ВВЕДЕНИЕ
Важные для реакций органической химии элементы (водород, углерод, азот, кислород) представлены в природе несколькими стабильными изотопными разновидностями. Содержание минорного изотопа, а это, как правило, более тяжелый изотоп элемента, не превышает 1.1%. Установлено, что его распределение во фрагментах молекул органических веществ существенно отклоняется от статистически ожидаемого [1, 2] и несет специфическую изотопную информацию, отражающую происхождение молекулы (сырьевой, географический, технологический, возрастной и другие факторы).
Наибольших успехов в изучении изотопии органических веществ достигли масс-спектрометрия изотопных отношений и спектроскопия ядерного магнитного резонанса - методы измерения суммарного и селективного содержания изотопа в органической молекуле, соответственно. Однако, большей информативностью обладает именно фрагментная изотопная характеристика молекулы, получаемая из количественных спектров ЯМР.
Сочетание таких факторов, как естественная распространенность, магнитная активность минорных изотопов, возможность количественной оценки их фрагментного распределения, информативность изотопного профиля молекулы обеспечило широкое применение спектроскопии ЯМР в решении вопросов подлинности продукции в самых различных отраслях химической промышленности. Сущность подхода заключается в том, что измеряемый изотопный состав образца сопоставляется с соответствующими величинами из банка данных. Однако, в большинстве случаев, механизм формирования характеристичного изотопного состава молекулы, позволяющего различать органические соединения синтетического и природного происхождения, не рассматривается. Между тем, знание количественных закономерностей, управляющих процессом распределения природной метки позволит не только развивать теоретические представления
5
о химических реакциях, но и совершенствовать методы аутентификации и дифференциации биохимической продукции.
На сегодняшний день состояние этой проблемы рассматривается с двух позиций: с одной стороны в работах с естественным обогащением образцов констатируется факт нестатистического распределения минорного изотопа в молекуле органического вещества; с другой - в работах с изотопной меткой среды или субстрата изучен механизм формирования этой молекулы. В последнем случае проявление изотопных эффектов не позволяет применить знания о механизме реакции к интерпретации природного распределения изотопа. В свою очередь попытки изучить механизм той или иной реакции на природном обогащении реагентов дают неоднозначные результаты вследствие статистически неконтролируемого наложения соизмеримых по величине изотопных составов, принадлежащих разным молекулам.
Цель диссертационной работы включала решение следующих задач:
- разработка количественной методики измерений природного содержания дейтерия в органических веществах, водных и водно-органических растворах методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Установление возможностей и ограничений методики в дифференциации органических молекул различного происхождения на примере этанола;
изучение методом меченых атомов (Н, С), механизма формирования природного водородного профиля молекулы этанола в модельных реакциях получения его синтетических и природных аналогов -сернокислотной гидратации этилена и ферментативного сбраживания глюкозы;
- разработка подхода к интерпретации изотопного состава молекул, учитывающего различную степень обогащения образцов, и установление на его базе количественных соотношений между дейтеросодержанием субстратов, реагентов и продуктов реакции.
ГЛАВА I
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Спектроскопия ЯМР 2Н в изотопном анализе органических веществ.
1.1 Формирование изотопного состава органических молекул.
В 1981 г. Мартином [3] методом спектроскопии ЯМР впервые показано, что распределение изотопов, на уровне их природного содержания, в различных фрагментах молекул органических веществ существенно отклоняется от статистически ожидаемого. Из молекулы исходного вещества со свойственным только ему изотопным составом, который далее модифицируется в течение процессов синтеза или биосинтеза, формируется молекула, постепенно приобретающая характеристический изотопный состав - так называемый «изотопный отпечаток» молекулы.
Такой специфический изотопный профиль органической молекулы может формироваться в ходе естественных природных превращений. Он может быть самогенерирован в химической реакции без какой-либо специальной модификации. Наконец, «изотопный отпечаток» молекулы может целенаправленно моделироваться добавлением реагентов, искусственно обогащенных стабильными изотопами, в реакционную среду синтеза или биосинтеза. В каждом случае изотопное распределение молекулы будет принципиально различным [4].
