спектральном интервале. Поэтому, применение классического абсорбционного спектрального анализа для исследования ЖБС и жидких лекарственных форм, когда концентрация может изменяться в широких пределах, в случае однокомпонентных сред приводит к значительным погрешностям, а для поликомпонентных сред практически исключено.
Цель настоящей работы - разработка и исследование методов спектрального анализа ЖБС и их компонентов в УФ области спектра, снимающих ряд ограничений классической абсорбционной спектрофотометрии применительно к поликомпонентным средам.
Основные задачи, которые необходимо решить для достижения указанной цели включают в себя следующее:
построение математической модели, описывающей зависимость спектральных характеристик поглощения ЖБС в УФ области спектра от концентрации компонентов;
разработка методики определения параметров модели для конкретной ЖБС и расчета концентрации компонентов по спектру;
оценка эффективности модели применительно к анализу однокомпонентных биологических сред в широком диапазоне концентраций;
экспериментальное исследование разработанных моделей для анализа поликомпонентных сред - перитонеального диализата больных, страдающих хронической почечной недостаточностью (ХПН), и поликомпонентных жидких лекарственных сред.
Методы исследований.
Для решения поставленных задач использовались методы абсорбционного спектрального анализа по электронным спектрам поглощения, аналити-
7
ческие методы аппроксимации функций многих переменных, методы оптимизации, статистические методы оценки степени достоверности результатов.
Научная новизна работы состоит в следующем:
Сформулирована математическая модель, описывающая спектральные характеристики поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области при изменении концентрации в широких пределах.
Разработана новая методика анализа однокомпонентных сред с учетом нелинейной зависимости показателя поглощения от концентрации в пределах информативной области спектра.
Разработан метод спектрофотометрического определения концентрации доминирующего компонента в поликомпонентных средах.
Впервые обнаружены индивидуальные особенности УФ спектров экс-тинкции перитонеального диализата больных страдающих ХПН, и предложена методика классификации спектров диализата по форме кривой пропускания.
Практическая значимость работы заключается в следующем:
Разработанная методика может быть использована в клинико-биохимических лабораториях учреждений практического здравоохранения при анализе жидких поликомпонентных сред, а также для оперативного контроля эффективности детоксикационных мероприятий.
Результаты работы подтверждены актами внедрения Городского центра гемокоррекции г. Санкт-Петербурга и научно-исследовательской лаборатории фармакологических исследований СПб химико-фармацевтической академии.
Научные положения выносимые на защиту: - Математическая модель, описывающая спектральные характеристики
поглощения ЖБС и их компонентов в УФ области, должна учитывать
возможное несоблюдение закона Бера и принципа аддитивности путем
8
введения в разложение показателя поглощения по концентрации членов высших порядков.
- Количественный спектрофотометрический анализ ЖБС в УФ области спектра должен проводится в пределах всего информативного для исследуемой среды спектрального диапазона.
- Методика спектрального анализа, основанная на предлагаемых принципах, позволяет существенно повысить точность анализа однокомпо-нентных сред в широком диапазоне изменения концентрации, а также дает возможность проводить анализ сложных поликомпонентных сред по доминирующему компоненту.
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях:
- Вторая международная конференция молодых ученых и специалистов "Оптика-2001", Санкт-Петербург, 2001.
- Международный оптический конгресс «Оптика-XXI век», Санкт-Петербург, 2002.
- VIII Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная информатика-2002», Санкт-Петербург, 2002.
- IX Санкт-Петербургская международная конференция «Региональная информатика-2004», Санкт-Петербург, 2004.
- VI Международная конференция «Прикладная оптика», Санкт-Петербург, 2004.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них - 2 статьи, тезисы к 7-ми докладам на международных и национальных научно-технических конференциях.
9 Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, включающего 73 наименования и одного приложения. Основная часть работы изложена на 109 страницах машинописного текста. Работа содержит 68 рисунков и 21 таблицу.
10
1. Современные методы анализа жидких биологических сред
Жидкие биологические среды: плазма крови, цереброспинальная жидкость, лимфа, тканевая жидкость, моча, слюна играют исключительно важную роль в работе человеческого организма, выполняя целый ряд функций: транспорт веществ к органам и тканям, поддержание гомеостаза, осуществление иммунного ответа и т.д. При различных патологических состояниях неизбежно происходят те или иные изменения состава одной или нескольких биологических жидкостей, которые часто являются единственными специфическими симптомами многих заболеваний. В связи с этим клинико-лабораторный анализ является обязательной составляющей диагностического процесса.
В настоящее время насчитывается несколько тысяч методов анализа ЖБС, в ходе которых определяется концентрация более ста веществ. Среди прочих, важное место занимают методы анализа ЖБС основанные на количественном УФ абсорбционном спектральном анализе (УФ спектрофотомет-рии). К преимуществам таких методов можно отнести оперативность, сравнительно низкую стоимость используемой аппаратуры и возможность автоматизации, высокую точность и воспроизводимость, отсутствие необходимости в применении реактивов и т.д. Спектрофотометрический анализ также широко применяется для контроля ряда жидких лекарственных форм, в особенности препаратов растительного и животного происхождения, состав которых во многом близок к составу жидких биосред [3,18].
