СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АД - артериальное давление
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГАМК — гамма-аминомасляная кислота
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ЛВ — лекарственное вещество
НПЛП - нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты
ОП — открытое поле
ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт
УДФ - уридин 5'-дифосфат
УДФГТ (UGT) - уридин 5'-дифосфат-глюкуронозилтрансфераза (Uridine 5'-
diphosphat Glucuronosyltransferase)
ЭПР - эндоштазматический ретикулум
ЭСР — эмоционально-стрессовая реакция
AUC — площадь под фармакокинетической кривой (площадь под кривой
«концентрация - время»)
AUCm - площадь под фармакокинетической кривой метаболита
С1 — общий или плазменный клиренс
Стах - максимальная концентрация лекарственного вещества/метаболита в
плазме крови
CYP - цитохром Р450 (Cytochrom P450)
MRT— среднее время пребывания лекарственного вещества/метаболита в
организме
SNP - единичный нуклеотидный полиморфизм (Single Nucleotide
Polymorphism)
SULT - сульфотрансфераза (Sulfotransferase)
UDPGA — уридин 5'-дифосфат-глюкуроновая кислота (Uridine 5'-diphosphat
Glucuronic Acid)
UGT-см.УДФГТ
б
V- время достижения максимальной концентрации лекарственного вещества/метаболита в плазме крови
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической фармакологии являются межиндивидуальные различия в действии лекарственных веществ (ЛВ), которые определяются генетическими факторами, а также факторами окружающей среды, наличием и характером заболеваний, состоянием центральной нервной системы и т.д. [57, 103, 203, 204].
Скорость выведения из организма лекарственных веществ, подвергающихся метаболизму, зависит от активности и содержания соответствующих ферментов в элиминирующих органах. У разных больных активность ферментов и их содержание в печени могут резко различаться, что, естественно, будет приводить к выраженным различиям в фармакокинетике ЛВ и как следствие — в их эффектах. Среди многих факторов, ответственных за межиндивидуальные различия в метаболизме, основное место занимают генетические факторы [103,168, 204,265].
Генетической детерминантой вариабельности метаболизма ЛВ является полиморфизм ферментов, обусловленный мутациями в генах, кодирующих белки, выполняющие функцию биологических катализаторов. По различиям в активности того или иного фермента биотрансформации, а следовательно, и в скорости метаболизма определенных ЛВ, выделяют индивидуумов: с «нормальной» скоростью метаболизма («экстенсивные» метаболизаторы); со сниженной скоростью биотрансформации («медленные» метаболизаторы); с повышенной скоростью метаболизма («быстрые» метаболизаторы). Прямым следствием медленного метаболизма ЛВ является резкое увеличение периода полувыведения, снижение клиренса, в результате чего происходит возрастание средних концентраций ЛВ в крови, как при однократном, так и при длительном приеме. В итоге, с одной стороны усиливается и пролонгируется терапевтический эффект препарата, а с другой — резко возрастает опасность побочных, токсических эффектов. Следствием повышения ферментативной
8
активности является недостаточная для достижения терапевтического эффекта концентрация препарата в крови. Таким образом, при создании схемы рационального дозирования лекарственных препаратов необходимо учитывать полиморфизм ферментов метаболизма и их фенотипические проявления [58, 218, 296]. В настоящее время существуют и широко применяются в клинической практике «маркерные» субстраты для типирования различных реакций биотрансформации ЛВ: окисления (антипирин, дебризохин, спартеин); ацетилирования (дапсон, сульфален); сульфатирования (нитрофенол) и т.д. [29, 57, 58, 220]. Однако, как показал анализ литературы, до сих пор отсутствует «маркер» процесса глюкуронирования (фермента уридиндифосфат(УДФ)-глюкуронозилтрансферазы) — важнейшего пути детоксикации ксенобиотиков в организме живых существ [280, 293].
Дефицит УДФ-глюкуронозилтрансферазы имеет наибольшее значение для клинической фармакологии среди наследственных ферментопатий. Физиологическое назначение УДФ-глюкуронозилтрансферазы -глюкуронирование билирубина с образованием диглюкуронида. В то же время УДФ-глюкуронозилтрансфераза задействована в конъюгировании ряда ЛВ (парацетамола, левомицетина, сульфаниламидных препаратов, опиатных анальгетиков и т.д.). При недостаточной активности фермента прием одного из указанных препаратов может привести к нарушению глюкуронирования билирубина и увеличению уровня непрямого билирубина в крови, что будет выражаться в возникновении желтухи [153, 157, 222,241, 282].
В ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН разработан препарат мексидол, который широко используется в настоящее время в медицинской практике [11, 15, 105]. В исследованиях Сариева А.К. и соавторов [99, 100] впервые было показано, что единственным путем метаболизма мексидола в организме человека является глюкуроноконъюгация. Причем, степень биотрансформации препарата у разных больных неодинакова. Это обстоятельство послужило основанием для дальнейшего изучения мексидола, как потенциального средства для типирования процесса
9
глюкуроноконъюгации.
Цель исследования — обоснование применения мексидола как «маркерного» средства для типирования реакции глюкуроноконъюгации.
Задачи исследования:
1. Воспроизвести метод экстракции и разработать высокочувствительную и селективную методику количественного определения мексидола и его метаболитов в биологическом материале с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
2. Изучить особенности антистрессорного действия мексидола у мышей инбредных линий BALB/C и C57BL/6.
3. Исследовать фармакокинетику и биотрансформацию мексидола у мышей инбредных линий BALB/C и C57BL/6.
4. Изучить кинетику экскреции мексидола и его глюкуроноконъюгированного метаболита у мышей инбредных линий BALB/C и C57BL/6 в зависимости от введенной дозы препарата.
5. Изучить кинетику экскреции мексидола и его глюкуроноконъюгированного метаболита у добровольцев казахской и русской популяций (пилотные исследования).
6. На основании проведенных фармакодинамических и фармакокинетических исследований обосновать применение оригинального препарата мексидол для типирования реакции глюкуроноконъюгации в эксперименте и клинике.
Научная новизна работы.
Впервые проведено комплексное фармакодинамическое и фармакокинетическое исследование мексидола (однократно, интрагастрально) на мышах инбредных линий BALB/C и C57BL/6 и выявлены межлинейные различия как в антистрессорном действии мексидола, так и в его биотрансформации. Показано, что мексидол в условиях приподнятого крестообразного лабиринта, темной/светлой камеры, открытого поля оказывает анксиолитическое действие у мышей BALB/C с «пассивным» фенотипом
10
поведения, не изменяя поведение «активных» мышей C57BL/6. В фармакокинетических исследованиях установлено, что важным путем метаболизма препарата в организме мышей является конъюгация с глюкуроновой кислотой и инбредные мыши С57В1/6 и BALB/C обладают разными фенотипами глюкуронирования, интенсивнее этот процесс протекает у мышей С57В1/6.
Впервые показано лимитирование процесса конъюгации мексидола с глюкуроновой кислотой у мышей линии С57В1/6 при применении препарата в диапазоне доз от 400 до 800 мг/кг, в отличие от мышей BALB/C. Таким образом, изучение кинетики экскреции мексидола и его глюкуроноконъюгата в зависимости от дозы позволяет опосредованно оценить насыщение фермента УДФ-глюкуронозилтрансферазы.
При сравнительном изучении кинетики экскреции мексидола и его глюкуроноконъюгата у добровольцев казахской и русской популяции (ограниченный контингент) выявлены отчетливые межэтнические различия в скорости экскреции неизмененного препарата и его конъюгированного метаболита. Установлено, что у русской популяции процесс глюкуроноконъюгации протекает значительно интенсивнее в сравнении с казахской популяцией.
Практическая значимость работы.
На основании результатов комплексного фармакодинамического и фармакокинетического исследования впервые обоснована возможность применения мексидола в качестве препарата типирования реакции глюкуроновой конъюгации, что определяет направление дальнейших исследований.
Мыши линии С57В1/6 и BALB/C могут быть использованы в качестве экспериментальной модели для исследования ЛВ в зависимости от фенотипа глюкуроноконъюгации.
С применением мексидола как «маркерного» препарата для типирования реакции глюкуроноконъюгации появляется возможность существенно
11 улучшить качество лечения больных.
Положения, вынесенные на защиту;
1. Воспроизведен и модифицирован метод экстракции мексидола и его метаболитов из биологического материала (плазма крови, моча). Разработана высокочувствительная методика количественного определения препарата и его метаболитов в биологическом субстрате с использованием ВЭЖХ.
2. Изучено действие мексидола у мышей инбредных линий BALB/C и C57BL/6 на различных моделях эмоционального стресса (приподнятый крестообразный лабиринт, темная/светлая камера, открытое поле). Выявлено, что препарат после однократного интрагастрального введения оказывает селективное анксиолитическое действие на мышей линии BALB/C - животных с «пассивным» фенотипом эмоционально-стрессовой реакции, не изменяя поведение мышей линии C57BL/6 с «активным» фенотипом эмоционально-стрессовой реакции.