Таким образом, любое органическое вещество несет специфическую изотопную информацию, отражающую его природное или синтетическое происхождение (Схема 1.1, уровень 1). Справедливость такой схемы формирования изотопного распределения подтверждается многочисленными работами в области количественного изотопного анализа на уровне естественного содержания изотопов. Большая часть из них посвящена проблемам аутентификации природных веществ, которые в отличие от синтетических аналогов более востребованы и, как правило, состав компаундов на их основе в большей степени подвержен фальсификации.
Схема 1.1 Генетическая информация, отражаемая изотопным профилем молекулы
Органическая молекула
таеская природная Уровень 1
СИНТсТ!
химическое Растительное Животное Уровень 2
происхождение сырье сырье
вид Уровень 3
география
окружающая Уровень 4
среда
— сезон
Пионерскими в этой области стали работы по идентификации пищевого и синтетического этанола, как основного компонента алкогольной продукции (АП). Критерий дифференциации - количественное распределение изотопа 2Н в структурных фрагментах молекулы [1]. Изотопный анализ на ядрах различных минорных изотопов нашел широкое применение в установлении происхождения и других пищевых компонентов: кофеина (13С, N, Н) [5], ванилина ( С, Н) [6, 7], уксусной кислоты ( Н) [8], глицерина и триглицеридов как критерия подлинности оливкового масла ( С, Н) [9-11]. По «изотопным отпечаткам» молекулы отслеживается происхождение компонентов, широко используемых в парфюмерной [12-14] и косметической [2, 15] промышленности.
Если вещество получено синтетически, то его изотопный состав «запоминает» изотопные характеристики химических предшественников, растворителей, катализаторов, возможных примесей и несет информацию о химическом происхождении вещества (уровень 2) [16-18].
8
В случае природного происхождения, «изотопный отпечаток» вещества может указывать на растительную или животную природу сырья, из которого оно было выделено (уровень 2). Так, например, отличаются дейтронные «отпечатки» молекул этанола, полученного после брожения молока или в процессе биоконверсии глюкозы [19]. Изотопные характеристики галактозы и сквалена, выделенных из растительного или животного сырья, также строго специфичны [20, 21].
Если молекула синтезируется растением, можно обозначить следующий уровень информации (уровень 3) - «отпечаток» ботанического вида, обусловленный биохимическими особенностями растительного фотосинтеза. Растения могут усваивать углекислый газ только по одному из трех способов. Наиболее распространенный носит название цикла Кельвина (С3 -типы растений) и заключается в том, что из усвоенных молекул СО2 растение «строит» фосфоглицериновую кислоту. В цикле Хетча-Слека (С4-тип) происходит синтез яблочной и аспарагиновой кислот. САМ цикл (от латинского Crassulacean Acid Metabolism - метаболизм крассулациановой кислоты) представляет комбинированный механизм, объединяющий С3 и С4 циклы. В зависимости от типа фотосинтетического цикла содержание изотопа 13С в биомассе растений может быть меньше, чем в потребляемой углекислоте. Для каждого из механизмов усвоения углерода характерна своя величина 5*. Так значение 513С для углеводов из растений с С3 типом фотосинтеза (пшеница, ячмень, сахарная свекла, картофель и др.) лежат в интервале от -21 до -31, для механизма С4 (кукуруза, сахарный тростник) от -9 до -15, для САМ (ананас, кактус) от -11 до -28 %о [22, 23]. Различное обогащение изотопом 13С растений С3 и С4 позволяет однозначно
5 - шкала (промилле %о), используется в изотопной масс-спектрометрии и представляет величину отклонения изотопных отношений исследуемого и стандартного образцов. Рассчитывается по уравнению: 5 = [(Япробь/Кставдарта)-!]1^3» гДе R ~ отношение концентраций тяжелого изотопа к легкому.