В то же самое время, возможности классической спектрофотометрии применительно к таким сложным поликомпонентным средам, как биологические жидкости, существенным образом ограничены: задача прямого определения концентрации по спектру решена лишь для нескольких компонентов (гемоглобина крови, белков плазмы). Проблема создания новых методов
11
спектрального анализа, расширяющих возможности классической УФ спек-трофотометрии применительно к поликомпонентным ЖБС и жидким лекарственным формам, требует изучения следующих вопросов:
^состава и спектральных характеристик поглощения в УФ области наиболее значимых ЖБС;
^существующих способов анализа ЖБС;
^математических методов обработки спектров, применяемых в количественном абсорбционном спектральном анализе;
^возможностей современной спектральной аппаратуры.
Рассмотрим их подробнее.
1.1. Краткая характеристика жидких биологических сред человека
Жидкие биосреды представляют собой сложные поликомпонентные жидкости, в состав которых входят сотни веществ, каждое из которых играет существенную роль в работе человеческого организма. К числу важнейших компонентов биосред обычно относят белки, аминокислоты, липиды, ферменты, витамины, электролиты и целый ряд других, в роли растворителя во всех ЖБС выступает вода (см. табл. 1.1).
Таблица 1.1
Важнейшие составные части плазмы крови, цереброспинальной жидкости и
мочи [36].
Составная часть Содержание в 100 мл
Плазма крови Цереброспинальная жидкость Моча
Адреналин 0.20-0.25 мг — —
Азот остаточный, 17-30 мг 12-28 мг —
Азот общий 17-30 мг — 0.8-1.5 г
12
Составная часть Содержание в 100 мл
Плазма крови Цереброспинальная жидкость Моча
Азот аминокислот 4-8 мг — —
Азот мочевины 9-17 мг — —
Алкоголь 1-5 мг — —
Белок общий 6.0-8.0 г 20-40 мг —
Альбумины 4.3 г 57% общего белка 15-25 мг —
Глобулины: 3.25 г 43% общего белка — —
а 1.13 г — —
Р 0.96 г — —
Y 1.16 г — —
Билирубин 0.2-0.8 мг 0.04-0.44 мг
Витамины: В1 4-6 мг 1.28-1.8 мг
В6 — 0-0.73 мг —
В2 3.2 мг — —
В12 292-556 мг 0.03-30 мг —
С 0.5-1.0 мг 0.3-2.1 мг —
D 1.4-4.0 мг — —
Е 0.4-1.2 мг — —
Глюкоза 80-110 мг нет 16-22 мг
Гуанидин 0.3-0.5 мг — —
Индоксил 0.026-0.086 мг — —
13
Составная часть Содержание в 100 мл
Плазма крови Цереброспинальная жидкость Моча
Инозит 0.4-0.7 мг — —
Железо 100-140 мг — —
Калий 3.2-5.2 мэкв/л 8.5-16.8 мг 150 мг
Кислоты: лимонная 1.6-2.6 мг 0.04 мг 18-39 мг
молочная 8.0-31.1 17-27 мг —
мочевая 2-5 мг — 24-60 мг
никотиновая 0.03-0.07 мг 10-50 мг —
щавелевая 0.31-6.0 мг — —
нуклеиновые 0.18-0.31 мг — —
жирные 150-450 мг 1-5 мг —
Креатин 0-0.8 мг 0.46-1.87 мг Менее 8 мг
Креатинин 1.0-2.0 мг 0.6-1.4 мг 80-125 мг
Липиды 385-700 мг — —
Натрий 130-148 мэкв/л — 350 мг
Мочевина 15-40 мг 7.4 мг 0.9-2.4 г
Полисахариды 73-131 мг — —
Протромбин 20 мг — —
Сера общая 2.5-3.5 мг — —
Фибриноген 0.25-0.5 г нет —
Фосфолипиды 110-250 мг — —
Хлориды (NaCl) 98-106 мг 308-350 мг 600 мг
14
Составная часть Содержание в 100 мл
Плазма крови Цереброспинальная жидкость Моча
Холестерин общий 150-260 мг 0.05-0.22 мг 0.03-0.08 мг
Холин общий 26-35 мг — —
Приведенные в таблице 1.1 диапазоны концентраций для каждого из компонентов соответствуют физиологической норме, при патологии они могут в значительной степени отличаться как в меньшую, так и в большую сторону. При этом необходимо заметить, что концентрации некоторых компонентов достаточно стабильны, и даже небольшие её изменения свидетельствуют о наличии того или иного заболевания, в то время как для других веществ концентрация изменяется в очень широких пределах, и патологическим считают лишь существенное (в несколько раз) отклонение от нормы.
