ВВЕДЕНИЕ.
Антитела (Ig) - один из инструментов иммунной системы, медиатор гуморального иммунитета. Они продуцируются потомками В-лимфоцитов - плазматическими клетками и обладают уникальным сродством к антигену, индуцировавшему их выработку. Связывание антитела с антигеном запускает каскад реакций, приводящий к удалению антитела из организма, а именно, активацию системы комплемента, усиление фагоцитоза.
Высокоспецифичное, высокоаффинное взаимодействие антитела с антигеном позволяет использовать антитела в исследовательских, аналитических и терапевтических целях. Антитела широко используются в иммуноанализе (ИФА, РИА и проч.), позволяя детектировать и количественно определять пикомолярные концентрации вещества в сложных смесях, например в сыворотке крови. Широчайшим образом антитела используются в настоящее время для анализа субпопуляциошюго состава клеток крови (метод проточной цитометрии), что позволяет характеризовать иммунный статус организма. С помощью изотопно-меченных антител проводится локализация в организме очагов опухолевого роста. В терапевтических целях антитела применяются для нейтрализации токсинов. Разрабатываются подходы к использованию антител в терапии злокачественных опухолей. Антитела находят применение в научных исследованиях для выделения (иммуноаффинная хроматография) и характеристики биомолекул.
Исторически первым источником антител была сыворотка иммунных животных и человека. Получаемые таким образом антитела содержат набор иммуноглобулинов различных классов и подклассов, специфично узнающих свой антиген. Различные антитела сыворотки узнают несколько участков (эпитопов) антигена. Таким образом, сыворотка полиспецифична, что в ряде случаев является недостатком. Дальнейшим развитием способов получения антител явилось создание гибридомной технологии, которая позволяет получать антитела, продуцируемые одним клеточным клоном,
7 узнающие один эпитоп и сохраняющие свои свойства во многих генерациях гибридной
клетки. К достоинствам моноклональных антител можно отнести высокую специфичность, возможность получения их в больших количествах и одинаковой специфичности. К недостаткам можно отнести то, что технология получения моноклональных антител разработана для мыши и крысы и является трудно применимой в случае антител человека, в то время как для терапевтических нужд требуются именно человеческие иммуноглобулины. Затруднения возникают и в тех случаях, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти толерантность к антигену. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов антител. Одним из таких методов является техника фагового дисплея антител. В 1990 году было показано, что антиген-связывающие.фрагменты aimn^(scFv, Fab), представленные на поверхности нитевидного фага, могут быть отобраны на иммобилизованном антигене [McCafferty, 1990]. Основной идеей метода является создание комбинаторной библиотеки, в которой вариабельные участки легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов соединены случайным образом и представлены на поверхности бактериофага. Каждый бактериофаг, как и В-лимфоцит, экспрессирует антитело единственной специфичности. При достаточно большом размере библиотеки репертуар вариабельных участков будет сравним с репертуаром антител в организме. К достоинствам метода можно отнести следующие:
1. Возможность отбора антител in vitro, минуя стадии иммунизации животных.
2. Отсутствие необходимости использования лабораторных животных и поддержания . долговременных культур клеток эукариот.
3. Время получения индивидуальных клонов-продуцеитов миниантитсл составляет 10 - 14 дней, по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии.
4. Относительная простота получения антител и их низкая себестоимость.
8
5. Возможность создания гибридных молекул с маркерными белками за короткое время.
6. Возможность получения антител к аутоантигенам и слабоиммуногениым соединениям.
С целью решения стоящих перед Институтом задач нам представлялось актуальным создание комбинаторной библиотеки миниантител мыши, в частности, получение на ее основе scFv к интересующим нас антигенам - гранулоцитарному колониестимулирующему фактору человека (G-CSF) и природному фитогормону - транс-зеатину.
G-CSF - цитокин, стимулирующий рост гранулоцитов и активирующий нейтрофилы [Cteven, 1987]. Он представляет собой гликозилированиый полипептид с молекулярной массой 19 кДа. G-CSF применяется в онкологии для восстановления числа нейтрофилов при лейкопении, вызванной радио- или химиотерапией. Для анализа G-CSF в процессе производства и клинического применения необходимы тест-системы, причем наиболее удобными в настоящее время являются иммунохимические тест-системы на основе антител.
Траис-зсатин это один из ключевых фитогормонов, ответственных за рост и развитие растений. Несмотря на большой объем данных о роли траис-зсатина в регуляции деления и дифференцировки клеток, механизм действия этого вещества до сих пор недостаточно изучен. Использование антител, направленных против транс-зеатина, может позволить прояснить молекулярные аспекты его функционирования.