9
идентифицировать не только сами растения, но и продукты их переработки. Кроме того, циклы различаются количеством потребляемой воды, следовательно, установление источника растительного сырья, из которого было выделено вещество возможно и по характеру распределения изотопа 2Н в нем [24-27].
Наконец, изотопный профиль молекулы может служить «индикатором» окружающей среды, в которой данное растение произрастало, а именно -географических и сезонных изменений (уровень 4). Такую зависимость объясняет тот факт, что все природные органические вещества имеют в своей основе два начала - воду (Н2О) и углекислый газ (СО2), изотопный состав которых зависит, в первую очередь, от конкретного географического места и условий ферментативных реакций. В свою очередь изотопный состав водорода и кислорода, объединенных в растительных углеводах, зависит, главным образом, от изотопного состава осадков. Так авторами [28] еще в 50-х годах было установлено, что изменения О/ О и Н/ Н изотопных отношений осадков прямо скоррелированы со среднегодовой температурой, поскольку температура конденсации воды имеет сильное влияние на ее изотопный состав. Позже появились многочисленные работы по изучению сезонных колебаний изотопного состава осадков [29-31], которые были сопоставлены с изменениями изотопного распределения в молекулах растительных компонентов [32, 33].
Региональная дифференциация образцов также обусловлена особенностью изотопного состава воды, меняющегося в зависимости от географического происхождения. Так в случае водорода установлено, что содержание дейтерия в воде сильно зависит от широты. В полярных частях мирового океана оно понижается (от 150 м.д . на экваторе до 100 м.д. у полюсов) [34, 35]. Это позволяет отслеживать географическое происхождение
м.д. - миллионная доля (или ррт) показывает долю дейтерированных молекул по отношению к полностью протонированным, обозначается (D/H)
10
различных образцов, полученных из растительного сырья: наркотиков [18], алкогольной продукции [36, 37], оливковых масел [38], соков [39] и т.д.
Таким образом, изотопный состав молекулы в целом, а так же характер фрагментного распределения изотопов, формирующийся в ходе химических и биохимических реакций, являются своеобразной «памятью происхождения» этой молекулы, включающей информацию как о сырье, так и технологии его переработки.
1.2 Фрагментное распределение изотопов в молекулах органических веществ
Изотопный состав молекулы может быть представлен интегральной и дифференциальной величинами, отражающими суммарное содержание изотопа в молекуле и его фрагментное распределение, соответственно. В обоих случаях изотопная характеристика молекулы несет информацию о ее генеалогии [40, 41]. В ряде исследований необходимым и достаточным условием является знание суммарного содержания изотопа в молекуле. В работе [42] на основании суммарной величины 5 13С молекулы этанола приводятся заключения относительно сырьевого источника углевода, из которого он был синтезирован. Авторами других работ показано, что судить о синтетическом или природном происхождении, например, глицерина [43] и эфирных масел [44] можно лишь на основании фрагментного распределения изотопа в молекуле.
Аналогичные примеры могут быть представлены относительно дейтронного «отпечатка» молекул. Несмотря на то, что по сравнению с изотопом 13С, диапазон вариации содержания дейтерия в природе значительно шире (> 80 % для ядер 2Н и < 5 % для ядер 13С по шкале 5 [34]), большую информативность имеет фрагментная изотопная характеристика молекулы. В интересах настоящей работы подробно рассмотрен водородный профиль молекулы глюкозы.
11
Прямое исследование глюкозы методом ЯМР 2Н затруднено, поскольку разрешающей способности прибора (на уровне Во = 11 Т) недостаточно для того, чтобы разделить сигналы от всех семи неэквивалентных углерод - связанных атомов водорода. Поэтому был проведен поиск производных глюкозы, подходящих для определения природного фракционирования дейтерия [24-27, 45].
В большинстве описанных работ изотопные отношения для каждого из семи изотопомеров углевода рассчитываются только при совместном анализе спектров нескольких производных, синтезированных из одного и того же образца глюкозы [25]. Наиболее успешный синтез был проведен в [26]: спектр ЯМР 2Н молекулы 3,6-ангидро-1,2-(7-изопропилиден-а-0-глюкофуранозы позволяет разрешить сигналы от всех семи углеродсвязанных изотопов водорода. В таблице 1.1 представлен водородный изотопный профиль глюкозы различного сырьевого происхождения.
