СПИСОК СОКРАЩЕНИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ
LD5o - летальная доза, вызывающая гибель 50 % животных
АЕ - антитоксическая единица
АХС - антихолерогенная сыворотка
ВС - высокомолекулярные соединения
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография
ЕДзд - доза вакцины, защищающая 50% животных от гибели при заражении
вирулентным штаммом
ЕС — единицы связывания холерогена с сывороткой
ИА - индекс адгезии (%)
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛПС - липополисахарид
МИБП — медицинские иммунобиологические препараты
м.к. - микробные клетки
НС - низко молекулярные соединения
ОСО - отраслевой стандартный образец
РА - реакция агглютинации
РИД - реакция иммунодиффузии в геле
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с холерой большое значение придаётся профилактической вакцинации. В связи со значительными проявлениями этого заболевания в мире в последние годы, особенно в развивающихся странах, ВОЗ настоятельно рекомендует разработку, производство и использование вакцинных препаратов орального применения [182]. В России разработана, зарегистрирована и выпускается оральная химическая бивалентная таблетированная холерная вакцина, которая в 2001 году Приказом Минздрава России (№229 от 27.06.2001) включена в Национальный календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям, предусматривающим проведение вакцинации у лиц, выезжающих в неблагополучные по холере страны, и населения приграничных районов России в случае возникновения неблагоприятной по холере обстановке на сопредельной территории. Разработана и запатентована таблетированная вакцина против 0139 сероварианта холерного вибриона [13]. Таблетированная холерная вакцина разработана и производится в РосНИПЧИ «Микроб» с использованием методических подходов и оборудования, относящихся к 70-м годам XX столетия. Современный уровень биотехнологического производства препаратов, вводимых людям, требует использования и современных методических подходов к масштабируемой биосепарации, внедрения более совершенного оборудования и новых материалов, позволяющих с высокой эффективностью получать качественные вакцинные препараты. В связи с этим, проведение научных разработок, направленных на совершенствование технологии производства холерных вакцин и внедрение в практику, настоятельно необходимо.
Среди большого количества методов очистки и концентрирования препаратов: седиментации, флотации, электрокоагуляции, мембранной
фильтрации, одно из ведущих мест стали занимать методы с использованием ультрафильтрации на полых волокнах. При ультрафильтрации биомолекул образуются два раствора, один из которых обогащен растворённым веществом, что при соответствующем подборе мембран с определенным пределом исключения молекул позволяет получать в достаточно чистом виде конечный продукт [30]. Основными преимуществами методов, использования модулей с полыми волокнами, являются: возможность развёртывания большой площади фильтрации в сравнительно малом объёме, регенерация волокон обратным током жидкости в модулях, высокая химическая устойчивость волокон, позволяющая стерилизовать их современными дезинфектантами.
При глубинном культивировании холерного вибриона значительное количество О-антигена спонтанно освобождается в окружающую среду. [158], что позволяет получить его без применения химических методов экстракции из клеток [20]. Была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена с использованием ультрафильтрации на полых волокнах [11, 12, 14, 15], однако эксперименты проводились на малообъёмных установках, не масштабировались и не были внедрены в производство. Из большого количества технологических разработок по усовершенствованию производства холерных вакцин в производстве ограниченно используется метод диализа препарата О-антигена на плоских мембранах с применением мембранного модуля, разработанного в институте "Микроб" [80]. Однако эти модули имеют невысокую площадь фильтрации (порядка 0,6 м), громоздки и использование их ограничено определённой номенклатурой мембран.
В настоящее время в ГП ВНИИ Полимерных волокон (г. Мытищи) разработан широкий ассортимент отечественных модулей на полых волокнах на основе ароматического полиамида (полисульфона) для процессов ультрафильтрации, диафильтрации и диализа с пределом исключения
молекул от 5 до 100 кДа. На основе указанных типов полых волокон созданы ультрафильтрационные аппараты с площадью фильтрации от 0,005 до 4м2. Одновременно ведутся работы по созданию специальных типов полых волокон: с пониженной сорбцией белков, бактерицидных, медицинского назначения (гемодиализ и гемофильтрация) [9].
