Список используемых сокращений
FRAP - восстановление флуоресценции после фотоповреждения (fluorescence
recovery after photobleaching)
GFP - «зеленый флуоресцентный белок» (green fluorescent protein) GLUT4 - переносчик глюкозы 4 (glucose transporter 4) GSV - GLUT4 содержащая везикула (GLUT4 storage vesicle) БЛМ - бислойная липидная мембрана ДНФХ - 1,2-динервоноил-зп-глицеро-3-фосфатидилхолин ДОФЭ - 1,2-диолеоил-зп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин ДФФС - 1,2-дифитаноил-зп-глицеро-3-фосфатидилсерин ДФФХ - 1,2-дифитаноил-8п-глицеро-3-фосфатидилхолин ДФФЭ - 1,2-дифитаноил-зп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин МП - мембранный перешеек МТ - мембранная трубка НТ - нанотрубка
ОФХ - 1-олеоил-зп-глицеро-3-фосфатидилхолин ОФЭ - 1-олеоил-зп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин ТС - тубулярная структура ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
5
Введение
Мембранные тубулярные структуры (ТС) широко распространены в биологических системах. Микротрубочки, стенки которых образованы фосфолипидной мембраной, встречаются в строении множества внутриклеточных органелл, являются основой таких структур, как клеточные отростки, подии и др. [23,29,35,48,54]. Более того ТС выполняют важные транспортные функции по обмену веществ между внутриклеточными компартментами, участвуют в процессах деления и слияния мембран и, предположительно, играют важную роль в таких процессах как эндо- и экзоцитоз [3,12,18,35,38]. Поэтому исследование механических и транспортных свойств мембранных тубулярных структур является одной из приоритетных задач биофизики мембран. ч
В настоящее время активно изучается проблема создания искусственных сетей из тубулярных мембран (tubular membrane networks). Для создания биореакторов и моделирования клеточных биохимических процессов необходима разработка методов формирования систем взаимосвязанных компартментов [27,43]. Однако до сих пор остаются малоисследованными свойства простейших мембранных трубочек. Не исследованы их структурные
6
перестройки, транспортные свойства, проницаемость для различных веществ, и не выяснена роль липидного бислоя во всех этих процессах [29,53].
Исследования мембранных тубулярных структур, существующих в клетках, существенно затруднены многокомпонентностью и сложностью системы, присутствием огромного количества белков и других веществ, активно взаимодействующих с мембраной. Поэтому приоритетным направлением является создание модельных систем, позволяющих исследовать мембранные ТС в отсутствии клеточных факторов.
Существующие на данный момент методики формирования мембранных трубочек обладают существенными ограничениями и недостатками. Так модельные системы, основанные на липосомах, ограничены использованием растворов с очень малой ионной силой [43,76]. Искусственные гигантские липосомы оказываются не стабильными при физиологических условиях и, следовательно, не позволяют изучать взаимодействия мембраны с клеточными белками. Мембранные тубулярные структуры, выделяемые из клеток, содержат большое количество примесей и обладают неконтролируемым липидным составом. Более того, все известные на данный момент модельные системы не позволяют напрямую исследовать их транспортные свойства, измерять проницаемость и исследовать влияние механических свойств липидного матрикса на свойства ТС.
7 В данной работе было проведено исследование мембранных тубулярных
структур в модельных и клеточных системах. В модельной системе была разработана оригинальная методика формирования ТС из БЛМ, позволяющая воспроизводимо формировать как микроскопические мембранные трубки (МТ), так и нанотрубки (НТ) с радиусом до нескольких нанометров. Сочетание электрических измерений с флуоресцентной видеомикроскопией позволяло регистрировать форму МТ и одновременно исследовать динамику проводимости в процессе коллапса и перехода в НТ.
На клеточной системе были осуществлены исследования ТС, формируемых при эндо- и экзоцитозе (т.н. мембранных перешейков - МП). На линии перитонеальных макрофагов IC21 была исследована динамика проницаемости МП в процессе эндоцитоза, и, в частности, при фагоцитозе полистереновых микросфер. Регистрация событий эндоцитоза осуществлялась на малых участках клеточных мембран в условиях регистрации тока в режиме фиксации потенциалов (метод patch-clamp, конфигурация cell-attached) [36,75] в сочетании с техникой определения адмиттанса [56,58,75]. На адипозных (жировых) клетках была исследована латеральная проницаемость МП, формируемых при слиянии специальных везикул, содержащих мембранный белок GLUT4 [9,87]. Была использована флуоресцентная микроскопия в сочетании с методикой нарушенного полного внутреннего отражения [2,100].
