4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ТХДД - тетрахлордибензо-пара-диоксин
AhR — (aromatic hydrocarbon reception) арил-углеводородный рецептор
АТФ - аденозинтрифосфорная кислота
ДД - дибензодиоксины
ДЛМ - доминантные летальные мутации
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДФ - дибензофураны
ЛД50- среднесмертельная доза, вызывающая гибель 50% животных
МДА - малоновый диальдегид
м-РНК - матричные рибонуклеиновые кислоты
ОИДЛ - общая индуцированная доминантная летальность
ПОЛ - перекисное окисление липидов ПХБ - полихлорированные бифенилы ПХДД - полихлорированные дибензодиоксины ПХДФ - полихлорированные дибензофураны
5 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Среди загрязнителей окружающей среды техногенного происхождения большую опасность представляют диоксины, которые поступают в биосферу в виде микропримесей с продукцией или отходами многочисленных технологий. Диоксины - это обобщенное название большой группы полихлорированных дибензодиоксинов (ПХДЦ), полихлорированных дибензофуранов (ПХДФ), которые представляют собой гетероциклические полихлорированные соединения с очень близкими химическими свойствами. Самый известный, изученный и наиболее токсичный - 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин (2,3,7,8-ТХДД), по отношению к которому часто применяется термин «диоксин» (Л.А. Федоров, Б.Ф. Мясоедов, 1990; J. McKiney et al., 1982).
Диоксины - универсальные клеточные яды, поражают все виды живых существ, чрезвычайно устойчивы к химическому и биологическому разложению, сохраняются в окружающей среде в течение десятков лет и легко переносятся по пищевой цепочке (Л.А. Федоров, 1993). Основная опасность их заключается не столько в острой токсичности, сколько в хроническом отравлении малыми дозами, кумулятивном действии и способности вызывать отдаленные последствия (Safe S., 1990).
Однако отдаленные последствия диоксинов оценены неоднозначно. Недостаточно работ по их эмбриотоксическому, тератогенному и гонадотоксическому действиям в условиях хронического отравления, противоречивы данные о мутагенности 2,3,7,8-ТХДД. В доступной литературе отсутствуют сведения о влиянии лечебных средств на эти процессы.
На основании известных данных по токсикологии диоксинов и патогенеза их отравлений во ВНИВИ на протяжении ряда лет проводится поиск антидотов среди серосодержащих соединений, иммуностимуляторов, антиоксидантов, а также средств, регулирующих метаболические процессы и др. Из испытанных потенциальных антагонистов диоксина определенный
6
защитный эффект оказал димефосфон, пероральное введение которого повышало выживаемость животных при отравлении среднесмертельной дозой диоксина (Э.А. Галиев, 2000). В то же время не исследовано влияние димефосфона на воспроизводительную функцию животных при воздействии диоксина. Представляло интерес также сравнение его эффективности с препаратом, обладающим общепризнанным положительным действием на репродуктивную систему, в частности с витамином Е.
В последние годы во многих странах зарегистрировано снижение репродуктивной функции и неблагоприятное влияние на формирование половых органов плода у человека и животных (R. Sharpe, 1993). Не последнюю роль в этом играют диоксины, однако средства, способствующие повышению устойчивости воспроизводительной функции животных, отсутствуют и проблема их поиска является одной из важнейших в современной токсикологии.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение возможности лечения нарушений воспроизводительной функции животных при хроническом отравлении диоксином. В соответствии с целью исследования и государственным заданием «Проведение исследований по разработке и освоению в условиях производства методов и средств предупреждения и ликвидации последствий поражения животных экотоксикантами» (№ госрегистрации 01200202603), поставлены следующие задачи:
1. Изучить эмбриотоксическое, тератогенное, гонадотоксическое и мутагенное действия диоксина при многократном поступлении его с кормом в организм животных в малых дозах.
2. Определить возможность корригирующего действия димефосфона и витамина Е на эмбриотоксичность, тератогенность и гонадотоксичность диоксина в опытах на белых крысах и кроликах.
3. Изучить влияние димефосфона и витамина Е на гематологические и биохимические показатели у животных с нарушением
7 воспроизводительной функции при хроническом отравлении
диоксином.
4. Провести сравнительную оценку воздействия димефосфона и витамина Е на воспроизводительную функцию при отравлении животных диоксином.