Широкое использование в современной биотехнологической практике ультрафильтрационных модулей на полых волокнах и их высокая технологическая и экономическая эффективность заставили нас обратить внимание на возможность применения определённых классов данной аппаратуры для концентрирования и очистки высокомолекулярного О-антигена холерного вибриона, используемого для конструирования холерных вакцин. Необходимость повышения эффективности технологических процессов при снижении стоимости конечного продукта холерной вакцины и определило цель настоящей работы.
Цель работы заключается в разработке масштабируемой технологии получения и очистки компонента холерных химических вакцин - О-антигена холерного вибриона с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.
Задачи исследования:
1. Оценить состояние современных разработок по ультрафильтрации биологических жидкостей и определить оптимальное оборудование для выделения О-антигена холерного вибриона.
2- Разработать производственные установки для концентрирования и диализа биологических жидкостей на основе универсальных модулей на полых волокнах.
3- Разработать масштабируемую технологию концентрирования О-антигена холерного вибриона с использованием метода ультрафильтрации на полых волокнах при производстве холерных вакцин.
4. Оптимизировать и внедрить в технологию производства холерных вакцин метод ультрафильтрации на полых волокнах для диализа полуфабриката О-антигена.
5- Изучить в сравнительном аспекте, иммунологические и физико-химические свойства препаратов О-антигена, полученные традиционным способом и с помощью метода ультрафильтрации.
6- Изучить динамику и спектр ферментов холерного вибриона на этапах получения холерной вакцины с помощью разработанной ультрафильтрационной технологии.
7- Определить технологичность и экономическую эффективность использования масштабных методов ультрафильтрации на полых волокнах в производстве холерных вакцин.
Научная новизна
Впервые изучены физико-химические и биохимические свойства растворов О-антигена холерного вибриона при масштабируемых процессах ультрафильтрации, диафильтрации и диализа. Впервые, на основе изучения коллоидной структуры и физико-химического состояния растворов О-антигена холерного вибриона, разработаны оптимальные режимы ультрафильтрации данного компонента холерных вакцин. Впервые даны адсорбционные характеристики препаратов О-антигена холерного вибриона в отношении различных фильтрующих основ полых волокон и определены параметры образования вторичного фильтрационного слоя на поверхности данных материалов. Определён композиционный состав концентрата О-антигена по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. Впервые изучена динамика качественного и количественного содержания ферментов холерного вибриона в процессе концентрирования, выделения и очистки О-антигена, а также в процессе формирования таблетированного препарата
вакцины. Новыми явились сведения о полноценности по иммунобиологическим свойствам О-антигена и холерной таблетированной вакцины, полученных в производственных условиях с использованием ультрафильтрации.
Практическая значимость
Разработана, смонтирована и введена в эксплуатацию установка с применением стандартных промышленных ультрафильтрационных модулей на полых волокнах для эффективного использования в технологиях производства медицинских иммунобиологических препаратов. Созданная универсальная ультрафильтрационная установка внедрена в производство сертифицированных препаратов - холерных вакцин. Использование концентрирования, диализа и диафильтрации на полых волокнах растворов О-антигена холерного вибриона позволило существенно снизить количество дорогостоящего сульфата аммония, применяемого для очистки О-антигена, проточной воды и электроэнергии, существенно уменьшить трудозатраты на осуществление данного этапа производства, а также повысить качество конечного продукта за счет получения более очищенной фракции О-антигена.
Внедрение метода диализа и диафильтрации О-антигена холерного вибриона на этапе его освобождения от сульфата аммония, позволяет, благодаря большой площади полых волокон в ультрафильтрационном волоконном аппарате существенно сократить время на проведение процесса диализа и исключить рутинные малоэффективные регламентные методы.
Образцы таблетированной холерной вакцины в количестве трех серий, полученных по новой технологии, прошли испытания в Национальном органе контроля МИБП - ГИСКе им. Л.А.Тарасевича, на основании результатов которых были составлены «Изменения №3 к регламенту производства №500-94 на вакцину холерную бивалентную химическую
10
таблетированную», утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» 21.11.2002 г, одобренные Ученым советом и согласованные директором ГИСК им. Л.А.Тарасевича 26.11.2002 г.