Таблица 1.1
Влияние типа фотосинтеза растения на изотопные отношения углерод-связанных атомов водорода молекулы глюкозы а
тип растение (D/Hb ppmb (D/H)i, ppmc
с, c2 Сз c4 c5 Сба Сев
Сз сахарная свекла 128.1 123.3 126.1 123.7 154.8 144.0 112.6 111.8
апельсин 146.2 151.2 146.3 151.2 153.7 156.5 134.0 130.5
виноград 144.8 145.3 144.4 141.7 159.3 156.4 135.3 131.4
С4 сахарный тростник 1 137.4 159.8 137.8 136.7 120.8 127.9 148.0 130.5
сахарный тростник 2 143.1 165.4 138.7 140.0 127.0 133.1 156.2 141.3
кукуруза 151.0 173.8 156.7 146.4 140.3 145.4 151.7 142.7
САМ ананас 153.5 151.5 157.6 158.9 164.4 158.7 134.7 148.5
a заштрихованы фрагменты глюкозы, значения (D/H) которых характеристичны для целей дифференциации сырьевого источника; b суммарное изотопное отношение; с фрагментные изотопные отношения
12
Из таблицы следует, что суммарное содержание дейтерия в молекуле глюкозы является недостаточным критерием для установления типа фотосинтетического цикла растения, из которого она была выделена. С другой стороны авторами показано, что изотопный профиль молекулы, представленный в виде фрагментных изотопных отношений, проявляет характерные черты, свойственные лишь определенному семейству. Так, для Сз растений отмечается относительное обогащение дейтерием 4- и 5-го углеродного атома глюкозы, в то время как для С4 семейства такое обогащение характерно для 1- и 6-го атомов. Растения САМ типа характеризуются повышенным содержанием дейтерия во фрагментах при Сг^Сз углеродных атомах глюкозы. Аналогичные закономерности были установлены авторами других работ [25, 27].
Следует отметить, что в большинстве проанализированных работ, посвященных дифференциации Сахаров, водородный профиль молекулы глюкозы оценивается на основании фрагментного распределения изотопа дейтерия в молекуле спирта, являющегося продуктом биоконверсии углевода (подробнее раздел 1.6) [46-49]. В Таблице 1.2 приведены значения содержания дейтерия в молекулах этанола различного происхождения [1].
Таблица 1.2
Содержание дейтерия в этаноле растительного и синтетического
происхождения (ррш)
(D/H) Сз с4 этилен (контактный способ) этилен (H2SO4)
пшеница картофель сахарная свекла кукуруза сахарный тростник
1а 119.5 117.6 ПАЛ 122.1 123.2 133.9 136.0
СНз 103.5 97.3 94.1 111.6 111.2 123.3 120.9
СН2 128.3 131.8 128.0 123.9 127.8 141.8 151.7
1 суммарное содержание дейтерия в молекуле этанола (по данным масс спектрометрии)
Авторами делается вывод, что на основании суммарной величины D/H можно дифференцировать молекулы синтетического и природного
13
происхождения (в первом случае этанол характеризуется более высоким дейтеросодержанием по всем трем параметрам). В случае пищевых спиртов для установления типа гликолизного цикла растения, из которого был выделен сахар, необходимо знание фрагментного распределения изотопа. В частности авторами показано, что такую информацию несет только метильная группа этанола.
В рассмотренных выше примерах информативность фрагментного изотопного профиля молекулы обсуждалась с точки зрения его дифференцирующей способности. Не менее важной данная изотопная характеристика является при установлении механизмов реакций. В частности знание водородного окружения молекул этанола [44], глицерина [48], маннитола [49] и жирных кислот [50, 51] позволило авторам обсуждать механизмы их биохимического синтеза, включающего стадии водородного обмена.