Таким образом, в задачи данного исследования входило:
1-. Создание представительной библиотеки фагового дисплея мышиных миниантител. 2. Проверка качества полученной библиотеки на примере получения фагмидных клонов, . экспрсссирующих мшшантитела к белковому антигену - G-CSF и гаптену - транс-• зеатину.
9
3. Получение, выделение и характеристика миниантител к G-CSF.
4. Создание на основе полученных миниантител тест-системы для количественного определения G-CSF.
5. Получение, выделение и характеристика миниантител к транс-зеатину.
10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. КЛАССИФИКАЦИЯ И ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ. Иммуноглобулины - крупные гликопротеины с четко выраженной доменной структурой, продуцируемые В-лимфоцитами и плазматическими клетками. Характерной особенностью доменов иммуноглобулинов является пространственная укладка в виде двух слоев с антипаралельной Р-складчатой структурой. Мономерная молекула построена из двух идентичных легких (L) и тяжелых (Н) цепей. Существует пять классов иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM) принадлежность к которым определяется типом тяжелой цепи (а, у, б, 5, ц) и два типа легких цепей (к и К). N-концевые домены L-
и Н-цепей в значительной степени отличаются у разных антител и называются вариабельными, остальная часть молекулы Ig в пределах каждого класса почти не изменяется и называется константной. Вариабельная область ответственна за взаимодействие с антигеном, а константная осуществляет эффекторные функции: активацию системы комплемента, запуск клеточных реакций, опосредованных Fc рецепторами клеток иммунной системы.
снз
Рис.1. Общий план строения молекулы иммуноглобулина.
11
Разнообразие антигенсвязывающих участков антител определяется строением кодирующих их генетических элементов. У млекопитающих вариабельные домены Н- и L- цепей кодируются несколькими элементами (V-, D-, J-) которые в незрелых В- клетках физически разобщены, но объединяются в зрелых В-лимфоцитах. Локусы легких цепей генома содержат несколько сотен V-генов, разделенных интронами, далее следуют кассеты J сегментов также разделенных интронами. В процессе созревания В-лимфоцитов происходит объединение V и J участков генов иммуноглобулинов и объединенные V и J области формируют репертуар антиген-узнающих участков легких цепей В-клеток и
плазмацитов.
L1 VI Ln Vn Зародышевая ДНК 5'—П-
Jl-4
-3'
I перегруппировка ДНК: * обединение V-I
L1 VI Л J2-4 Ск
Перегруппированная ДНК 5'-
Первичнын РНК-транскрипг 5'
мРНК
Полнпептнд-предшественннк
Легкая к-цепь
I транскрипция
L1 VI Л J2-4 Ск
I прецесеинг и
• гликоэилирование белка
V С
Рис.2. Схема перегруппировки генов и биосинтеза к-цепи иммуноглобулина мыши.
Локусы, кодирующие антиген-узнающие участки тяжелых цепей, имеют то же принципиальное строение, но включают еще кассеты D сегментов, что увеличивает разнообразие за счет V, D и J соединения (рис.3). Общий потенциальный репертуар мышиных антител, формирующийся за счет комбинаторики сегментов и цепей, составляет
12 около 10м вариантов. Каждый В-лимфоцит синтезирует иммуноглобулины лишь одной
специфичности.
Зародышевая ДНК
L1 VI Ln Vn Dl-12 Jl-4
5'-
Сц
I перегруппировка ДНК:
обединение D-J
L1 VI Ln Vn D1D2J1 J2-4 Сд
-3'
1
J перегруппировка ДНК:
обединение V-D-J
LI V1D2J1 J2-4 _Сц IlqjeipynnnpoBamm ДНК 5'—П- Щ
1 транскрипция
L1 VI D2J1 J2-4
Первичный РНК-транскрипг 5'
1 сплайсинг
L1 VI D2J1 Сд мРНК 5'~Щ Ш "j-AAA
I трансляция
Полнпегпид-предшественник
Тяжелая ц.-цепь
L V С
KZZ1C3
I процессию-и
гликозилирование белка
V С
Рис.3. Схема перегруппировки генов и биосинтеза ц-цепи иммуноглобулина мыши.
1.2. КЛОНИРОВАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ИХ ФРАГМЕНТОВ.