Научная новизна. Впервые установлено снижение димефосфоном и витамином Е репродуктивной токсичности диоксина. Пероральное введение димефосфона и витамина Е уменьшает эмбриотоксичность, тератогенность и гонадотоксичность диоксина при хроническом воздействии его на животных. Выявлено более выраженное лечебное действие димефосфона по сравнению с витамином Е при отравлении животных диоксином.
Практическая ценность работы. Разработан способ снижения эмбриотоксичности, тератогенности и гонадотоксичности диоксина путем перорального введения димефосфона и витамина Е. Димефосфон может быть использован в дальнейших исследованиях как базовый препарат для коррекции нарушений воспроизводительной функции животных при отравлении диоксином.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Средства, снижающие токсическое действие диоксина на воспроизводительную функцию животных и их сравнительная оценка.
- Обоснование более высокой эффективности лечебного действия димефосфона по сравнению с витамином Е при отравлении животных диоксином.
Сведения об апробации работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на ежегодных сессиях Ученого совета ФГНУ ВНИВИ по рассмотрению отчетов (Казань, 2002 - 2004 гг), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2003); Всероссийской научно-
8
практической конференции «Актуальные проблемы агропромышленного
комплекса» (Казань, 2004); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии», посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ А.А.Полякова, М., 2004.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 112 стр., содержит 20 таблиц, иллюстрирована 14 рисунками, состоит из следующих разделов: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Список литературы включает 175 библиографических источников, в т.ч. 95 - на иностранном языке.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИОКСИНОВ
В последнее время к обширному перечню экологических опасностей, угрожающих цивилизации, добавилась еще одна - возможность общепланетарного загрязнения среды обитания диоксинами и диоксиноподобными соединениями, такими как фураны, полихлорбифенилы (ПХБ) и др. (ВОЗ, 1993).
Диоксины - это обобщенное название большой группы гетероциклических полихлорированных соединений с очень близкими химическими свойствами, основу которых составляют два ароматических кольца, связанных между собой двумя или одним кислородным мостиками. В зависимости от числа и расположения атомов хлора дибензодиоксинов (ДД) и дибензофуранов (ДФ) разделяют на моно-, ди- и т.д. до окта- изомеры, суммарное количество которых составляет 210, в т.ч. ПХДД - 75, из них только тетрахлордибензодиоксинов 22 изомера. Самый известный и изученный - 2,3,7,8-ТХДД, по отношению к которому часто применяется термин «диоксин», является наиболее токсичным из них (Федоров Л.А., (» Мясоедов Б.Ф., 1990; Exposito M. et al., 1980; McKiney J. et al., 1982).
Определенное патогенетическое значение имеют также бромированные и смешанные хлорбромпроизводные ДД и ДФ, общее число которых достигает 4600 (Сова Р.Е. и др., 1994).
В отличие от многих ксенобиотиков диоксины никогда не являлись целевой продукцией, не имеют полезных хозяйственных свойств и представляют собой типичные техногенные загрязнители окружающей среды. В ряде случаев они присутствуют в химических продуктах как нежелательная технологическая примесь.
Считается (Трегер Ю.А., Розанов В.Н., 1997), что основными источниками загрязнения окружающей среды диоксинами являются:
10
процессы хлорорганического синтеза, переработка и
применение его продукции в определенных условиях, некоторые процессы хлорирования органических веществ, пиролитическая переработка и сжигание хлорорганических соединений, синтез и применение три-, тетра-, пентахлорфенолов, полихлорпиро- катехинов и их производных, полихлорциклогексанов и др.; сжигание твердых бытовых отходов, особенно материалов на основе поливинилхлорида;
процессы хлорирования лигнинов при отбеливании целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности; хлорирование воды, содержащей фенольные вещества и лигнины;
высокотемпературные металлургические процессы (плавление меди и проката в электродуговых печах, получение магния, никеля и, возможно, других металлов из их хлоридов); газовые выбросы автотранспорта, использующего горючесмазочные материалы, содержащие присадки хлор- или броморганических соединений, а так же бензин с добавкой свинца при наличии дихлорэтанового уловителя. Перенос диоксинов от источников в объекты окружающей среды осуществляется, как правило, воздухом и водой, после чего они прочно адсорбируются почвой, концентрируясь в основном в верхних 15 см слоях почвы, мигрируя в литосфере. В РФ наиболее угрожаемыми по загрязнению диоксинами являются следующие территории: Центральный, Уральский и Северо-Западный регионы, Среднее Поволжье, Приморский край, Центральный черноземный район (Порядин А.Ф., 1997).