Знание фрагментного изотопного распределения является мощным источником информации, позволяющей устанавливать связь между индивидуальными атомами продуктов реакции и атомами, принадлежащими молекулам исходных веществ. Полученные результаты могут быть интерпретированы с точки зрения генеалогии отдельно взятых атомов и их участия в процессах химического и биохимического синтеза [48-54], с позиции кинетических изотопных эффектов, сопровождающих формирование определенного молекулярного фрагмента [55-62].
1.3 Спектроскопия ЯМР на ядрах дейтерия
Величина природного содержания изотопов, определяющих характеристичный изотопный профиль молекулы (а это, как правило, более тяжелые изотопы элемента) составляет порядка одной части на 104 частей основного изотопа. Следовательно, метод, который может быть использован
14
для подобных изотопных определении, должен различать изменения, порядка одной части на миллион.
Наибольших успехов в изучении изотопии органических веществ достигла масс-спектрометрия изотопных отношений, IRMS (Isotope Ratio Mass-Spectrometry) - прямой метод измерения отношений 2Н/1Н, 13С/12С, 18О/16О, 15N/14N в индивидуальных органических веществах и их смесях. Не касаясь современных возможностей и особенностей метода (они представлены, например в [63-65]) следует упомянуть два его недостатка. Один из них - для любого объекта возможно измерить только суммарное значение изотопного отношения. Так, например, для молекулы этанола, в которой содержится два различных атома углерода и два вида атомов водорода можно получить только одно значение 13С/12С и 2Н/1Н, т.е. общие отношения, но не изотопные отношения для отдельных фрагментов.
Другой недостаток метода - необходимость разложения образца. Вещество сжигается до двуокиси углерода и воды, последняя, в свою очередь, восстанавливается до молекулярного водорода. Пробоподготовка снижает точность результатов анализа, в частности, при анализе изотопии водорода.
Тем ни менее, определенный методом IRMS, суммарный 13С профиль молекулы часто применяется для характеристики различных биохимических превращений в природных условиях [66]. Более того, метод позволяет анализировать фрагментное распределение изотопа 13С, но только при реализации специфических и зачастую очень длительных реакций разложения исследуемого образца [67].
Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) позволяет измерять интенсивности сигналов избирательного поглощения энергии электромагнитного поля любыми ядрами, спин которых не равен нулю. Метод лишен недостатков, отмеченных для метода IRMS. Каждое неэквивалентное ядро в спектрах ЯМР обуславливает отдельный сигнал. Так, в случае этанола наблюдается 2 отдельных сигнала от неэквивалентных атомов углерода, 3 — от атомов водорода и 1 — от кислорода. Интенсивность каждого сигнала в
15
спектрах ЯМР любого из этих изотопов прямо пропорциональна количеству ответственных за эти сигналы ядер. Для регистрации количественных спектров ЯМР вещество не нужно модифицировать, достаточно перевести его в раствор.
Недостаток метода ЯМР - его пониженная по сравнению с IRMS чувствительность, что создает принципиальные трудности количественного анализа изотопного распределения ядер с очень низким содержанием. Именно это обусловило тот факт, что хотя метод ЯМР был создан в 1945 г., первые работы по количественному анализу вариаций естественного содержания изотопа 2Н появились спустя 35 лет, а изотопа 13С - 45 лет.
Спектроскопия ЯМР 2Н представляет собой достаточно самостоятельную ветвь ЯМР спектроскопии. Известно несколько обзоров по разным аспектам техники наблюдения спектров ЯМР Н, хотя в большинстве случаев речь идет о регистрации спектров дейтеромеченных соединений [68].
Наблюдение спектров ЯМР 2Н на уровне природного содержания изотопа встречает серьезные затруднения, прежде всего за счет низкого природного содержания дейтерия (0.015%, т.е. на четыре порядка ниже, чем 'Н). Принимая во внимание, что для равного количества ядер, чувствительность метода ЯМР Н составляет 9.610" относительно Н, то в целом чувствительность ЯМР 2Н спектроскопии по отношению к ЯМР 1Н составляет около 1.5-10"6. Вторая трудность связана с существенно меньшим (в частотных единицах ЯМР) диапазоном химических сдвигов: на 1000 Гц протонного диапазона приходится всего лишь 153 Гц дейтронного. Дополнительные затруднения обусловлены также наличием квадрупольного момента у ядра. Это приводит к уширению линии в спектрах ЯМР 2Н (как правило, ширина линии не менее 1 Гц) [25, 69].