3. При исследовании фармакокинетики мексидола в плазме крови мышей инбредных линий BALB/C и C57BL/6 зарегистрирован его дезалкилированный метаболит, в моче — глюкуроноконьюгированное производное. Установлено, что важным путем метаболизма мексидола является конъюгация с глюкуроновой кислотой. Показано, что мыши инбредных линий С57В1/6 и BALB/C обладают разными фенотипами глюкуронирования, интенсивнее этот процесс протекает у мышей С57В1/6.
4. В результате исследования кинетики экскреции мексидола и его конъюгированного метаболита у мышей линий С57В1/6 и BALB/C в зависимости от введенной дозы выявлено, что при применении в диапазоне доз от 400 до 800 мг/кг у мышей линии С57В1/6 не происходит дальнейшая глюкуроноконъюгация препарата. По всей вероятности, это связано с насыщением УДФ-глюкуронозилтрансферазы.
5. При сравнительном изучении кинетики экскреции мексидола и его глюкуроноконъюгата у добровольцев казахской и русской популяции
12
выявлены межэтнические различия в скорости экскреции неизмененного препарата и его конъюгированного продукта.
6. Установлено, что процесс образования глюкуроноконъюгата мексидола интенсивнее протекает у добровольцев русской популяции. Этот факт необходимо учитывать при создании схемы рационального дозирования мексидола в разных этнических группах.
7. Обосновано применение мексидола как препарата типирования реакции глюкуроновой конъюгации.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: II съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003 г.); X, XI, XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003, 2004, 2005 г.); XIX съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); Научно-практической конференции с международным участием «30 ЛЕТ. Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы» (Москва, 2004 г.); на VIII региональном собрании Европейской коллегии нейропсихофармакологии (European College of
Neuropsychopharmacology) (Москва, 2005 г.); на межлабораторной конференции лабораторий фармакокинетики и психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2005 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (3 статьи, 7 тезисов).
Связь исследования с проблемным планом фармакологической науки. Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой научно-исследовательских работ ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН «Изучение молекулярных и клеточных механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы, создание нейрохимических основ для разработки новых оригинальных нейротропных средств» (№ гос. регистрации 01.960.00.80.94.).
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение; обзор литературы; материалы и методы; 3 главы
13
результатов собственных исследований и их обсуждение; заключение; выводы; библиографический указатель, включающий работы на русском (133) и иностранных (170) языках; 57 таблиц; Л? рисунков. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста.
14 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Биотрансформация (метаболизм) лекарственных средств.
Человек ежедневно подвергается воздействию множества инородных химических веществ, называемых «ксенобиотиками». Ксенобиотики попадают в организм человека через легкие, кожу и желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) в составе примесей воздуха, пищи, напитков, лекарственных веществ (ЛВ). Некоторые ксенобиотики безвредны для организма человека, но многие могут вызывать биологические ответные реакции. Организм реагирует на ЛВ так же, как и на любой другой ксенобиотик. ЛВ становятся объектами различных механизмов воздействия со стороны организма. Это, как правило, приводит к нейтрализации и элиминации ЛВ. Некоторые легкорастворимые в воде ЛВ элиминируются почками в неизмененном виде, другие предварительно подвергаются воздействию ферментов, изменяющих их химическое строение. Таким образом, «метаболизм», или «биотрансформация», — это общее понятие, отражающее химические изменения, которым подвергаются ЛВ в организме. Чаще всего результатом метаболизма ЛВ является, с одной стороны, снижение растворимости в жирах (липофильности) и повышение растворимости в воде (гидрофильности), а с другой — изменение фармакологической активности лекарственного препарата [52,57,58,61,63].
Почечная экскреция играет кардинальную роль в выведении из организма лишь немногих лекарственных препаратов. Чаще всего эти препараты представляют собой «малые молекулы», либо они поляризованы за счет функциональных групп, полностью ионизированных при физиологических значениях рН. Большинство ЛВ лишены таких физико-химических свойств. Эти ЛВ обычно связаны с белками плазмы, плохо фильтруются в почечных клубочках и одновременно легко реабсорбируются в почечных канальцах за счет липофильных свойств последних. Система биотрансформации направлена на
15
повышение гидрофильности молекулы ЛВ, что способствует выведению его из организма с мочой. Иными словами, липофильные ксенобиотики превращаются в более полярные (гидрофильные) и, следовательно, легко экскретируемые вещества [50, 57,63].
Конечный результат метаболизма обычно заключается в снижении биологической активности, но возможны различные этапы этого процесса:
• фармакологически активное вещество превращается в фармакологически неактивное (характерно для большинства ЛВ);
• фармакологически активное вещество на первом этапе превращается в другое фармакологически активное вещество (активный метаболит);
• фармакологически неактивное ЛВ предварительно превращается в организме в фармакологически активное вещество (пролекарство) (например, сулиндак, квинаприл, примидон, циклофосфан, азатиоприн, набуметон и др.) [57, 63].