В бывшем СССР толчком к снятию секретности с исследований по диоксинам послужила экологическая катастрофа в г. Уфе, когда с территории ПО «Химпром» в ноябре 1989 г. в окружающую среду было сброшено
11
несколько сотен тон диоксинсодержащего фенола, что привело к заражению системы питьевого водоснабжения и массовым отравлениям населения (Вакар Н.Г. и др., 1998).
В г. Чапаевске Самарской области до 1987 г на Средне-Волжском заводе химикатов производили гексахлорциклогексан (линдан) и его производные. Данное предприятие отличается высокими выбросами в окружающую среду диоксинов (в период действия завода приблизительно 740 г/год). Средняя концентрация диоксинов в атмосферном воздухе в городе составляет 0,116 пг/м3 (ПДК - 0,5 пг/м3). В почвах города отмечается значительное количество диоксинов. В двухкилометровой зоне от химического завода среднее содержание диоксинов составляет 141,3 нг/кг.
У взрослого населения города среди прочих заболеваний достоверно выше число спонтанных выкидышей у беременных женщин - на 27,4%, чаще отмечается рождение детей с врожденными морфогенетическими нарушениями - энцефалопатия, анемии, врожденные аномалии развития. Данные сравнивали с соответствующими показателями по Самарской области и в целом по России (Ревич Б. и др., 1998; Revich В. et al., 2001).
1.2 ТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДИОКСИНОВ
Диоксины являются наиболее токсичными из синтетических ядов. В этом отношении они превосходят зарин, зоман, стрихнин, кураре и другие высокотоксичные вещества, уступая лишь ботулиническому и дифтерийному токсинам (Donnelly J. et al., 1985).
Токсичность диоксинов и диоксиноподобных токсикантов для лабораторных животных варьирует в весьма широких пределах и определяется количеством замещенных галогенами атомов водорода в молекулах и изомерным составом вещества. При этом наибольшей величиной этого показателя характеризуются тетрахлорированные соединения, из них наивысшей токсичностью обладает 2,3,7,8-ТХДД, ЛД50
12 )
которого для морских свинок составляет 0,6 - 2, обезьян — 70, мышей — 114 —
I
284, крыс - 22 - 60 мкг/кг (Schwetz G. et al., 1973; Vos J., 1974; McConnel E., 1978; ГалиевЭ.А., 2001).
На практике, для определения токсичности и нормирования структурных аналогов диоксина, используется идея суммирования токсического действия различных изомеров и веществ с помощью единого показателя — диоксинового эквивалента, для чего применяют международную систему I-TEF, а за основу берется токсичность 2,3,7,8-ТХДД (Куценко В.В. и др., 1997).
Однако Battershill J. (1994) из результатов собственных исследований сделал вывод, что подход, основанный на эквиваленте токсичности 2,3,7,8-ТХДД не всегда применим для оценки потенциального токсического действия смесей ПХБ, в частности при изучении репродуктивной функции (за исключением тератогенного действия у мышей и антиэстрогенных эффектов in vitro). ПХБ могут оказывать противоположное токсическое действие на репродуктивную функцию — вызывать эстрогеноподобные или антиэстрогенные эффекты. Автор приходит к выводу об отсутствии удовлетворительного метода оценки токсического действия ПХБ на репродуктивную функцию.
Высокую токсичность диоксинов связывают, в первую очередь, с повышенной липофильностью, исключительной стабильностью и способностью к накоплению в живых организмах, главным образом, в жировой ткани, печени, тимусе, кроветворных органах (Golor G., Yamashita К., 1993; Heinrich-Hirsch В. et al., 1993). Многие исследователи рассматривают печень как орган-мишень воздействия диоксинов, где происходит не только концентрация токсинов, но и активная их метаболизация. Гепатотрофные эффекты — одно из наиболее типичных проявлений действия диоксинов, в частности, фиброзные изменения, дегенерация паренхимы, явления, близкие к циррозу печени. Клинически это
13
представлено желтухой с явлениями острой атрофии печени (Селюжицкий
Г.В., Воробьева Л.В., 1993).
