СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЛА
ИВР
ЛА
МПА
МПБ
ОЧБ
пдк
СПАВ
антилизоцимная активность
индекс видового разнообразия (индекс Шеннона-Уивера)
лизоцимная активность
мясопептонный агар
мясопептонный бульон
общая численность бактерий
предельно-допустимые концентрации
синтетические поверхностно-активные вещества
5 ВВЕДЕНИЕ
В современных условиях развитие производительных сил сопровождается вовлечением в переработку огромной массы природных ресурсов и увеличением выбросов нерециклируемых отходов производства (в том числе и тяжелых металлов) в биосферу.
Данные обстоятельства делают особо актуальными в вопросах природопользования максимальное сохранение экологического равновесия как на планете в целом, так и в ее отдельных регионах. Исходя из сказанного, одной из актуальных проблем использования и сохранения природных ресурсов является защита среды обитания от загрязняющих веществ, поскольку загрязнения — это часто ресурсы оказавшиеся не на своем месте (Одум Ю., 1986).
Ценой загрязнения водных ресурсов может стать потеря биологических ресурсов водных экосистем. А потому изучение состояния микробных, животных и растительных сообществ, их динамика в водных экосистемах, механизмов управления их жизнедеятельностью, охраны и воспроизводства, весьма актуально, т.к. полученные данные дают ключи к сохранению их биологического разнообразия в водных экосистемах.
Актуальность темы. Природными ресурсами для человечества являются абсолютно все ресурсы биосферы, а биологические (бактериальные, растительные и животные), являющиеся предметом потребления и обладающие мощнейшей средообразующей и средорегулирующей функцией, занимают среди них особое место (Николайкин Н.И., 2003). Данные обстоятельства - делают особо актуальными в вопросах природопользования максимальное сохранение экологического равновесия биоресурсного потенциала как в целом в биосфере, так и в отдельном регионе. Однако решение данной проблемы возможно лишь при условии изучения биоразнообразия и выяснения механизмов управления биоресурсным потенциалом.
Живые организмы существуют в тесной связи друг с другом, находясь в симбиотических отношениях (Бухарин О.В., 1999). Своеобразие биоресурсов
6
различных биотопов, обусловлено совокупным действием комплекса абиотических факторов (Шварц С.С., 1980; Одум Ю., 1986) и биологическими особенностями членов сообщества, определяющими характер взаимоотношений между ними, которые сложились в процессе эволюции (Бульон В.В., 1998, 2002; Копылов А.И., 2000). Хотя простейшие и бактерии являются неотъемлемой частью природных водоемов, механизмы формирования протисто-бактериальных ресурсов в них наименее изучены (Сомов Г.П., 1988; Плотников А.О., 2002).
Одним из экологически значимых факторов, принимающих участие в формировании биоресурсов водоемов является лизоцим (Багнюк В.М., 1980; 1983; Устинова Г.М., 2004; Шостак Е.И., 2004). Показано существование в пресных водных экосистемах особой функциональной системы «лизоцим гидро-бионтов - антилизоцим бактерий» (Соловых Г.Н., 1995; Немцева Н.В., 1998), способствующей формированию простых и сложных сетевых связей между гидробионтами.
Однако до сих пор остается недостаточно изученной роль функциональных связей типа «лизоцим простейших - антилизоцим бактерий» в механизмах формирования протисто-бактериальных ресурсов водоемов. Мало данных о таксономическом спектре простейших, динамики их развития во времени и географии водоема, а также их роли в формировании бактериоресурсного потенциала р. Урал и особенно в отношении автохтонных бактерий, которые как известно определяют процессы самоочищения водоемов (Романенко В.И., Кузнецова СИ., 1974).
В условиях развития производительных сил происходит вовлечение в переработку огромной массы природных ресурсов и выброс нерециклируемых отходов производства (в том числе и тяжелых металлов) в водоемы. Ценой поступающего в водные ресурсы загрязнения может стать потеря биологических ресурсов экосистем. На данном этапе развития биосферы наиболее остро стоит проблема ее загрязнения тяжелыми металлами (Иллялетдинов А.Н., 1984). Несмотря на то, что в процессе эволюции живые организмы приспособились к наличию
тяжелых металлов в окружающей среде и выработали механизмы регуляции к их усвоению, в условиях растущего техногенного загрязнения остаются некоторые допустимые количества поглощения тяжелых металлов, выше которых регуляторные механизмы не справляются с проявлением негативного воздействия их на организм. Выявление чувствительных к действию определенных концентраций металла гидробионтов, позволит использовать их в качестве биоиндикаторов загрязнения водоемов.