Клиническое значение могут иметь метаболиты, обладающие активностью сравнимой или более высокой, чем сам лекарственный препарат. К таким метаболитам можно отнести N-дезметильный метаболит имипрамина (дезимипрамин), N-метилированный 3-оксиметаболит диазепама (оксазепам), N-ацетильный метаболит новокаинамида (ацекаинид), морфин-6-глюкуронид [129]. Необходимо отметить, что эффективность и безопасность при применении Л В, имеющих активные метаболиты, зависят не только от фармакокинетики собственно препаратов, но и от фармакокинетики их активных метаболитов [57, 58,256].
В некоторых случаях побочное или токсическое действие ЛВ определяется, в основном, образованием токсичных метаболитов в результате их биотрансформации. Так, при метаболизме амидопирина образуется канцерогенное вещество диметилнитрозамин. Лидокаин при приеме внутрь образует в результате пресистемного метаболизма ксилидиды моноэтилглицина и глицина, обладающие
16
судорожной активностью. Этим же побочным действием обладает и дезметильный метаболит меперидина (нормеперидин). Токсические эффекты некоторых ЛВ с нитрогруппами (метронидазола, нитрофурантоина) определяются, в значительной мере, промежуточными продуктами метаболического восстановления NC^-rpynn. Гидроксилирование некоторых ароматических соединений и особенно образование промежуточных продуктов окисления (эпоксидов) приводит к образованию метаболитов с канцерогенной активностью [129].
Приведенные выше примеры активных и токсических метаболитов являются скорее исключениями, чем правилом. В большинстве случаев, как уже отмечалось, биотрансформация приводит к инактивации (детоксикации) ксенобиотиков [50, 129]. Кроме того, некоторые эндогенные метаболиты (в частности билирубин -конечный метаболит гема) образуются и выводятся из организма за счет реакций биотрансформации. Следует также отметить, что многие ферменты, связанные с метаболизмом ксенобиотиков участвуют в синтезе таких эндогенных субстратов как стероидные гормоны, холестерин, желчные кислоты [52].
Основные пути биотрансформации ЛВ условно делят на метаболические процессы I и II фазы:
• Реакции I фазы (несинтетические реакции).
I фаза метаболизма включает реакции: окисления, гидролиза и восстановления. В процессе этих реакций ЛВ переходят в более полярные (гидрофильные) соединения по сравнению с исходным веществом за счет введения или раскрытия «ключевых» функциональных групп (например, -ОН, -СООН, -SH, -NH2), что способствует выведению ксенобиотиков из организма напрямую или посредством конъюгирования с полярными кофакторами II фазы метаболизма. Основные классы ферментов, катализирующих реакции I фазы, представлены в таблице 1.
• Реакции II фазы (синтетические реакции).
Синтетические реакции представляют собой соединение (конъюгацию) ЛВ и/или его метаболитов с эндогенными веществами, в результате образуются полярные,
17
хорошо растворимые в воде конъюгаты, легко выводимые почками и с желчью (табл. 2). Для вступления в реакцию II фазы молекула должна обладать химически активным радикалом, к которому может присоединиться конъюгирующий субстрат. Активные радикалы имеются в молекуле ЛВ изначально, и тогда реакция конъюгации может осуществляться, минуя реакции I фазы, либо активные группировки приобретаются молекулой лекарства в реакциях I фазы [52, 57, 127, 129].
Таблица 1
Ферменты и реакции I фазы метаболизма (Eddershaw, Dickins, 2004 с дополнениями [172]).
Фермент Класс реакции Субстраты
Цитохром Р450 Окисление, восстановление Пропранолол, фенобарбитал, дигитоксин, атропин, фентанил, клозапин, тиопентал, лидокаин, ибупрофен, кодеин, амфетамин
Моноаминоксидаза Окисление Адреналин, фенилэтиламин, МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,5,6-тетрагидропиридин), суматриптан, золмитриптан, 5-гидрокситриптамин
Флавинмонооксигеназа Окисление Хлорпромазин, ранитидин, никотин
Алкогольдегидрогеназа Окисление Этанол, абакавир
Альдегиддегидрогеназа Окисление (восстановление) Этанол, абакавир
Ксантиноксидаза Окисление Метилксантины, 6-дезоксиацикловир
Эпоксидгидролаза Гидролиз Карбамазепин
Карбоксилэстераза и пептидаза Гидролиз Лидокаин, индометацин, фентанил, пилокарпин
Карбон ил реду ктаза Восстановление Галоперидол, бупроприон, нафимидон, варфарин, преднизолон |