Интерес к клонированию функционально-активных фрагментов антител не угасал с начала 80-х годов. Первоначально для этих целей конструировали библиотеки геномной ДНК и кДНК из В-лимфоцитов [Morrison, 1985] или гибридом. Крайне важным этапом для инженерии антител стало развитие методов ПЦР и их применение для клонирования участков генов иммуноглобулинов. В 1984 году Cebilli [Cebilli, 1984] опубликовал работу по экспрессии активных антител в Е. coli. Затем, через четыре года вышла целая серия
13 работ [Better, 1988; Bird; 1988, Huston, 1988; Skerra, 1988], посвященных экспрессии
фрагментов антител в клетках бактерий и дрожжей [Horwitz, 1988]. Эти первые исследования показали, что эффективность экспрессии в гетерологичных системах зависит от структуры клонируемого фрагмента антител. Позднее было показано, что вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей, ковалентно соединенные гибким гидрофильным спейсером, не проявляют существенных отличий в связывании антигена и формировании Vh-Vl гетеродимера от природных антител [Huston, 1991].
В работах [Larrick, 1989; Orlandi, 1989] из мРНК гибридом получали кДНК, которую затем использовали для амплификации Vl- и Ун-фрагментов иммуноглобулинов. Эти работы существенно отличались от более ранних тем, что ПЦР-амплификацию проводили с использованием синтетических праймеров, выбор которых был обусловлен структурой 5'-концевых участков V генов и З'-концевых участков Jh или Jl сегментов генов не конкретных моноклональных антител, а базировался на существовании относительной консервативности этих последовательностей у разных иммуноглобулинов [Larrick, 1989]. Количество праймеров для ПЦР может быть сведено до нескольких десятков, если учитывать частоту встречаемости 5'-концевых последовательностей FR1 и использовать вырожденные олигонуклеотиды. Этот момент является существенным, поскольку он указывает на возможность создания библиотек фрагментов иммуноглобулинов, о чем более подробно будет сказано ниже. В настоящее время разработано несколько наборов праймеров для амплификации фрагментов ДНК, кодирующих V-области антител мыши, человека [deHaard, 1999; Kettlborough,1993], быка [O'Brien, 1999] и других животных. Кроме возможности амплификации последовательностей ДНК при создании праймеров также важно учитывать такие факторы, как введение сайтов рестрикции, tag-последовательностей и проч. В случае использования в качестве источника РНК мышиных гибридом следует учитывать также возможность амплификации аберрантных легких цепей, происходящих от исходной
14 раковой линии MOPS-21, которая является предшественником многих линий миелом,
используемых для слияния [Саго11,1988]. В настоящее время условия амплификации значительно улучшены по сравнению с первыми сообщениями. Несмотря на существенное развитие методов клонирования, ряд проблем, не до конца решенных в начале 90х годов, остается актуальным и сейчас.
1.2.1. ЭКСПРЕССИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ИХ ФРАГМЕНТОВ В
ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХ.
Фрагменты иммуноглобулинов (Fab и scFv) могут быть успешно экспрессированы в клетках бактерий, дрожжей, насекомых и в растительных клетках. Более подробно мы будем рассматривать экспрессию таких фрагментов в E.coli, причем одноцепочечные миниантитела (scFv), у которых L- и Н-цепи соединены гибким линкером, оказались более удобными для экспрессии по сравнению с Fab фрагментами, для которых было необходимо корректное соединение двух полипептидов в клетке. Кроме того, гены scFv могут быть легко получены с использованием ПЦР [Ayala, 1992], а структура продукта экспрессии дополнительно стабилизирована путем создания искусственно введенных дисульфидных связей [Reiter, 1996] или обработки глутаровым альдегидом [Glockshuber, 1990]. Существует несколько стратегий экспрессии фрагментов антител в клетках Е coli. При экспрессии и накоплении иммуноглобулинов внутри клетки они формируют тельца включения, содержащие инактивированные антитела, поэтому требуется ренатурация этих белков in vitro после выделения и очистки [Buchner, 1991; Canaan-Haden, 1995; Chaudhary, 1990]. Формирование дисульфидных связей и образование активных фрагментов антител происходит также в клетках бактерий, экспрессирующих тиоредоксинредуктазу [Proba, 1995]. В другом подходе к экспрессии применяется получение гибридов Fv фрагментов с сигнальными последовательностями, обеспечивающими экспорт белков в периплазматическое пространство или
15 культуральную среду. Окисляющая среда периплазмы имитирует среду
эндоплазматического ретикулума эукариотической клетки, обеспечивая формирование внутридоменных дисульфидных связей и облегчая корректное сворачивание молекулы [Duenas, 1994]. Выбор стратегии экспрессии в значительной мере зависит от аминокислотной последовательности V фрагментов, замена даже одной аминокислоты может изменять уровень экспрессии белка в несколько раз. В случае scFv взаимная ориентация V областей относительно линкера (Vh-1-Vl или Vl-1-Vh) также может влиять на эффективность экспрессии белков в клетках E.coli.