Таким образом, важное значение протисто-бактериальных ассоциаций для водоемов, а также отсутствие сведений о механизмах управления их биоресурсным потенциалом в водных экосистемах, свидетельствует об актуальности проведения данного исследования.
Цель работы — изучение биологического разнообразия и динамики развития простейших, оценка их роли в механизмах управления бактериоресурс-ным потенциалом р. Урал и разработка принципов охраны водоемов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами.
Задачи исследования.
1. Определить биологическое разнообразие и динамику развития ресурсов простейших в р. Урал в районе г. Оренбурга.
2. Оценить значение системы «лизоцим простейших - антилизоцим бактерий» в механизмах управления процессами формирования бактериоресурсного потенциала водных экосистем автохтонного и аллохтонного происхождения.
3. В условиях эксперимента и натурных исследований выявить чувствительные к токсическому загрязнению тяжелыми металлами виды простейших и обосновать методические подходы к их использованию в охране водных ресурсов от загрязнения металлами.
Научная новизна. Проведена оценка состояния биоразнообразия простейших в р. Урал в районе Оренбурга, выявлены доминирующие виды и получены данные о сходствах и различиях в географии протистооресурсов на исследованных участках реки. Впервые установлено литическое действие простей-
8 ших как на грамположительные так и на грамотрицательные бактерии аллох-
тонного и автохтонного происхождения. Обосновано представление о том, что сохранение численности, разнообразия бактериальных ресурсов в водоемах определяется уровнем антилизоцимной активности бактерий, которая осуществляет деградацию лизоцима фагосом простейших. Отсутствие антилизоцимной активности или ее низкий уровень (2-4 мкг/мл) определяют чувствительность к лизоциму простейших и как следствие их элиминацию из биоресурсов, а высокий уровень (6-8 мкг/мл) - устойчивость к его действию и незавершенность процесса фагоцитоза бактерий, т.е. их сохранению в биоценозе. Предложена модель системы управления видовым разнообразием и численностью протисто-бактериальных ресурсов водных экосистем, основанная на взаимодействии «лизоцимной активности простейших - антилизоцимной активности бактерий». В условиях эксперимента и натурных исследований в р. Урал и очистных сооружений, по результатам оценки изменения плотности сообщества простейших и отдельных видов, индекса видового разнообразия, показателей постоянства и обилия видов под токсическим воздействием металлов в биоценозе, выявлены виды устойчивые и чувствительные к различным концентрациям кадмия, свинца, никеля, хрома, цинка и меди. Определены индикаторные виды микроорганизмов на превышение предельно допустимых концентраций по хрому, цинку и меди и использованы при обосновании методических принципов в контроле за степенью очистки сточных вод от данных металлов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют теоретические представления о биоразнообразии и эколого-функциональных взаимоотношениях простейших и бактерий в р. Урал в районе Оренбурга. В результате проведенных исследований обоснована система управления механизмами формирования протисто-бактериальными ресурсами водных экосистем - «лизоцим простейших - антилизоцим бактерий».
Практическое значение исследования заключается в возможности использования простейших, как индикаторов загрязнения тяжелыми металлами водо-
9
емов. Выявлены виды микроорганизмов чувствительные к превышению ПДК
по кадмию, свинцу, никелю, хрому, цинку и меди.
Разработан «Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди», основанный на констатации исчезновения из биоценозов очистных сооружений Vorticella microstoma и Litonotus lamella, что свидетельствует о превышении ПДК по хрому; Colpidium colpoda, Notommata ansata, Cathypna luna, Monostula cornuta о превышении ПДК по цинку; Epystilis plicatilis, Vorticella campanula о превышении ПДК по меди (положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 20 января 2005г. (заявка №2003126248/13 (028088)). Способ обеспечивает охрану водных ресурсов от антропогенного загрязнения тяжелыми металлами.
Результаты исследования легли в основу создания «Методического пособия по использованию гидробионтов активного ила в процессах биологической индикации степени очистки сточных вод очистных сооружений», предназначе-ного для лаборантов лабораторий очистных сооружений, а также для экологов и санитарных врачей (Оренбург, 2003).
Реализация результатов исследования. «Способ оценки степени очистки сточных вод от хрома, цинка, меди» внедрен в работу Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от 18.04.2005), лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 21.03.05).