1.2. Существующие методы клинико-биохимичесиого анализа
В настоящее время число компонентов ЖБС, определяемых в ходе рутинных биохимических исследований, составляет несколько сотен. Наиболее часто анализу подвергается кровь и моча пациентов, исследования состава других жидких биологических сред проводится значительно реже вследствие трудности получения проб, например, взятие цереброспинальной жидкости или суставного выпота требует проведения у больного опасной и болезненной пункции, или из-за отсутствия надежных методов интерпретации результатов, как при исследовании слюны [26,36,22].
Все многообразие современных методов клинико-биохимического анализа можно разделить на следующие группы [26]:
1) Хроматографические;
15
2) Радионуклеидные;
3) Электрофоретические;
4) Оптические.
Хроматографию относят к наиболее универсальным и чувствительным методам исследования ЖБС, так как она позволяет получить наиболее полную информацию о составе анализируемой среды. В силу высокой стоимости и трудоемкости, хроматографические методы используются главным образом в научных исследованиях, и лишь в исключительных случаях находят применение в клинической практике. Кроме того, будучи незаменимым методом качественного анализа, хроматография имеет весьма ограниченные возможности для количественного определения веществ.
Радионуклеидные методы широко применяются при функциональной диагностике, выявлении злокачественных новообразований. Электрофорез главным образом используется для разделения белковых фракций при построении протеинограмм.
Большая часть современных методов, включая хроматографические и электрофоретические, на том или ином этапе использует оптическую регистрацию. Оптические методы обладают высокой точностью и позволяют автоматизировать процесс анализа, что широко используется при создании автоматической и полуавтоматической аналитической аппаратуры. По данным справочника [26] оптические методы количественного анализа, применяемые в клинической биохимии, можно разделить на следующие группы:
1) рефрактометрические;
2) поляриметрические;
3) фотометрические:
а) абсорбционные:
- спектрофотометрия,
- нефелометрия,
- атомно-абсорбционная фотометрия;
16
б) эмиссионные:
- флюориметрия,
- пламенная фотометрия,
- атомно-эмиссионный спектральный анализ. Рефрактометрия базируется на измерении показателя преломления
света при прохождении его через оптически неоднородные среды. Ранее метод рефрактометрии применялся в основном для определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Поскольку преломляющая способность сыворотки зависит от уровня не только белков, но и небелковых компонентов, рефрактометрический анализ давал ложнозавышенные результаты.
В основе поляриметрии лежит свойство прозрачных веществ вращать плоскость поляризованного луча света. Метод поляриметрии широко используется для быстрого, без применения реактивов определения глюкозы в моче.
Более 80% используемых в клинико-диагностических лабораториях методов биохимических исследований базируется на спектрофотометрии. При этом спектрофотометрические методы могут использоваться как самостоятельный вид анализа, так и в качестве дополнения к другим методам, например при расшифровке хроматограмм или для анализа белковых фракций разделенных электрофорезом. Ближняя ультрафиолетовая (200...400 нм) и видимая (400...700 нм) спектральные области являются основным «окном прозрачности» для воды [29], что обуславливает их выбор при проведении спектрального анализа ЖБС. Несмотря на то, что инфракрасная спектроскопия предоставляет значительно более широкие возможности по идентификации и количественному определению веществ в многокомпонентных средах, перспективы ее применения для исследования биологических жидкостей в значительной степени ограничены из-за сильного поглощения ИК излучения водой.
Наибольшее распространение в клинико-биохимических исследованиях, благодаря своей универсальности, простоте в применении и невысоким
17
требованиям к используемой аппаратуре, получили непрямые спектрофото-метрические методы, которые также часто называют колориметрическими. Анализ по таким методам требует добавления в исследуемую среду специфического для определяемого компонента реагента, который вступает с ним в химическую реакцию с образованием соединения сильно поглощающего свет в области прозрачности анализируемой среды. Если исследуемая среда прозрачна в видимой области, зрительно это наблюдается как окрашивание, и соответствующая реакция называется цветной. Концентрация анализируемого компонента затем вычисляется по величине экстинкции, измеренной на длине волны максимума полосы поглощения продукта цветной реакции. Часто колориметрические методы реализуются способами «сухой химии», с использованием различных аналитических полосок, что еще больше упрощает процедуру анализа. Достоинством непрямых спектрофотометрических методов является возможность определять концентрацию веществ, которые не поглощают или слабо поглощают в УФ и видимой области, а также минимизация влияния мешающих компонентов за счет использования области прозрачности среды. К недостаткам таких методов следует отнести необходимость применения реактивов, инвазивность и ограниченные возможности одновременного анализа по нескольким компонентам.
Прямые методы базируются на непосредственном определении содержания анализируемого вещества в пробе по результатам измерения экстинкции среды на одной или нескольких длинах волн без использования каких-либо дополнительных реагентов в соответствии с основными принципами абсорбционного спектрального анализа. Прямая УФ спектрофотометрия является неинвазивным методом, что дает принципиальную возможность одновременно определять концентрацию сразу нескольких компонентов при малом объеме пробы и позволяет проводить анализ в режиме on-line с использованием проточной кюветы. Метод широко применяется для количественного и качественного анализа однокомпонентных сред: жидких лекарствен- |