Обладая выраженными липотропными свойствами, диоксины легко преодолевают плацентарный барьер. Выделение их из организма млекопитающих происходит преимущественно через кишечник в виде фенольных метаболитов, а также с молоком. Период полувыведения 2,3,7,8-ТХДД у мышей составляет 15, крыс - 30, морских свинок — 30 - 94, обезьян — 455 суток, человека — 5 — 7 лет. Он также существенно различается у лактирующих и нелактирующих животных, например, у овец - 80 и 160 суток, соответственно. Основную дозу ягнята получают с молоком, она в 4 раза больше дозы, получаемой через плаценту. Наиболее активно через плаценту проникают низкохлорированные соединения, в частности, 2,3,7,8-ТХДД (Oiling M., Derks H., 1992). С грудным молоком у отдельных животных может выделяться до 10% суточной дозы диоксинов. Как и большинство хлорированных соединений, диоксины хорошо всасываются в желудочно-кишечном тракте, легких, а также через кожу.
Депонирование диоксинов в печени и жировой ткани пролонгирует эффект токсического действия. Беременность, лактация, голодание и холод, способствуя миграции диоксинов из депо, провоцируют токсическое действие этих соединений (Селюжицкий Г.В., Воробьева Л.В., 1993).
Результаты многих медицинских обследований людей, соприкасающихся с 2,3,7,8-ТХДД, свидетельствуют об угнетении гуморального и снижении реакций клеточного иммунитета. По своему характеру перечисленные эффекты подобны проявлениям иммунодефицита, развивающимся при СПИДе, но слабее выражены (Pokrovsky А.С., Tsyrlov I.B., 1990). Установлено, что проявления иммунотоксичности зачастую развиваются под влиянием меньших доз диоксинов, чем другие токсические эффекты. К этим проявлениям относят атрофию тимуса, сопровождающуюся разрушением незрелых тимоцитов коркового слоя. Возможно, имеет место
14 непосредственное токсическое воздействие диоксина на эти клетки. Его
результатом может явиться увеличение частоты случаев запрограммированной гибели или апоптоза тимоцитов, которое проявляется опосредуемой Са активируемой эндонуклеазной фрагментацией ДНК (Vos J. et al., 1974). На примере клеток гипокампа и астроглии показано, что 2,3,7,8-ТХДД в концентрации 10 нм и выше значительно повышает внутриклеточную концентрацию Са2+ (Henneman W. et al., 1993).
Упрощенный механизм воздействия диоксинов на организм таков. Они присоединяются к тем рецепторам клеток, которые предназначены для гормонов и энзимов, в результате чего блокируется нормальная функция клеток, в том числе и ДНК.
Под влиянием диоксина в клетке исчерпываются запасы высокочувствительных к окислителям природных антимутагенных и антиканцерогенных агентов (витамины А, Вь С), некоторых гормонов; разрушаются биомембраны, нарушаются функции ферментов. Таким образом, незначительные изменения приводят к лавинообразному процессу старения и гибели клетки. После этого неизмененные молекулы диоксина переносятся в другие, еще функционирующие клетки и запускают тот же цикл метаболических процессов (Фокин А.В., Коломиец А.Ф., 1992).
Полагают, что повреждение тканевых и клеточных структур, при попадании диоксина в организм млекопитающих, связано с высокой липофильностью диоксина и его аналогов. Это свойство обеспечивает сравнительно быстрое преодоление клеточных и внутриклеточных мембран, проникновение в цитоплазму, а затем и в ядро клетки (Poland A., Kimbrough R., 1984).
Предполагают также, что токсические свойства диоксина проявляются и вследствие специфики строения самой молекулы вещества, которое дает возможность эффективно взаимодействовать с субстратами клеток, вызывая нарушения их структуры и функций, а также активно
15
индуцировать в мембранах ферментативные окислительные процессы,
приводящие к образованию высокотоксичных радикалов самих субстратов (Fisher A., 1978; Cantoni M, 1991). Об этом косвенно свидетельствуют данные о повреждающем действии диоксина на паренхиму печени, что в свою очередь качественно изменяет структуру ряда энзимов, локализованных в этом органе (Geger H. et al., 1987).
При пероральном поступлении ТХДД в организм млекопитающих более 87% вещества всасывается из желудочно-кишечного тракта. Независимо от характера поступления (однократно или многократно) вещество накапливается преимущественно в жировой ткани, коже и печени. Депонирование диоксина в жировой ткани объясняется его высокой липофильностью. Неизмененный токсикант выводится с фекалиями (Мишанов Л.Н., 1997).
Низкая скорость выведения ПХДД из организма связана с аномально высокими коэффициентами распределения в системе липид - вода (10б и выше). В тоже время, наличие стерических затруднений при хлорировании в положениях 2,3,7 или 8, по которым обычно происходит атака кислородом углеводородов подобного типа, также способствует замедлению процессов выведения токсиканта (Grassman J. et al., 1998).