«Методическое пособие по использованию гидробионтов активного ила в процессах биологической индикации степени очистки сточных вод очистных сооружений» внедрено в работу комитета по природоохранной деятельности и мониторингу окружающей среды администрации Оренбургской области (акт внедрения от 30.03.2004); лабораторий городских очистных сооружений г. Оренбурга (акт внедрения от 19.04.2004); Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центра гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» (акт внедрения от 25.04.2005).
10
Полученные данные применяются в системе вузовского образования студентов на кафедре общей и коммунальной гигиены с экологией человека Оренбургской государственной медицинской академии (акт внедрения от 09.04.03), а также включены в лекционный курс «Зоология беспозвоночных» для студентов специальностей «биология» и «экология» ОПТУ (акт внедрения от 05.05.05).
Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; II международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий», Оренбург, 2002; региональных научно-практических конференциях молодых ученых, Оренбург, 2003, 2004, 2005; международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и биологии», Оренбург, 2003; I международной научно-практической конференции «Биолементы», Оренбург, 2004; II Всероссийской конференции «Экосистемы малых рек: биоразнообразие, экология, охрана» на базе ИБВВ РАН Ярославская обл. п. Борок 2004; областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2005», Оренбург, 2005; Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2005, Москва, 2005.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 1 журнальная статья, 1 методическое пособие и получено положительное решение о выдаче Патента РФ на изобретение от 20 января 2005г. (заявка №2003126248/13 (028088)).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, главу по материалам и методам исследования, четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение. Указатель литературы содержит 141 отечественных и 34 зарубежных источника литературы. Текст иллюстрирован 17 таблицами, 33 рисунками, 18 фотографиями.
11
Связь работы с научными программами. Диссертационное исследование выполнено в ГОУ ВПО «Оренбургской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» в соответствии с открытым планом научно-исследовательской работы (государственный регистрационный номер темы 01.2.00 316166).
Положения выносимые на защиту.
1. Состояние и динамика протисторесурсов р. Урал в районе Оренбурга.
2. «Лизоцим простейших - антилизоцим бактерий» - система управления механизмами регуляции протистобактериальными ресурсами водных экосистем.
3. В целях охраны водных ресурсов предложен способ биологического контроля за степенью очистки сточных вод от хрома, цинка и меди по исчезновению определенных видов микроорганизмов, чувствительных к превышению ПДК по металлу.
12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Простейшие и бактерии как экологическая компонента биологических ресурсов водоемов
Древность происхождения и высокая экологическая пластичность простейших и бактерий обуславливает чрезвычайную широту их распространения на Земле. Так, бактерии были обнаружены практически во всех известных эко-нишах, за исключением нижних слоев литосферы и верхних слоев атмосферы. Бактериопланктон несет ответственность за разрушение органического вещества, поступающего в водоем и аккумулирующегося в нем, а следовательно играет важную роль в самоочищении водоема (Громов Б.В., 1978).
Простейшие, как более высокоорганизованные организмы проявляют меньшую степень экологической толерантности, однако и они сумели заселить бесконечное множество экологических ниш: пресные и соленые водоемы, горные источники, почву (Хаусман К., 1988). Отдельные виды простейших приспособились к жизни в организме теплокровных животных и человека. Простейшие - своеобразный, особый клеточный уровень организации живой природы (Террас Ю.Х., 1981; Плотников А.О., 2002). Они являются важнейшим звеном в пищевых цепях биосферы. Размножаясь в огромных количествах, простейшие влияют на формирование и плодородие почв, на химический состав океанических вод, газовый состав атмосферы также зависит от деятельности этих организмов (Серавин Л.Н., 1967; 1984; Догель В.А., 1975). Простейшие выполняют различные функции в процессах очистки сточных вод. Наряду с бактериями, они активно участвуют в очистке стоков: выделяя обильную слизь, создают хлопья активного ила - одну из основных предпосылок полноценной очистки. Являясь, в основном, фильтраторами и седиментаторами, простейшие эффективно очищают и осветляют воду. Поглощая взвешенные вещества, простейшие способствуют осаждению ила, создают подвижное равновесие экосистемы активного ила, осветляют очищенную воду и рыхлят биопленку, способствуя ее отторжению. Питаясь в основном детритом и некоторыми водоросля-
13
ми, простейшие регулируют численность и качественный состав бактерий в активном иле и биопленке (поедая ослабленные и отмершие клетки, поддерживая ил на оптимальном уровне) (Крючкова Н.М., 1968, 1972; Чухлебова Н.А.; 1972; Голубовская Э.К., 1978).
Подобное параллельное заселение одних и тех же экотопов привели к становлению многочислнных и разнообразных связей между простейшими и бактериями (Осипов Д.В., 1981,1996; Смирнов А.В., 1995).