8
Глава 1 Обзор литературы
§ 1.1. Квазицилиндрические поверхности. В общем случае тубулярная структура представляет собой поверхность с цилиндрической топологией или т.н. квазицилиндрическую поверхность [7,83]. Впервые подобные поверхности были описаны задолго до начала исследований мембранных ТС [79,80,83]. Структуры, имеющие данную топологию, возникают в самых разнообразных системах: тонкие пленки, эмульсии, пены, капли жидкости [1,7,]. Необходимым условием является наличие в системе нескольких несмешивающихся фаз и натяжения на границе. Перешейки могут образовываться при разделении одной из фаз на пространственно не связанные объемы [24]. Это происходит при отрыве капли, при делении пузырьков и мыльных пленок [1,8]. Несмотря на разнообразие этих процессов, во всех случаях формирование перешейка и его деление определяется поверхностными силами, в частности, межфазным поверхностным натяжением [1,13]. Особое внимание исследователей привлекали процессы потери устойчивости, или процессы деления перешейков.
Форма перешейка и основные стадии деления были впервые исследованы в классических экспериментах с мыльными пленками и водными перешейками [79,80]. Опишем вкратце эксперименты с мыльной пленкой. Два кольца, расположенные параллельно и коаксиально на расстоянии L друг от
друга, связывались квазицилиндрической мыльной пленкой. Было показано, что при расстоянии между кольцами, не превышающем критической длины (LK), мыльная пленка имела форму катеноида. Увеличение расстояния L между
462 ms
(f) 479 ms
Рис. 1.1. Деление макроскопической квазицилиндрической мыльной пленки. Видеокадры отражают трансформацию поверхности при коллапсе. Отсчет времени идет с момента начала коллапса. Диаметр колец равен 33,05см. N.D. Robinson and P.H. Steen, Journal of Colloid and Interface Science 241, 448^58 (2001)
10 кольцами либо увеличение разности давлений между внутренностью перешейка
и внешней средой индуцировало разрыв перешейка. Можно выделить две характерные стадии этого процесса: сужение перешейка при сохранении его механической устойчивости и коллапс или потеря устойчивости (например, при достижении критической длины Lk), приводящая к разрыву перешейка. Изменение формы пленки на начальной стадии коллапса хорошо описывалось в квазистатическом приближении [13]. Качественно схожие результаты были получены в теоретических [59,22] и экспериментальных [10] работах по исследованию стабильности перешейка жидкости. В этих работах описана динамика коллапса и механизмы разрыва перешейка (см. Рис. 1.1). Показано, что на финальной стадии коллапса перешеек превращается в тонкую нить, которая затем рвется, разбиваясь на микросферы различного диаметра: процесс, аналогичный хорошо исследованному процессу потери устойчивости струи жидкости (т.н. релеевская нестабильность [7,22,59]).
Уравнения катеноида, можно получить рядом способов, решая граничную задачу по поиску минимальной поверхности, связывающей два кольца с радиусом R, разведенных на расстояние L. Для нахождения поверхности с минимальной площадью необходимо найти уравнение образующей у(х), доставляющей минимум функционалу площади поверхности:
LI1
S(y)=2;r jy(x)~J\ + y'(x)dx . Эта задача сводится к решению дифференциального
-L/2
11 уравнения Эйлера: уу"=1+(у')2 с граничным условием y(L/2)=R. Решением
имеет следующий вид: у(х) = a*cosh(x/a), где параметр "а" находится из трансцендентного уравнения: R=a*cosh(L/2a) и определяет радиус в месте максимального сужения. Это уравнение имеет два решения ау и ан при LLk • Прямой проверкой можно убедиться, что большее решение ау соответствует минимуму площади и определяет форму устойчивого катеноида, тогда как ан доставляет функционалу S(y) максимум и определяет форму неустойчивого катеноида. Соответственно в эксперименте всегда наблюдается устойчивый катеноид, однако, в точке L=LK оба решения совпадают (ау = аи) и имеет место потеря устойчивости.
Новейшие исследования, посвященные изучению переходных процессов при коллапсе мыльной пленки, позволили сфотографировать промежуточные стадии коллапса. На одном из кадров почти разделившиеся пленки оставались связанными тонкой нитью[10,22]. Эта нить была видна на протяжении нескольких миллисекунд, после чего исчезала (возможно, рвалась) и превращалась в пару мыльных микросфер .
§ 1.2. Мембранные тубулярные структуры в биологических системах. До
последнего времени практически единственным методом, позволяющим изучать строение клеточных субъединиц, являлась электронная микроскопия.
12 Огромный набор данных, полученный просвечивающей (ПЭМ) и сканирующей
электронной микроскопией (СЭМ) позволил достаточно детально описать множество сложнейших клеточных структур. Последние достижения в этой области, а именно, томографическая реконструкция набора полутонких срезов [23], просвечиваемых под серией углов, дала возможность воссоздавать трехмерное строение отдельных клеточных органелл с разрешением до нанометра. В результате, было показано, что многие объекты, разрешавшиеся с помощью ПЭМ, как отдельные везикулы или сферические мембранные образования, на самом деле, соединяются мембранными трубочками, а иногда и просто являются срезами тубулярных мембранных структур [23,48]. Так было восстановлено объемное изображение мультивезикулярного тельца (multi vesicular body - MVB), изменяющее текущее представление о строении MVB. Скопления мембранных пузырьков и крупных цистерн, ранее считавшиеся замкнутыми и независимыми, оказались связанными сетью мембранных ТС [48].