Разработанные технологии внедрены в производство, для чего составлены и утверждены стандартные операционные процедуры на каждом этапе использования нового оборудования.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Разработана, сконструирована и внедрена производственная установка из шести ультрафильтрационных половолоконных аппаратов для масштабируемого концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона, содержащей О-антиген.
2. На основании данных о физико-химических и биохимических свойствах растворов О-антигена предложена оптимальная схема ультрафильтрационного концентрирования культуральной жидкости холерного вибриона в 10 раз для последующего выделения препарата О-антигена.
3. Разработана и смонтирована установка для масштабируемой диализной диафильтрации раствора О-антигена после осаждения сульфатом аммония с использованием ультрафильтрационных аппаратов.
4. Препараты О-антигена, полученные по новой технологии, соответствуют требованиям действующей нормативной документации, обладают большей серологической активностью и в своем составе сохраняют набор ферментов холерного вибриона.
5. Использование ультрафильтрационного метода в производстве холерных вакцин технологично и экономически эффективно за счет уменьшения количества расходных материалов, снижения энерго- и трудозатрат.
11
6. Экспериментально-производственные серии вакцины, полученные с помощью ультрафильтрации, при контрольной проверке по показателям качества соответствовали действующим требованиям фармакопейной статьи предприятия и регламенту производства на «Вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную».
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на научно - практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); на научно -практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию основания кафедры общей гигиены и экологии Саратовского медицинского университета "Окружающая среда и здоровье" (Саратов, 2002); на VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону,2003 г.); на ежегодных итоговых научных конференциях в РНИПЧИ "Микроб" в 2000, 2002 и 2003 годах.
Диссертационная работа рассмотрена и одобрена на межлабораторной конференции в институте «Микроб».
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 опубликованных научных работах.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объём диссертации 145 страниц машинописного текста, включающего 15 рисунков 9 таблиц. Список литературы содержит 183 источника, в числе которых 98 отечественных.
12
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МАСШТАБИРУЕМОГО КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ АНТИГЕННЫХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Методологические основы баромембранного разделения биологических жидкостей
В процессе разделения растворов с помощью полупроницаемых мембран, если размеры пор меньше размеров макромолекул, через мембрану преимущественно проходит растворитель. При этом концентрация растворённого вещества в пограничном слое у поверхности мембраны увеличивается. Повышение концентрации происходит до тех пор, пока под действием возникающего градиента концентраций растворённого вещества между поверхностью мембраны и объёмом раствора не установится динамическое равновесие. Явление образования у поверхности мембран пограничного слоя, в котором концентрация растворённого вещества больше, чем в основном объёме раствора, получило название концентрационной поляризации [98, 117]. Влияние концентрационной поляризации на динамические характери-s стики мембран отрицательно, так как при этом вследствие увеличения осмотического давления раствора снижается движущая сила процесса разделения. Кроме этого возможно выпадение в осадок и осаждение на мембране трудно растворимых солей, гелеобразование высокомолекулярных соединений, что влечёт за собой чистку или замену мембраны [24].
При разделении растворов применяются ячейки с хлорсеребряными микроэлектродами, расположенными на строго определённом расстоянии, от поверхности мембраны. К недостаткам измерения концентрационной поляризации микроэлектродами относится влияние самих микроэлектродов на поток, сложность их изготовления и необходимость экранирования металлических частей. Указанных недостатков лишены оптические методы опреде-
13
ления концентрационной поляризации [24, 42]. Эти методы позволяют изучать поляризационный слой, не нарушая его структуры. Однако интерферо-метрический метод с применением оптических квантовых генераторов (лазеров) в случае сравнительно высокой концентрации разделяемого раствора не позволяет исследовать распределение в слое концентрационной поляризации вследствие искривления светового пучка при прохождении через раствор. Применение лазеров ограничено также при большом градиенте концентраций в тонком пограничном слое. Преимуществом оптических методов является высокая разрешающая способность и возможность визуального наблюдения за пограничным слоем [91, 170]. Одним из перспективных экспериментальных методов измерения концентрационной поляризации, основанных на исследовании массообмена на границе раздела фаз жидкость - твёрдое тело, является электродиффузионный метод [28, 53, 66, 92, 154]. Выбор того или иного метода зависит от ряда факторов: конструкции мембранного аппарата, свойств мембраны, стоимости готового продукта, производительности установки.