Взаимодействия бактерий и простейших в условиях ассоциаций возможны на следующих уровнях организации:
- Биоценотический (экосистема) - в пределах которого формируются струк турные и функциональные связи (трофические и нетрофические);
- Популяционный - на котором взаимодействия бактерий и простейших представлены в форме хищничества, антагонизма, комменсализма;
- Клеточный - в форме паразитизма и мутуализма;
- Ядерный - внутриядерный симбиоз;
- Геномный - на котором происходит нарушение экспрессии генов, дере-прессия генов, геномные мутации, двусторонний трансгенезис.
Таким образом, существует широкое разнообразие связей в протозойно-бактериальных ассоциациях на различных уровнях взаимодействия - от биоце-нотического до геномного. На уровне взаимодействия отдельных особей простейших и бактерий формируются наиболее сложные формы взаимодействия, основанные на симбиотических взаимоотношениях (Плотников А.О., 2002).
Симбиоз простейших с прокариотами, или протозойно-бактериальные ассоциации, широко распространен в природе и имеет санитарное, эпидемиологическое и медицинское значение. В санитарной микробиологии качественные и количественные показатели развития бактерио- и протистопланктина используются для определения степени загрязненности вод (Жукинский В.Н., 1976, 1981) и оценки сапробности - основного показателя эвтрофикации водоема. Эпидемиологическое значение протозойно-бактериальных ассоциаций связано
14 со способностью простейших поддерживать циркуляцию возбудителей сапро-
нозовв природных очагах в межэпидемический период (Литвин В.Ю., 1988). В клинической практике ассоциации патогенных простейших и бактерий вызывают микст-инфекции, которые тяжелее протекают и труднее поддаются лечению по сравнению с моноинфекциями (Машилов В.П.,1985; Доморад-СКИЙИ.В., 1999).
Формирование протозойно-бактериальных ассоциаций в природе определяет и ряд актуальных медицинских проблем:
- Роль протозойно-бактериальных ассоциаций в развитии микст-инфекции;
- Роль протозойно-бактериальных ассоциаций как фактора сохранения возбудителя сапронозных инфекций в окружающей среде;
- Роль протозойно-бактериальных ассоциаций в формировании качества природных и питьевых вод и оценки их эпидемической безопасности (Плотников А.О., 2002).
Наиболее известный пример протозойно-бактериальных микст-инфекций
- сочетание гонореи и трихомониаза. При этом варианте симбиоза, сохранение гонококков в клетках трихомонад препятствует эффективной диагностике и лечению бактериальной инфекции (Клименко Б.В., 2001). Располагаясь внутри клетки трихомонады, гонококки избегают антибактериального воздействия местных факторов иммунной и неиммунной защиты, а также лекарственных препаратов. До недавнего времени все внимание было направлено на изучение симбиотических взаимодействий простейших с непатогенными бактериями. Относительно недавно началось изучение механизмов выживания патогенных и условно-патогенных бактерий, возбудителей сапронозов в ассоциациях с простейшими.
Характерная особенность сапронозов заключается в том, что основным источником инфекции является субстраты внешней среды (вода, почва), где возбудитель может накапливаться и таким образом создавать природный резервуар инфекции (Литвин В.Ю., 1988). К возбудителям сапронозов могут отно-
15 сится клостридии (Плотников А.О., 2002). Множество патогенных для человека
бактерий в сапрофитической фазе своего развития могут сохраняться в клетках простейших. Простейшие (амебы) могут служить хозяином для легионелл (Тар-таковский И.С., 1988; Balbus J., 2000), иерсиний, псевдомонад, холерных вибрионов и других (Литвин В.Ю., 1985; Пушкарева В.И., 1991, 1994).
В настоящее время выделены следующие наиболее значимые механизмы формирования симбиотических связей в протозойно-бактериальных ассоциациях: предотвращение фагоцитоза и проникновение в клетку другими щадящими способами (Shigella, Salmonella); разрушение мембраны фагосомы и проникновение в цитоплазму (Shigella, Listeria); предотвращение слияния фагосомы с лизосомой (Legionella, Mycobacterium); ингибирование активных форм кислорода и лизосомальных ферментов (Shigella, Pseudomonas, Mycobacterium); выход из пищеварительной вакуоли без перфорирования ее мембраны (Holospora obtuse); наличие лизоцимной и гистоновой активностей (Плотников А.(Х, 2002).