Поскольку в желчи экспериментальных животных исходное соединение не выявляется, а присутствуют только его метаболиты, значит, возможен прямой переход токсиканта из крови в просвет кишечника (так называемый «обратный транспорт»). Установлена способность вещества к энтерогепатической рециркуляции. ТХДД может также экскретироваться с молоком, и проникать через плаценту.
До недавнего времени оставался открытым вопрос — патологические изменения в организме млекопитающих вызываются собственно диоксином или его метаболитами. Выделено и синтезировано два основных метаболита ТХДД у млекопитающих: 2-гидрокси-3,7,8-трихлордибензо-пара-диоксин и
16
2-гидрокси-1,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин, которые при
тестировании обнаружили в 1000 раз меньшую токсичность по сравнению с исходным соединением (Parkinson A., Safe S., 1987). Полностью продукты метаболизма диоксина не идентифицированы, хотя и предполагали, что в процессе его образуются высокотоксичные вещества (Shecter A., Constable J., 1989). Метаболизация происходит при участии монооксигеназной ферментной системы печени, осуществляющей первые этапы биотрансформации большинства гидрофобных ксенобиотиков.
Однако деградация диоксина в организме теплокровных незначительна: он выводится в основном неизменным, в виде комплексов не установленной пока природы (Волков B.C., Боев В.М., 1998). Образовавшиеся же метаболиты ТХДД конъюгируют с глюкуроновой кислотой и быстро экскрегируются с желчью и мочой, не внося существенного вклада в развитие токсических эффектов. Токсичность диоксина обусловлена, в основном, действием недеградированных молекул вещества.
Механизм токсического действия ТХДД до настоящего времени остается не выясненным. Ни одна из предлагаемых гипотез не дает исчерпывающего объяснения значительным межвидовым различиям острой токсичности диоксина, а также всему многообразию токсических проявлений.
Тем не менее, приоритетной из них является гипотеза «Ah-рецептора», дающая представление о действии диоксина на молекулярном уровне (Khasawneh I., Winefordner J., 1988). Согласно имеющимся данным, первым и необходимым условием в реализации токсического действия диоксина является связывание его с определенным белковым рецептором, который в неоккупированном состоянии локализуется в цитозоле клеток органов-мишеней (Poland A., Glover Е., 1976; 1979; Poland A., Knutson J., 1982). Из-за специфичности связывания с ароматическими углеводородами цитозольный рецептор получил название Ah-рецептора.
17
Рассмотренная особенность обуславливает сходство действия ТХДД с
действием гормонов, индуцируя, при этом, развитие необычайно широкого спектра ответов при участии многих AhR-независимых событий. Но, в отличие от быстро метаболизируемых гормонов, они оказывают аномально продолжительное гормоноподобное действие на развитие и функционирование многих систем организма. Эти уникальные характеристики экотоксикологии диоксиноподобных соединений позволяют отнести их к особому классу «гормоноподобных полифункциональных суперэкотоксикантов» (Румак B.C., 1993; Позняков СП. и др., 1993).
Комплекс, образующийся при взаимодействии ТХДД с цитозольным Ah-рецептором, проникая в ядро активирует определенный участок ДНК -Ah локус, где расположены гены, кодирующие синтез ферментов, метаболизирующих ароматические углеводороды. Диоксины запускают сложный каскад развития координированных клеточно-специфичных молекулярных и биохимических событий, приводящих к быстрому изменению состояния регуляторных систем клеток-мишеней, к индукции транскрипции различных генов Ah-локуса, к модуляции экспрессии многих других генов и их восприимчивости к регуляторным факторам. Одним из механизмов быстрого вмешательства диоксинов в процессы сигнальной трансдукции может быть повышение внутриклеточного уровня Са2+, активирующее многие Са-зависимые процессы. Например, активация Са-зависимой фосфолипазы А2 и протеинкиназы С может иметь следствием развитие каскада взаимозависимых событий в системе нормального функционирования вторичных мессенджеров — продуктов гидролиза мембранных фосфолипидов (арахидоновая кислота, диацилглицирин, инозитолтрифосфат) (Румак B.C., Позняков СП., 1997).
В отличие от других ядов диоксин не подавляет активность ферментов, а, напротив, стимулирует ее. Уже в концентрации порядка 10~10 моль/л диоксин индуцирует накопление в организме некоторых железосодержащих ферментов - гемопротеидов (выполняющих важные

 Часть из работы     Получить работу