Многие штаммы бактерий могут быть использованы для получения Fab и scFv фрагментов. Подбор подходящего штамма и условий культивирования имеют решающее значение для крупномасштабной наработки фрагментов иммуноглобулинов [Pack, 1993]. В большинстве случаев удается получить от 20 до 200 мг очищенных фрагментов из литра культуры, однако есть сообщения о существенно больших выходах вплоть до 1-2 г/л [Carter, 1992].
1.3. СОЗДАНИЕ КОМБИНАТОРНЫХ БИБЛИОТЕК АНТИТЕЛ.
Вслед за успешным применением ПЦР для выделения индивидуальных V-генов на основе РНК и экспрессии активных Fab и scFv фрагментов в периплазме микроорганизмов были созданы комбинаторные библиотеки антител. Их создание включает следующие этапы: из лимфоцитов выделяют РНК, синтезируют кДНК и по отдельности амплифицируют легкие и тяжелые цепи (или их фрагменты) иммуноглобулинов. Праймеры для ПЦР выбираютя таким образом, чтобы можно было амплифицировать все известные терминальные V, D и J-сегменты. Такие индивидуальные участки ДНК затем объединяют в форме фрагментов, кодирующих Fab или scFv, и вводят в состав фагового или фагмидного вектора. После трансформации таким вектором каждая бактерия содержит один из вариантов антител преиммунного животного. После индукции
16
экспрессии различные варианты антител могут быть идентифицированы по способности связывать антиген [Clackson, 1994]. Для выделения РНК могут быть использованы как иммунизированые, так и неиммунизированные животные. В первом случае большую представленность в библиотеке имеют клоны, продуцирующие высокоаффинные антитела к антигену, использовавшемуся для иммунизации, появляющиеся в результате вторичного иммунного ответа на антиген. Комбинаторные библиотеки, полученные из неиммунизированных животных будут в большей степени представлять исходный репертуар антител. Представленность каждого типа V генов в популяции молекул определяет размер библиотеки и число клонов, необходимых для анализа. Так, в случае библиотек из иммунизированных животных достаточно получить 106 независимых рекомбинантов, чтобы среди них нашлись продуценты scFv, специфично связывающие использованный для иммунизации антиген. Для библиотек из неиммуннных животных и В-лимфоцитов в качестве источника РНК комбинаторные библиотеки должны содержать
о
по крайней мере 10 индивидуальных независимых рекомбинантов, чтобы воссоздать исходное разнообразие детерминант антител [Gavilondo, 2000]. В создании столь больших библиотек определяющей является эффективность всех этапов - от выделения РНК до трансформации бактерий. Не менее важен и способ отбора клонов. Анализировать библиотеку методом реплик практически невозможно при наличии столь большого числа колоний. Технология фагового дисплея разрешила эту проблемму.
1.3.1. МЕТОД ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ.
Parmley и Smith [Parmley, 1988] показали, что пептиды могут быть представлены на поверхности фаговой частицы в составе одного из белков капсида, причем при этом сохраняется способность пептида связываться с антителами. McCafferty с соавт. [McCafferty, 1990] показал, что и обратная ситуация может быть реализована -
17 вариабельные фрагменты антител, представленные на поверхности нитевидного фага,
могут с высокой специфичностью связываться со своим антигеном.
Метод фагового дисплея основан на клонировании генов олиго- и полипептидов для экспрессии в составе белка оболочки бактериофагов. Экспонированный на поверхности фаговой частицы белок либо пептид имеет возможность взаимодействовать с лигандом (рецептором) in vitro. Это позволяет проводить несколько раундов аффинного обогащения целевых молекул, представленных на фаговых частицах, из сложной смеси, в частности из комбинаторных библиотек антител (рис.4.). Таким образом, появилась возможность работать с библиотеками очень большого размера.
Библиотека миниантител
Антиген
О О
Элюция
Амплификация
ффинных клонов в
клетках E.coli
Рис.4. Схема проведения аффинной селекции библиотеки scFv фрагментов мышиных антител.
В последнее время этот метод получил существенное развитие, поскольку он имеет много положительных черт: удобство и относительная простота, возможность получать хорошо воспроизводимые результаты, а также видоизменять метод в зависимости от задачи. Эти качества позволили методу фагового дисплея получить широкое распространение. Кроме того, метод фагового дисплея позволяет анализировать значительно большее количество вариантов представляемых структур, чем иные системы,

Получить работу