В процессе эволюции у простейших сложились определенные механизмы взаимодействий с другими микроорганизмами (Кеса Л.Ю., 1981). Характерной особенностью всех возможных механизмов подобных взаимодействий является питание путем эндоцитоза, в основном фагоцитоза, либо нарушением нормального течения этого процесса (Colwell R.R., 1998). Анализ встречаемости эндо-симбионтов у простейших показывает, что они не обнаруживаются в тех группах простейших, которые лишены фагоцитарной активности (Громов Б.В., 1978;RatkowskyD.A., 1982).
Особый интерес представляют простейшие как часть эколого-фаунистического комплекса природных водоемов. Велика их роль в биологических процессах и продуктивности водоемов как важного звена трофических цепей (Догель В.А., 1962; Thomas L., 1975; Небрат А.А., 1994; 2001). К сожалению, в настоящее время имеются крайне ограниченные данные об интенсивности инвазии симбионтов в природных популяциях простейших, а также остает-
16
ся пока совершенно не исследованным вопрос о роли симбиотических микроорганизмов в регуляции численности простейших в природных популяциях.
Широкое распространение в природе получили способности организмов к продукции лизоцима (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974). Большинство эволюционно удаленных друг от друга представителей животного мира объединены продукцией защитного белка — лизоцима. Способность бактерий к инактивации лизоцима определяется как антилизоцимная активность и рассматривается как средство выживания.
1.2. Лизоцим как биотический фактор, регулирующий взаимодействия простейших и бактерий в водных экосистемах
Известно, что лизоцим является одним из экологически значимых факторов, принимающих участие в формировании биологических ресурсов гидробиоценозов и имеет первостепенное значение в ряду биологически активных веществ (Багнюк В.М., 1980, 1983).
Под термином лизоцим в микробиологии, биохимии и медицине подразумевают обширную группу бактериолитических ферментов, способных гидро-лизовать муреиновый каркас клеточных стенок бактерий, главным образом грамположительных (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974; Кокряков В.Н., 1999). Это довольно разнообразная по происхождению группа катионных белков, обладающих как сходством, так и отличиями в физико-химических свойствах и антибактериальной активности. Все ферменты этой группы термостабильны и обладают высоким положительным зарядом, в то же время, различаются молекулярные массы лизоцимов различного происхождения. Так, молекулярная масса лизоцима молока равна 15 000 Да, лизоцима папайи 25 ОООДа, а лизоцима фигового дерева 29 ОООДа. Кроме того, различается и оптимум рН их активности, который лежит в диапазоне значений от 4,5 до 7,0 (Поборнов В.М., Берды-ев А.А., 1991; JollesP., 1967) (табл. 1).
17
Таблица 1.
Сравнительная характеристика молекулярной массы и рН - оптимум активности лизоцимов животного и растительного происхождения
Тип лшоцима Mr рН - оптимум активности
Лизоцим молока 15000 5,0-7,0
Лизоцим плаценты 15000 6,0-7,0
Лизоцим слюны 14900 7,0
Лизоцим клеща 13800 7,0
Лизоцим папайи 25000 4,6
Лизоцим фигового дерева 29000 4,5
Примечание: Мг — молекулярная масса (Да)
По данным ряда авторов лизоцим широко распространен среди живых организмов и встречается на всех этапах эволюции. Так, данный фермент обнаружен у фагов (Koch G., Dreyer W., 1958), бактерий (Thomson L., 1940), простейших (Chung J.C., 1969), моллюсков (Ломакин М.С., 1990; Carballal M.J., 1997; Карнаухова И.В., 2000), насекомых (Mohrig W., Messner В., 1969; Malke Н., 1965), птиц (Norman A.A., Richard S., 1970) и растений (Ермольева З.В., 1938).
У животных и человека лизоцим присутствует в слюне, слезах, тканях сердца, селезенки, лимфатических узлов, почек, скелетных мышцах и мозге. Особенно высоки его концентрации в барьерных органах — печени, селезенке, почках, легких (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974).
Исследованиями последних лет обосновано существование в пресных водоемах особой функциональной системы «лизоцим-атилизоцим» на уровне бактериоценозов (Соловых Г.Н., 1995) и в водорослевых сообществах (Алехина Г.П., 1996). Показано, что среди различных групп гидробионтов - бактерий, микроводорослей, зоопланктеров широко распространена лизоцимная активность и наблюдается высокая частота встречаемости лизоцимного фактора (Соловых Г.Н., 1995; Алехина Г.П., 1996; Немцева Н.В., 1998). Показано, что лизо-цим-антилизоцимные взаимоотношения служат универсальным механизмом, обеспечивающим существование сочленов альго-бактериальных и протозойно- |