К основным методам снижения концентрационной поляризации можно отнести следующие. Турбулизация разделяемого раствора приводит к увеличению проницаемости и селективности мембраны вследствие снижения концентрации растворённых веществ в пограничном слое [29, 110]. При разделении растворов веществ с большой молекулярной массой применяют мембраны с порами большего диаметра, чем при разделении низкомолекулярных веществ, что приводит к необходимости использования больших скоростей конвективного потока для повышения скорости ультрафильтрации, а тем более и микрофильтрации. Для этого необходимо интенсивно перемешивать раствор или прокачивать его с большой скоростью над мембраной. Более рационально применять жестко закреплённые турбулизирующие вставки. Эти вставки состоят из центрального опорного стержня, на котором закреплены диски, лопасти, шары или различные проволочные спирали [32]. Концентра-
ционную поляризацию можно значительно снизить, создавая пульсирующий поток [87, 130]. Применяются аппараты с узкими каналами, где высокая удельная поверхность мембран позволяет иметь высокую производительность при небольших габаритных размерах аппарата. В них используют ламинарный режим движения разделяемого раствора [30, 34, 131, 132].
С повышением температуры разделяемого раствора уменьшается вязкость, увеличивается коэффициент диффузии растворённого вещества, снижается концентрационная поляризация. Однако, с повышением температуры сокращается срок службы полимерных мембран, что обусловлено существенным возрастанием скорости их гидролиза. При температуре 60-70 °С аце-татцеллюлозные мембраны необратимо теряют свои полупроницаемые свойства. Кроме того, при этом возможна коагуляция белковых компонентов вакцин и сывороток, разрушение термолабильных ферментов.
Если в разделяемом растворе находятся коллоидные частицы, то они, осаждаясь, снижают проницаемость мембраны. Коллоидные частицы, так же как и молекулы полиэлектролитов несут электрический заряд. Причём, при рН < 8 они обычно заряжены отрицательно, в этом случае мембрана с отрицательным зарядом будет отталкивать частицы. Такой же эффект можно получить, если к мембране подвести электрический заряд одного знака с зарядом частицы в растворе. Возможно также уменьшение концентрационной поляризации за счёт воздействия ультразвука на пограничный слой в процессах ультрафильтрации и микрофильтрации [67, 68].
При проведении мембранных процессов, в результате концентрационной поляризации, на поверхности мембраны образуется слой слаборастворимых солей (обратный осмос), гель (ультрафильтрация), осадок микрочастиц (микрофильтрация). Все факторы, влияющие на образование вышеперечисленных осадков, образующихся на поверхности мембраны, требуют предварительной очистки исходного раствора [44, 90, 149, 150]. Методы очистки мембран и методы предварительной очистки разделяемых растворов зависят
15
от степени и вида загрязнений исходного раствора, типа аппарата и мембранного процесса, требований к качеству фильтрата. Условно их можно разделить на механические, гидродинамические, физические и химические. [98, 157]. Перечисленные методы очистки мембран позволяют в той или иной мере восстановить их характеристики [26, 171, 176]. Селективность мембран зависит от термодинамических характеристик раствора, теплоты, гидратации ионов в растворе, заряда частиц. Селективность определяется соотношением размеров пор мембраны и гидратированных ионов растворённых веществ или частиц суспензии. Таким образом, силы взаимодействия разделяемых веществ с полимерными мембранами могут меняться в широких пределах. Слабое взаимодействие имеет место, например, при проницаемости через мембрану газа, которое в основном определяется диффузией. Этим объясняются небольшие отличия в скорости проницаемости различных газов через однотипные полимерные мембраны. Скорость же проницаемости через различные по свойствам полимеры, например политетрафторэтилен, полидеми-тилсилоксан, полиэтилен, различные эфиры целлюлозы, может отличаться на пять порядков [112, 131, 133, 174]. Такая большая разница в скорости проницаемости обусловлена различиями в подвижности и гибкости полимерных цепей, которые в свою очередь связаны с полярностью и размерами молекул, а задерживающая способность ультрафильтрационных мембран характеризуется номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ) [39, 95, 104, 178].