Эти обстоятельства существенно снижают возможности ЯМР 2Н спектроскопии на уровне природного содержания изотопа. Тем ни менее, она занимает важное место в фундаментальных и прикладных исследованиях, базирующихся на «изотопном отпечатке» молекулы. Главной причиной
16
является большой диапазон вариаций природного содержания дейтерия в органических объектах (от 50 до 200 ррт), и как следствие - большая информативность количественных характеристик. В начале 80-х годов Мартин (Франция) создал и впоследствии внедрил в практику новый количественный метод измерения селективного распределения дейтерия, на уровне его природного содержания, в различных положениях органических молекул, названный им SNIF-NMR (Site-Specific Nuclear Isotope Fractionation) [3]. Русского эквивалента для аббревиатуры SNIF-NMR нет, поэтому нами в дальнейшем будет использоваться понятие фрагментного или позиционного распределения.
Для интерпретации полученных нами данных по ферментативному сбраживанию глюкозы в тяжелой воде, представленных в последующих разделах настоящей работы, рассмотрим общую схему спиртового брожения глюкозы, и более детально - стадии, на которых возможен водородный обмен углеродсвязанных протонов глюкозы со средой.
1.4 Схема спиртового брожения глюкозы
Классическая схема спиртового брожения глюкозы включает следующие основные стадии [70, 71]:
1) Образование фосфорилированных моносахаридов.
В подвергнутых брожению растворах глюкозы на первой стадии происходит фосфорилирование углевода при его взаимодействии с АТФ, в результате чего образуется 6-фосфат D-глюкопираноза (I). Этот эфир в результате внутримолекулярного переноса атомов водорода изомеризуется в 6-фосфат D-фруктофуранозу (И) с установлением равновесия между этими двумя эфирами в соотношении 1:11 « 2:1. Фруктоза фосфорилируется по первому углеродному атому, образуя 1,6-дифосфат D-фруктофуранозу (III). Фосфофруктокиназа, катализирующая последнюю реакцию, является самым
17
"медленным" из всех ферментов, обслуживающих дихотомический распад углеводов. Эта практически необратимая реакция лимитирует весь процесс.
СНОН I неон
носн
I неон
о
нс-
АТФ
ч
ч
АДФ
СНОН
неон
-*- I носн
I неон
о
нс-
оксоизоме-раза
Ли /~»тт глюкокиназа* I
СН2ОН СН2ОРОзН2
I
СН2ОН НОС-
НОСН
I
неон
АТФ
ч
о
нс-
CH2OPO3H2
II
ч
АДФ
СН2ОРО3Н2
нос-носн
I О
неон нс-
СН2ОРО3Н2
III
* здесь и далее название фермента, катализирующего данную реакцию 2) Алъдолъная деконденсация
СН2ОРО3Н2
СН2ОРО3Н2 СО
носн
HCCJH
альдолаза
СН2ОРО3Н2
со
СН2ОН
фосфат диоксиацетона (95%
триозофосфатизомераза
сно неон
СН2ОРО3Н2
фосфат
Ь-глицеринового альдегида (5%)
Молекула 1,6-дифосфата фруктофуранозы подвергается дихотомическому распаду на две фосфотриозы, превращающиеся друг в друга. В дальнейший обмен вступает только 3-фосфоглицериновый альдегид. По мере расходования убыль этого соединения восполняется за счет фосфодиоксиацетона, который практически нацело в него превращается. Следовательно, из каждой молекулы 1,6-дифосфат D-фруктофуранозы фактически возникает две молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида.
3) Синтез пировиноградной кислоты |