Предположительно, соединяющие мембранные ТС позволяют оперативно смешивать и разделять внутренние объемы мембранных цистерн без энергоемкого цикла слияния-деления мембран [70]. Данная гипотеза позволяет развить принципиально новый подход к пониманию внутриклеточного везикулярного транспорта, а также к объяснению механизмов функционирования клеточных структур, имеющих сложно разветвленное
13
Рис. 1.2. Накопление флуоресцентного GFP-Rabl белка в тубулярных доменах (ТС) в центре Гольджи, потенциально участвующих в ретроградном внутриклеточном транспорте, (а) - GFP-Rabl в центральных структурах, связанных с Гольджи, клетки PC 12. (с) - накопление Rabl в глобулярных элементах Гольджи; рецепторы p58/ERGIC-53 в ТС отсутствуют, клетки ВНК-21. (е) - Аккумуляция Rabl содержащих ТС и формирование сети из ТС в клетках PC 12 под действием бафиломицина-А 1, ингибирующего ретроградный транспорт между ЭР и Гольджи. Стрелками показаны глобулярные компартменты. Sunnerud et al., Current Opinion in Cell biology, 2003.
строение [96,43]. Однако методы электронной микроскопии ограничены описанием статической структуры объектов. Для понимания механизмов формирования мембранных ТС, изучения их механических свойств и функций необходимо применение других биофизических методов, позволяющих регистрировать динамическое поведение ТС. Так для выяснения механизма
14 регуляции направленного транспорта макромолекул через ТС необходимо
изучение влияния градиента натяжения и липидного потока на микрообъекты, находящиеся внутри ТС [43,120].
В работе [23] было показано, что в некоторых случаях в процессе эндоцитоза везикула не претерпевает полного отделения от цитоплазматической мембраны, а остается связанной с ней тонкой (~20нм) и длинной (500нм и более) мембранной трубочкой (Рис. 1.3). Гипотеза, предполагающая формирование мембранных ТС в процессе эндоцитоза была предложена в работе [18,38]. Также были обнаружены целые комплексы (membrane networks) из мембранных ТС и квазизамкнутых везикул, связанных с цитоплазматической мембранной. Характерно, что во всех местах перегиба ТС, мембрана была покрыта клатрином (clathrin). Клатрин является хорошо изученным фибриллярным белком, основной функцией которого считают создание белкового капсида эндоцитозных везикул [116,119]. Адсорбция клатрина на мембрану приводит к локальному изменению геометрии липидного бислоя или к формированию т.н. окаймленной ямки ("coated pit") [62,118]. Тот факт, что клатрин был обнаружен в комплексах из мембранных трубочек подтверждает тесную связь процесса формирования мембранных ТС с процессом отщепления везикул при эндоцитозе. Однако отсутствие клатринового каркаса на прямых участках мембранных ТС свидетельствует о том, что стабильность цилиндрической структуры мембранной поверхности
15
Рис. 1.3. Клатриновые везикулы, связанные с плазматической мембраной тонкими ТС (или мембранными перешейками) аккумулируются в клетках, экспрессирующих мутантный белок динамин-1. масштаб 500нм. Damke et al., Molecular Biology of the Cell, 2001.
обеспечивается не белками, а определяется механическими свойствами мембраны и физико-химическими свойствами образующих ее липидных молекул. Это еще раз подчеркивает необходимость исследования механических свойств мембранных ТС.
16
§ 1.3. Эндоцитоз. Везикуляция играет важную роль в клеточных процессах транспорта макромолекул, клеточного питания, рециркуляции плазматической мембраны [89,109,114]. Отпочковывание везикул происходит при эндо- и фагоцитозе, образовании транспортных везикул в аппарате Гольджи [104,105]. Практически во всех эукариотических клетках непрерывно происходит отпочковывание небольших везикул размером 50-250 нм в цитоплазму. Скорость такого конститутивного эндоцитоза обычно очень велика: фибробласт поглощает примерно 1% своей плазматической мембраны в минуту, фагоцит в 3 раза больше [107]. Многие эндоцитозные пузырьки и транспортные везикулы окружены со стороны цитоплазмы каймой (окаймленные пузырьки) они по видимому образуются путем отпочковывания окаймленных участков плазматической мембраны (окаймленных ямок). Мембрана окаймленных пузырьков содержит клатрин, фибриллярный белок, образующий чехол на цитоплазматической поверхности везикулы [119]. Образование белкового чехла активируется при связывании небольших специфических мембранных белков с ГТФ. На стадии отщепления везикулы происходит деление МП, в котором, возможно, принимают участие белки обладающие ГТФ-азной активностью [89,112,117] (см. Рис.1.4).
17
(а)
Рис. 1.4. Мембранные тубулярные структуры, образованные при взаимодействии клеточных белков с липидной мембраной, (а) - липосомы с амфифизином; (d) - формирование клатриновых окаймленных ямок при стимуляции эпсином; (е) - клатриновые везикулы, связанные с амфифизиновыми ТС; (f) - ассоциация клатрина с эндофилиновыми ТС. Khashayar Farsad and Pietro De Camilli, Current Oppinion in Cell Biology, 2003, 15:372-381. |