При концентрировании повышается осмотическое давление раствора, а следовательно снижается эффективная движущая сила процесса разделения; кроме того увеличивается вязкость, в результате чего уменьшается коэффициент массоотдачи. По этим причинам удельная производительность мембран может снизиться до столь малых значений, что использование баромем-бранных процессов становится нецелесообразным. Возможны и другие осложнения процесса разделения. Например, в обратном осмосе или ультра-
16
фильтрации рН смещается в сторону кислой или щелочной реакции, что ускоряет гидролиз полимерных мембран, тем самым возможно обезвоживание набухающих мембран, сопровождающееся необратимыми изменениями их структуры, а в конце - концентрирование в растворах ряда органических веществ, растворение самих полимерных мембран.
При достаточно высоких концентрациях при обратном осмосе на мембране возможно выпадение в осадок малорастворимых солей, а при ультрафильтрации высокомолекулярных соединений, образование гелеобразного слоя, что нарушает эффективную работу системы. [119, 136, 180]. А это значит, что в области высоких концентраций селективность и проницаемость мембран падает, происходит явление гидратации (сольватации) заключающейся в том, что ионы растворённого вещества окружены растворителем и двигаясь с некоторой его частью, вступают с ним во взаимодействие [41]. Молекулы воды, расположенные в непосредственной близости от ионов растворённых веществ, образуют гидратную оболочку для растворов с относительно невысокой концентрацией. Размер вторичной гидратной оболочки составляет 1,5-2,0 нм [72, 146], что соизмеримо с размерами пор мембран для обратного осмоса. Энергетический эффект гидратации довольно значителен > (примерно 300-4000 кДж/моль). Электрохимическое взаимодействие не единственная причина гидратации, последняя может быть обусловлена и химическими силами. Химическое взаимодействие преобладает в том случае, если центральная частица сильный комплексообразователь, ион с незаполненной электронной оболочкой. Для ионов, обладающих структурой инертного газа преобладает кулоновая составляющая сил взаимодействия, зависящая от кристаллографического радиуса иона и его заряда [33]. При расчёте концентраций, соответствующих границе полной гидратации, учитывается то, что с одной молекулой воды в первичной гидратной оболочке соединяется 3 молекулы воды вторичной оболочки [41, 89]. Проницаемость определяется также близостью концентрации к границе полной гидратации. Именно
17
на границе полной гидратации проницаемость высокоселективных мембран становится равной нулю независимо от рабочего давления. Для остальных мембран небольшая остаточная проницаемость наблюдается и за пределами границы полной гидратации, что объясняется наличием в этих мембранах определённого числа неселективных пор. Экспериментальными данными, как для бинарных так и для многокомпонентных растворов электролитов [115] установлено, что обратный осмос можно использовать для границы полной гидратации, которая является пределом обратноосмотического концентрирования водных растворов неорганических веществ. Однако приходится отметить, что при концентрациях, близких к границе полной гидратации, работа ацетатцеллюлозных мембран недопустима потому, что при этом происходит обезвоживание мембран. Необратимое ухудшение их свойств, обусловлено переходом воды из мембраны в гидратные оболочки ионов сильных электролитов, поскольку в растворе свободной воды уже нет. Анализ экспериментальных данных [29, 59, 60] позволяет сделать вывод о том, что в большинстве случаев обратный осмос можно эффективно использовать при концентрациях электролитов не превышающих 5-10 % для одновалентных солей, 10-15 % для двухвалентных солей и 15-20 % для многовалентных солей. Для растворов органических веществ этот интервал гораздо шире и зависит от размеров молекул вещества и характера его взаимодействия с мембраной [109].
Наложение электрического поля на баромембранные процессы существенно влияет на процесс переноса вещества через мембрану и, соответственно, на селективные свойства мембран [28, 118]. Наблюдаемые при этом эффекты зависят от типа разделяемой системы, структуры мембраны, вида подводимого к мембране электрического поля (постоянный и переменный ток) и других факторов. В процессе обратного осмоса ионы через мембрану проходят практически в эквимолекулярных соотношениях. Это означает, что разделить таким методом, например, многокомпонентную смесь электроли- |
